Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Тема: Медицинская экология микроорганизмов (продолжение): нормальная микрофлора тела человека. План занятия: 1. Качественный и количественный состав микрофлоры организма человека. 2. Методы определения состава микрофлоры тела человека. Дисбактериоз. 46 ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ: Сочетание микробных ассоциаций, встречающихся в организме человека, составляют его микрофлору. Нормальная микрофлора – это качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека. Микробные биоценозы, сформировавшиеся в различных полостях тела человека, в процессе эволюции в результате селекции наиболее приспособленных к условиям существования характеризуются относительным постоянством. Но на качественный и количественный состав микроорганизмов влияют многие факторы: возраст, пол, особенности питания, микробы окружающей среды, и в особенности, антибиотики и другие химико-терапевтические и иммунологические препараты, применяемые в лечебно-профилактических целях. Формирование состава микрофлоры регулируются антагонистическими и синергетическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов, а также контролируется физиологическими факторами макроорганизма. Микрофлора тела человека представлена постоянно находящимися микроорганизмами в той или иной полости (автохтонная или индигенная микрофлора) и случайной или факультативной (аллохтонной) флорой. К первой группе - облигатной или резидентной - относятся микробы, максимально приспособленные к существованию в организме человека - это сапрофиты и условно-патогенные виды. Основу нормальной микрофлоры человека составляют облигатно-анаэробные бактерии. Факультативная и транзиторная микрофлора является временной и необязательной. В ее состав входят также сапрофитные и условно-патогенные микроорганизмы. Иногда в организме здоровых людей могут встречаться патогенные микробы и вирусы. Естественной формой существования в природе любых микроорганизмов является иммобилизованное состояние, т.е.99,9% бактерий обитает в виде фиксированных к различным поверхностям микроколоний, заключенных в полисахаридный гликокаликс бактериального происхождения, который защищает микроорганизмы от других микробов, бактериофагов и прочих неблагоприятных факторов. Представители автохтонной микрофлоры в животном организме способны фиксироваться лишь к строго определенным рецепторам кожи и слизистых, образуя при этом биопленку, защищающую слизистые от колонизации другими микроорганизмами. Элементами, ответственными за специфическую адгезию, являются поверхностные структуры бактерий, содержащие лектины, которые комплементарны соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиальных клеток. Несмотря на определенную стабильность, состав автохтонной бактериальной популяции в биопленке может изменяться под влиянием разнообразных факторов (фармакологические препараты, промышленные яды, пестициды, радиация, стрессы, гормоны и т.п.). В тех случаях, когда воздействующие факторы по своей интенсивности превышают компенсаторные возможности микробной экосистемы, возникающие дисбиотические нарушения, могут стать пусковым механизмом развития и поддержания различных патологических состояний. В настоящее время существенно расширился спектр клинических синдромов и патологических состояний, патогенез которых может быть связан с изменением состава и функций нормальной микрофлоры (диарея, запоры, колиты, гастриты, дуодениты, язвенная болезнь, коагулопатии, гипо-и гипертензия, острая мезентериальная ишемия, гипо- и гиперхолинестеринемия, кариес, моче- и желчекаменная болезнь, злокачественные новообразования и др.). Некоторые представители нормальной микрофлоры человека относятся к условно-патогенным (стафилококки, эшерихии, бактероиды и др.). А поэтому при определенных условиях (снижение колонизационной резистентности, смена среды обитания, ослабление защитных сил организма и др.) становятся причиной эндогенных инфекций различной локализации. Микрофлора кожи. Кожа, особенно еѐ открытые части, обсеменены различными микробами. Микрофлора кожи складывается не только из микробов, находящихся на поверхности, но и в глубине кожи (волосяные мешочки, протоки сальных и потовых желѐз). На грязной коже многие микробы способны не только сохранять жизнеспособность, но и размножаться. На поверхности чистой кожи микроорганизмы быстро гибнут. Неповреждѐнные кожные покровы для большинства микроорганизмов, в том числе и патогенных, непроходимы. При нарушении же целостности кожных покровов, а также при снижении общей резистентности микроорганизма на коже могут возникать различные заболевания: гнойничковые элементы, инфицированные мацерации, вызванные бактериями, грибками, вирусами. Микрофлору кожи составляют микроорганизмы как постоянно живущие на ней, так и разнообразная заносная микрофлора, попадающая из внешней среды - из воды, воздуха, почвы, при соприкосновении с загрязнѐнными объектами внешней среды или полостями организма (рот, кишечник, полость носа и др.). 47 Преобладающим представителем кожной микрофлоры являются анаэробные пропионобактерии (преимущественно P. аcnes). Здесь же в значительных количествах присутствуют стафилококки, дифтероиды, грибы рода Candida. Микрофлора коньюктивы, как правило, по составу схожа с таковой кожи. Микрофлора полости рта разнообразна и многочисленна, поскольку в ротовой полости создаются благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов. Это щелочная реакция слюны, пищевые остатки, «термостатная» температура и влажность. Особенно много их локализуется в зубном налѐте, между зубами, в криптах и лакунах миндалин. В ротовой полости встречается более 300 видов микроорганизмов. Их можно разделить на постоянную (резидентную) и факультативную микрофлору. Более многочисленны анаэробы (бактероиды, пептококки, лептотрихии, фузобактерии, вейлонеллы). Резидентную группу составляют стрептококки (Str. salivarius, Str. mutans, Str. sanguis), непатогенные стафилококки, диплококки, коринебактерии, лактобациллы, вейлонеллы, трепонемы (Tr. Buccalis), дрожжеподобные грибы (Candida albicans), актиномицеты, микоплазмы, простейшие. Среди факультативных микроорганизмов встречаются энтеробактерии (роды Eseherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus), синегнойная палочка, спорообразующие - бациллы, клостридии, а также - пептострептококки и пептококки. Некоторое время в ротовой полости могут персистировать вибрионы, спирохеты, дифтерийная палочка, менингококки и др. В поддержании количественного и качественного постоянства нормальной микрофлоры полости рта главную роль играет слюна, обладающая антибактериальной активностью за счѐт содержания в ней ферментов (лизоцим, лактоферрин, пероксидаза, нуклеаза) и секреторных иммуноглобулинов. Индивидуальные колебания в составе микрофлоры полости рта зависят от возраста, гигиенических навыков, диеты, общей резистентности организма и резистентности слизистых оболочек, наличия дефектов зубов. Нормальная микрофлора полости рта обеспечивает еѐ защиту за счѐт конкуренции, антагонизма по отношению к патогенным микроорганизмам, таким как дифтерийный возбудитель, патогенные стафилококки и стрептококки, менингококки, условно-патогенные и патогенные грибы. В случае же нарушения микрофлоры, то есть возникновения дисбактериоза, патогенные и условно-патогенные микробы могут вызывать заболевания органов полости рта (кариес, парадонтоз, гингивит) или обеспечивать, так называемую, «нисходящую инфекцию» из полости рта в глотку, гортань, желудок, трахею, бронхи, лѐгкие. Микрофлора желудка бедна, поскольку большинство попадающих сюда микроорганизмов погибают под действием соляной кислоты желудочного сока. Однако при нарушении общего и местного гомеостаза в желудке могут появляться условно-патогенные микроорганизмы, которые способствуют возникновению гастритов и язвенной болезни (Helicobacter pyloris). В тонком кишечнике в норме микроорганизмы либо отсутствуют, либо их количество невелико. Из выяв- ляемых бактерий чаще обнаруживаются энтерококки, лактобактерии. Иногда высеваются сарцины, грибы. В толстом кишечнике регистрируется самая разнообразная по составу микрофлора. Биомасса микроорганизмов, заселяющих кишечник взрослого человека, составляет 2,5-3 кг и включает в себя до 450 видов. Нормальная микрофлора кишечника на 92-95% состоит из строго анаэробных видов, остальная часть - аэробы. В толстом кишечнике обнаруживаются следующие микроорганизмы: Анаэробные бактерии Грамотрицательные бактерии В. fundiliformis В. fragilis B.putidum и др. группа Veillonella Грамположительные бактерии Аэробные Грамотрицательные бактерии E.coli, Enterobacter, Citrobacter, klebsiella, Proteus, providentia, Pseudomonas Грамположительные бактерии Групп молочнокислых бактерий. Лактобактерии:L. fermentum, L. acidopnilis L. plantarum. Бифидобактерии: B.bifidum, B.longum, B.infantis, B.adolescentis, B.fermentum. Спороносные бактерии Вас. Subtillis, Вас. Вrevis, молочнокислые бактерии, дифтероиды, энтерококки. Группа спороносных бактерий Cl. perfringens, Cl. tetani Cl. botulinum Cl. sporogenes Группа шаровидных Peptostreptococcus Sp. Peptococcus Sp. Стафилококки и микрококки Candida Плесневые грибки Группа актиномицетов A. Israelii и др. 48 Кишечную микрофлору делят на облигатную и факультативную. К облигатным микробам относят буфидумбактерии, лактобактерии, бактероиды, кишечные палочки, энтерококки. К факультативным бактериям толстого кишечника относят сапрофитные, условно-патогенные, патогенные виды микробов. Представители нормальной микрофлоры, обладая высоким сродством к рецепторам энтероцитов и адгезируя с ними, формируют на поверхности слизистых защитный биослой, обеспечивающий колонизационную резистентность. Вместе с тем нормальная микрофлора способствует созреванию, особенного у детей раннего возраста, общего и местного иммунитета. Благодаря этому возрастает синтез иммуноглобулинов, комплемента, лизоцима. В процессе жизнедеятельности нормальной кишечной флоры выделяются органические кислоты и антибиотические вещества (колицины, лактолин, низин, стрептоцин), что препятствует размножению болезнетворных и гнилостных бактерий, а вместе с тем способствует снижению синтеза аммиака, токсических аминов, фенола, сероводорода, крезола и других токсических продуктов. Нормальная кишечная аутофлора принимает активное участие в процессах пищеварения, расщепляя поступившие из тонкого кишечника нерасщепленные белки, жиры и углеводы, а образующиеся при этом продукты, стимулируют перистальтику. Кишечная аутофлора принимает участие в биохимических процессах жирового и пигментного обмена, в частности, обмена холина, желчных и жирных кислот с образованием дезоксихолевой кислоты, копростерина, уробилина. Кишечная микрофлора благоприятно влияет на процессы всасывания и обмена веществ, утилизации кальция, железа, витамина Д. Она тормозит процессы декарбоксилирования пищевого гистидина, уменьшая тем самым синтез гистамина, а, следовательно, снижает аллергический потенциал энтерального питания для организма. Благодаря нормальной кишечной аутофлоре происходит эндогенный синтез многих витаминов (В1, В2, В5, В6, В, РР, К, С, Н) и незаменимых аминокислот, а также улучшается всасывание витаминов Д и Е, поступивших в организм с пищей. Микрофлора урогенитальной системы Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре в норме стерильны. На наружных половых органах мужчин и женщин обнаруживаются микобактерии смегмы (Mycobacterium smegmalis), непатогенные, иногда патогенные стафилококки, монококки, коринебактерии, микоплазмы, но пейзаж микроорганизмов однообразен, включает 2-3-4 вида. Уретра женщин обычно стерильна. Уретра мужчин имеет немногочисленную микрофлору: непатогенные кокки, сапрофиты, дрожжи. Микрофлора влагалища разнообразна, но непостоянна, зависит от многих причин, в том числе и от функции яичников, от возраста и общей резистентности организма, а также от уровня гликогена в клетках эпителия влагалища и pH влагалищного секрета. Сразу после рождения женщины происходит заселение влагалища лактобактериями, затем появляется кокковая флора. В зрелом возрасте, кроме лактобактерий и непатогенных кокков, появляются непатогенные стрептококки, клебсиеллы, бактероиды, анаэробы, микоплазмы, дрожжевые грибки, грибы Candida. Но основным и важнейшим представителем нормальной микрофлоры влагалища является Bac. vaginalis (палочка Додерлейна - лактобактерии). В некоторых случаях, в микрофлоре влагалища появляются и вызывают заболевания такие микробы как патогенные или условно-патогенные стафилококки, стрептококки, синегнойные палочки, клебсиеллы, хламидии, а также микробные ассоциации. Хламидии, вызывающие распространѐнное в настоящее время заболевание хламидиоз, не являются представителем нормальной микрофлоры влагалища. Поражения органов урогенитального аппарата, вызванные микоплазмами и хламидиями, сложны как в диагностике, так и в лечении. Трудности в диагностике вызваны особенностями строения и культивирования микроорганизмов Педиатрические аспекты Кишечник родившегося ребенка стерилен. Первым и основным источником микробной флоры для новорожденного ребенка является мать. Первичная микробная контаминация ребенка начинается за счет флоры влагалища уже во время родового акта при прохождении родовых путей матери. В дальнейшем в результате постоянного контакта с матерью аутофлора новорожденного начинает формироваться в основном за счет микрофлоры кишечника матери. Существует мнение, что основа для формирования микробной аутофлоры будущего ребенка закладывается еще во время беременности под влиянием иммунной системы матери. Считают, что в основе этого явления лежит механизм иммунологической толерантности, формирующийся у плода в результате проникновения через плаценту антигенов, характерных для микробного пейзажа матери. При грудном вскармливании к 4-6-7 дню появляются бифидобактерии, энтерококки, лактобактерии, но при искусственном вскармливании в кишечнике новорожденных быстро появляются стафилококки, стрептококки, сарцины, анаэробные бактерии, дрожжи, а также возникают изменения в составе нормальной микрофлоры кишечника. Например, бактероиды у детей с искусственным вскармливанием высеваются в большем количестве (10 10) и от 5 до 10% диарей вызываются этими микробами. Вейлонеллы у детей, находящихся на искусственном 49 вскармливании, также регистрируются чаще и в большем количестве (10 8 ), чем у взрослых (10 5 ) и иногда вызывают у них диспептические явления. Среди бифидобактерий у них чаще всего присутствуют виды В.adolescentis и B.longus, что характерно чаще всего для взрослых, а не B.biphidus и B.inphantis, как это бывает при грудном вскармливании. Следовательно, профилактика нарушений микробиоценоза новорожденного должна начинаться еще задолго до его рождения путем коррекции дисбактериоза родовых путей и кишечника, если таковые имеются у будущей матери. Цель занятия 1. Изучить нормальную микрофлору кожи, слизистых, различных полостей организма человека (рта, желудочно- кишечного тракта, мочеполовой системы), функции и механизмы действия микрофлоры на макроорганизм. 2. Изучить причины и условия формирования дисбактериозов, усвоить принципы получения эубиотиков (пробиотиков), показания к их применению. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Понятие о нормальной микрофлоре тела человека. 2. Характеристика нормальной микрофлоры кожи, слизистых, различных полостей организма человека. 3. Особенности взаимоотношений между отдельными микроорганизмами в системе микрофлоры организма человека (синергизм, антагонизм и др.). 4. Роль нормальной микрофлоры человека для его здоровья. 5. Факторы, оказывающие влияние на количественный и качественный состав микрофлоры организма человека. 6. Методы исследования нормальной микрофлоры организма человека, критерии оценки. 7. Причины и условия возникновения дисбактериозов. 8. Методы микробиологического изучения дисбактериозов, практическая значимость исследований. 9. Препараты для восстановления нормальной микрофлоры организма человека (эубиотики или пробиотики), принципы их получения, показания к применению. Уметь: 1. Освоить основные микробиологические методы изучения микрофлоры организма человека; 2. Освоить методику взятия материала для микробиологического исследования со слизистой рото-носоглотки и зева стерильным ватным тампоном; 3. проводить оценку качественного и количественного состава микрофлоры кожи, рото-носоглотки МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ: Для изучения состава микрофлоры организма используют бактериоскопический и бактериологический методы. В частности, для изучения микрофлоры полости рта готовят мазки из зубного налета и окрашивают по Граму и Бурри. Кроме этого, делают посевы на элективные среды для выделения и последующей идентификации чистой культуры бактерий. Микробиологическое исследование фекалий производится с целью определения состояния нормальной микрофлоры или для исключения дисбактериоза кишечника. Показания для него разнообразны - предоперационное обследование больных, кишечные инфекции неясной этиологии, дисфункции кишечника после антибиотикотерапии, уточнение диагноза и др. Забор свежих фекалий производят в стерильную взвешенную посуду и доставляют в лабораторию не позднее чем через 2 часа. Исследуемые фекалии помещают в тиогликолиевый буфер (способствующий сохранению как аэробной, так и анаэробной микрофлоры), затем готовят десятикратные разведения надосадочной жидкости в физиологическом растворе и высевают на элективные и дифференциально-диагностические среды, соответственно группам выделяемых микроорганизмов. Схема посева разведений на питательные среды. Разведение материала Посевная Доза С р е д ы Конечное Разведение 10 –1 10 –3 1,0 0,1 0,1 Селенитовый бульон Плоскирева, Левина Желточно-солевой агар, Сабуро - 10 -2 10 -4 50 10 –5 10 –7 10 –9 10 -11 (дети до 1 года) 0,5 0,1 0,5 0,5 0,1 0,1 0,5 1.0 0,1 0,1 1,0 0,1 1,0 0,1 Среда для клостридий (4,5 мл) Кровяной агар, Эндо Среда для лактобактерий (4,5мл) Среда для клостридий (4,5 мл) Кровяной агар, Эндо Анаэробный агар Среда для лактобактерий (4,5мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Анаэробный агар Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10 -4 10 -6 10 -6 10 -6 10 -8 10 -8 10 -8 10 -8 10 -9 10 -10 10 -10 10 -11 10 -12 10 –13 Посевы на факультативные анаэробы инкубируют в обычном термостате при 37 0 С, на дрожжеподобные грибы при 28-30 0 С, на бактероиды и лактобактерии в анаэростате при 37 0 С. Из выросших подозрительных колоний выделяют чистые культуры микроорганизмов, с целью их идентификации проводят изучение культуральных, морфологических, биохимических, патогенных и др. свойств. Идентификацию проводят как для выделенных патогенных и условно-патогенных возбудителей, так и для представителей нормальной микрофлоры кишечника. Количество обнаруженных микроорганизмов выражают в десятичных логарифмах, учитывая посевную дозу и разведения, из которых сделан высев. Для восстановления микроэкологического статуса больных с явлениями дисбиоза применяются биологические бактерийные препараты (пробиотики или эубиотики), приготовленные из штаммов живых бактерий аутохтонной флоры и/или продуктов их жизнедеятельности. Монокомпонентные сухие препараты бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин готовятся из одноименных бактерий, бактисубтил – из Bacillus cereus, бактиспорин – из B.subtilis. Поликомпонентные: бифилонг содержит два вида бифидумбактерий (В.bifidum, B.longum), ацилакт – три штамма лактобактерий, аципол – L.acidophilus и полисахарид кефирных грибков, линекс – B. acidophilus, B.infantis, Enterococcus faecalis, биоспорин - B.subtilis, B. lichiniformis, бификол – бифидобактерии и кишечная палочка, бифилакт – бифидобактерии и лактобактерии. Кроме лиофилизированных препаратов из бифидо- и лактобактерий в последние годы стали производить жидкие (закваски), а на их основе – лечебно-профилактические кисломолочные продукты. Считают, что эффективность таких препаратов выше по сравнению с сухими, поскольку содержат уже готовые биологически активные вещества и сами бактерии в них более активны. ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Таблицы с перечнем облигатной и факультативной микрофлоры полости рта и кишечника. 2. Рисунки микрофлоры зубного налета, окрашенных по Граму и Бурри. 3. Рост бифидумбактерий на среде Блоурокка 4. Препараты, применяемые для коррекции нормальной микрофлоры человека при дисбактериозах (сухие и жидкие эубиотики, кисломолочный бифидумбактерин и др.) ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Каждый студент готовит препарат из зубного налета. В бригаде из двух человек один окрашивает препарат по Граму, второй - по методу Бурри. 2. Каждый студент готовит препарат из чистой культуры бифидумбактерий, окрашивает по Граму и микроскопирует. 3. Бригада студентов из 3-4 человек производит посев «отпечатков» пальцев на пластинчатый агар в соответствующем секторе чашки Петри. 4. Бригада студентов из 3-4 человек производит посев материала из зева и носа на МПА и ЖСА в чашки Петри. 5. Студенты учитывают результаты посева воздуха по Коху и с помощью аппарата Кротова делают заключение о загрязненности исследованного воздуха. 6. Студенты учитывают результаты посева смывов с рук на среду Кес-слера и делают заключение о возможном загрязнении рук. 51 7. Студенты учитывают результат по определению микробного числа воды. 8. Студенты засевают Pr. vulgarus на обычный и карболовый агар. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ: 1. Какие микроорганизмы встречаются на коже, конъюнктиве? 2. Какие микроорганизмы выявляются в верхних дыхательных путях? 3. Перечислите шаровидных и извитых бактерий, встречающихся в полости рта? 4. Перечислите палочковидных микробов, встречающихся в полости рта. 5. Какие микроорганизмы встречаются в толстом кишечнике? 6. Какие микроорганизмы встречаются в тонком кишечнике? 7. Какую роль играют микроорганизмы толстого кишечника в физиологии человека? 8. Какие микроорганизмы из числа нормальной микрофлоры человека являются облигатными анаэробами? 9. Какие микроорганизмы из числа постоянных обитателей полости рта принимают участие в развитии кариеса, парадонтита и гингивита? 10.Какие причины могут приводить к возникновению дисбактериоза? 10. Какие микроорганизмы могут преобладать в случае развития дисбактериоза? 11. К каким последствиям может приводить дисфункция нормальной микрофлоры? 12. Какие вопросы изучает гнотобиология? 13. Какую функцию выполняет биопленка кишечника? 14. Какими методами изучается нормальная микрофлора человеческого организма 15. В каких случаях проводится обследование на дисбактериоз? 16. Какой материал берется для исследования при дисбактериозе кишечника? 17. Как проводится микробиологическое обследование при дисбактериозе? 18. Какие питательные среды применяются при обследовании на дисбактериоз? 19. Какие биопрепараты применяются для восстановления нормальной микрофлоры. 20. Каков принцип получения эубиотиков и пробиотиков? 21. Как получаются жидкие эубиотики, в чем их преимущество перед сухими? 22. Как получают кисло-молочный бифидумбактерин и лактобактерин , в каких случаях их следует применять? 23. Какие факторы влияют на количественный и качественный состав нормальной микрофлоры тела человека? 24. Какие взаимоотношения существуют между отдельными микроорганизмами в системе микрофлоры организма человека? 25. Какая взаимосвязь существует между нормальной микрофлорой организма человека и функционированием его иммунной системы? ЗАНЯТИЕ 10 |