Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Кафедра микробиологии Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов Под редакцией профессора Е.А.Федосова Часть 1. 2 ПРЕДИСЛОВИЕ Методические указания к практическим занятиям по микробиологии для студентов 2-го курса лечебного и педиатрического факультетов являются пособием, позволяющим студентам самостоятельно выполнять практическую работу. Все занятия строятся по единому плану из расчета 3-х академических часов на каждое занятие. Указываются темы, цель обучения (перечень знаний, умений, навыков, которые студент должен получить в итоге занятий), затем преподаватель даѐт пояснения к проведению практической работы, во- влекая при этом студентов в беседу и выясняя подготовленность группы к выполнению практического занятия. На практических занятиях студент, естественно, может встретиться с аппаратурой, оборудованием, материалами, которых он никогда не видел, поэтому самостоятельной работе должна предшествовать демонстрация. Контроль знаний осуществляется путем текущего опроса студентов во время занятий, а также на итоговых занятиях по результатам собеседования и компьютерного тестирования. Для этой цели на кафедре разработаны тесты, вопросы, ситуационные задачи, с которыми студенты имеют возможность предварительно ознакомиться. 3 ЗАНЯТИЕ №1 Темы: Предмет и задачи микробиологии. Правила работы в микробиологической лаборатории. Морфология бактерий. План занятия: 1. Правила организации и оборудования микробиологической лаборатории. 2. Правила работы в микробиологической лаборатории 3. Современные методы микроскопических исследований 4. Основные формы бактерий. 5. Приготовление бактериального мазка и простой метод окраски. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Медицинская микробиология занимается: изучением биологических свойств микробов и процессов их взаимодействия с организмом человека и окружающей средой; микробиологической диагностикой инфекционных заболеваний; разработкой методов индикации микробов во внешней среде; разработкой методов специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний; организацией производства бактерийных препаратов, антибиотиков, применяемых для диагностических, лечебных и профилактических целей. Студенты, работающие на кафедре микробиологии, обязаны выполнять правила, принятые в микробиологических лабораториях, где производится работа с заразным материалом. Одним из этапов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний является изучение морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов. Для этого используются микроскопические методы исследования. Цель занятия: 1. Ознакомление с принципами организации и оборудованием микробиологической лаборатории, с правилами работы в ней и основными методами микроскопии. 2. Освоить технику приготовления бактериального микропрепарата с последующей его окраской простым методом и научиться работать с иммерсионным объективом. 3. Изучить основные формы бактерий. Учебно-целевые задачи: Знать: 1.Принципы организации и назначение микробиологической лаборатории. 2.Правила работы в микробиологической лаборатории. 3.Типы современных микроскопов. Принципы работы электронного, люминесцентного, фазово-контрастного микроскопов, темнопольного конденсора. Основные характеристики ветового микроскопа. 4.Основные формы бактерий. Уметь: 1. Обеззараживать отработанный инфицированный материал и инфицированные объекты внешней среды. 1. Приготовить бактериальный мазок и производить простую окраску. 2. Проводить бактериоскопическое исследование с иммерсионной системой. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Структура и оборудование лаборатории В структуру любой микробиологической лаборатории входят: 1. Лабораторные комнаты и боксы для работы в асептических условиях; 2. Специально оборудованное помещение для стерилизации питательных сред, посуды, обеззараживания отработанного инфицированного материала; 3. Моечная, оборудованная для мытья посуды; 4 4.Помещение для приготовления питательных сред; 5.Виварий - помещение, предназначенное для содержания лабораторных животных. Стены должны быть окрашены масляной краской или покрыты кафельной плиткой, пол - линолеумом . Оснащение микробиологической лаборатории Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием: 1. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей. 2. Набором инструментов: бактериологическими петлями, микробиологическими шпателями, пинцетами, спиртовками и др. 3. Лабораторной посудой: пробирками, чашками Петри, флаконами, пипетками и др. 4. Приборами для стерилизации посуды, питательных сред и реактивов, рН-метрами, дистилляторами, центрифугами, техническими и аналитическими весами, аппаратурой для фильтрования и др. 5. Необходимыми средствами пожарной и химической безопасности (огнетушителями, дезинфицирующими растворами и т. д.). Оборудование рабочего места студента На рабочем столе должно быть все необходимое для работы: Микроскоп. Иммерсионное масло. Бактериологические петли. Спиртовка. Набор красок. Ванна и вода для промывки препаратов. Предметные стекла и салфетки для их протирания. Штатив для пробирок с культурами. Пинцет для извлечения стекол. Фильтровальная бумага для высушивания препаратов. Банка для отработанных стекол. Из личных вещей студента на рабочем месте допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делаются записи и зарисовки. Ничего лишнего (в том числе учебников и других книг) на рабочем столе не должно быть. Правила работы в микробиологической лаборатории Работа на кафедре микробиологии и в бактериологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, так как исследования проводятся с использованием культур патогенных микроорганизмов и заразного материала от больных и экспериментальных животных. Соблюдение этих правил необходимо для обеспечения не только личной безопасности, но и безопасности окружающих. 1. В лабораторию на практические занятия студенты должны являться в халатах и колпаках. 2. На лабораторные столы не разрешается класть портфели и другие личные вещи. На столах можно оставлять только записные тетради и руководства. 3. В лаборатории запрещается принимать пищу. 4. Отработанные препараты, пипетки и т.п. не класть на стол, а опускать в банку с дезинфицирующим раствором. 5. В случае попадания заразного материала на стол; руки, одежду и прочее, сообщить преподавателю и обработать зараженный объект дезинфицирующим раствором. 6. Содержать в чистоте свое рабочее место и производить уборку стола после занятий. 7. Бережно относиться к инвентарю (особенно к микроскопу), мебели лаборатории. Экономно расходовать краски, реактивы, фильтровальную бумагу. 8. Точно и аккуратно выполнять задания по практическим занятиям. По окончании работы необходимо: 1. Привести в порядок рабочее место. 2. Все использованные предметные стекла положить в банку с дезинфицирующим раствором. 3. Все засеянные пробирки и чашки сдать дежурному студенту для помещения в термостат. 4. Отработанный материал, загрязненный микробами, культуры бактерий, трупы зараженных животных сдать дежурному лаборанту для стерилизации. 5. Привести в порядок микроскоп. 5 6. Обработать руки дезинфицирующим раствором и тщательно вымыть их с мылом. Методы обеззараживания отработанного материала и контаминированных патогенными микробами объектов внешней среды Перед сбрасыванием патологического материала его подвергают дезинфекции. Использованные в работе предметные стекла, пипетки, стеклянные шпателя и металлические инструменты сразу же после работы опускают в стеклянные банки с дезинфицирующим раствором (1-2 % р-р хлорамина), которые должны находиться на рабочем столе. Посуда, в которой выращивались микроорганизмы (чашки, пробирки, флаконы), складываются в биксы или металлические бачки для обеззараживания путем кипячения или автоклавирования. Рабочее место по окончании работы подлежит уборке с применением дезинфицирующих средств. Используют более концентрированные растворы, чем для обработки рук - 5% р-р хлорамина или 5% р-р карболовой кислоты. Пинцетом берут кусочек ваты, смоченной дезраствором, и протирают поверхность стола на рабочем месте. Если разбилась пробирка с культурой, пролилась жидкость с заразным материалом или материал попал на одежду, обработку проводят немедленно, заливая это место дез. раствором или помещают ватный тампон, смоченный дезраствором. О случившемся сообщают преподавателю или заведующему лабораторией. Методы антисептической обработки рук лабораторных работников, контаминированных исследуемым материалом, культурами патогенных микробов По окончании работы руки обрабатывают дезинфицирующим раствором. Используют ватные тампоны или марлевые салфетки, смоченные в 70 0 спирте этиловом (1% хлорамин, 3% р-р лизола). Последовательность обработки: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства и ногтевые ложа, т. е. с учетом первоначальной обработки менее, а потом наиболее загрязненных мест. Вначале обрабатывают левую, а потом правую кисть руки. При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологическим материалом сразу же обрабатывают данный участок кожи, покрывая его на 3-5 мин. ватой, смоченной в дезрастворе. После обработки рук дезраствором их моют теплой водой с мылом. Микроорганизмы по степени опасности заражения работающих с ними лиц подразделяют на 4 группы I. Возбудитель чумы. II. Возбудители холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, сапа, Ку- лихорадки, бластомикоза, кокцидиоидоза, гистоплазмоза, ВИЧ, гепатиты В, С, Д, клещевой энцефалит. III. Возбудители коклюша, возвратного тифа, столбняка, ботулизма дифтерии, лепры, брюшного тифа, дизентерии, некоторых микозов, грипп, полиомиелит, гепатиты А, Е. IV. Возбудители пневмонии, пищевых токсикоинфекций, газовой гангрены, септицемий, кандидозов; микробы - показатели санитарного состояния объектов окружающей среды. Работу с культурами возбудителей 1 и 2 групп можно проводить только в специальных лабораториях строгого режима с разрешения органов здравоохранения России. Работа с возбудителями 3 и 4 групп проводится в соответствии с правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии в лабораториях СЭС и других бактериологических лабораториях. 6 Рис.1. Клеточные и неклеточные возбудители инфекционных заболеваний. Возбудителями инфекционных заболеваний могут быть представители клеточных неклеточных форм (рис.1). Неклеточные формы – это вирусы (царство Vira), вироиды, прионы. О вирусах подробнее будет сказано ниже. Вироиды открыты Т. О. Дайнером в 1972 г. Это сравнительно небольшие по размерам молекулы кольцевой суперспирализованной РНК, состоящие из немногих, 300—400 нуклеотидов. Они вызывают заболевания неко- торых растений, способны передаваться у них как обычные инфекционные вирусы. У человека и животных они не обнаружены. Прионы (от англ. proteinaceous infectious particle), что означает «белковоподобная инфекционная частица» - особый класс инфекционных агентов. Они представлены белковыми структурами, лишенными нуклеиновых кислот (например, Рг -s c, т.е . ск р епп и) . В их состав входит идентифицированный белок Рг – c (cells), кодируемый в геноме теплокровных. Прионы («нормальные») резистентны к действию нуклеаз, но инактивируются протеазами. Считают, что при мутации гена Рг-с начинает вырабатывться «ненормальный» прионовый белок с измененной пространственной конфигурацией, устойчивый к действию протеаз. Более того, измененные прионовые белки, контактируя с нормальными, в дальнейшем начинают их также менять с лавинообразной скоростью. Это способствует возникновению метаболических нарушений в клетках различных тканей, в частности, в центральной нервной системе. Прионовые белки выделены, как инфекционное начало скрэпи. куру, болезни Кройтцфельда-Якоба, спонгиоформной энцефалопатии крупного рогатого скота (коровье бешенство) и амиотрофического лейкоспонгиоза. Высказывается предположение, что прионовый белок является одновременно и индуктором и продуктом какого-то клеточного гена, ставшего автономным и ускользнувшего от регуляции, называя такой ген «взбесившимся». Что касается клеточных форм микроорганизмов, то различают три домена: ―Bacteria‖ (эубактерии), ―Archaea‖ (архебактерии) и ―Eucarya‖ (эукариоты). В домене «Bacteria» можно выделить следующие бактерии: - бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные; - бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные; - бактерии без клеточной стенки (класс Mollecutes — микоплазмы) Большинство грамотрицательных бактерий объединены в тип протеобактерии, основанный на сходстве по 7 рибосомной РНК («Proteobacteria» — от греческого бога Протеуса, принимавшего разнообразные формы). Они появились от общего фотосинтетического предка. Грамположительные бактерии, согласно изученным последовательностям рибосомной РНК, являются от- дельной филогенетической группой с двумя большими подотделами. Как и протеобактерии, эта группа метаболически разнообразная. Архебактерии отличаютсяот эубактерийпрежде всего тем, чтоне содержат пептидогликан в клеточной стенке. Имеют особые рибосомы и рибосомные РНК (рРНК). Термин «архебактерии» появился в 1977 г. Это одна из древних форм жизни, что и означает приставка «архе». Среди них нет возбудителей инфекционных болезней. Домен эукариот включает: 1) царство грибов (Fungi), 2) царство животных (Animalia) с подцарством простейших (Protozoo), 3) царство растений Plantae). Морфология бактерий и микроскопические методы исследований в микробиологии Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа мицелийобразующих форм, нитчатых бактерий и бактерий, образующих выросты. В соответствии с этим все бактерии по форме разделяются на следующие группы. Кокки (сферические) клетки могут быть одиночными (микрококки), парными (диплококки, например, нейссерия); тетракокки, располагающиеся по 4 в форме квадратов; пакетообразные кокки, располагающиеся «этажами» (сарцины); располагающиеся цепочками (стрептококки); образующие бесформенные скопления в виде виноградных гроздьев (стафилококки). Диаметр клеток – 1 – 2 мкм. Палочковидные бактерии – наиболее многочисленная группа, клетки представляют собой цилиндрические структуры. Размеры таких клеток сильно варьируют и могут быть от сотых долей до 5 – 10 мкм. Такие бактерии часто образуют пары или цепочки клеток (например, палочка сибирской язвы), но могут быть и одиночными (например, энтеробактерии). Извитые бактерии могут быть трех типов: вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы – бактерии, изогнутые в виде запятой (холерный вибрион, кампилобактер); спириллы имеют несколько крупных завитков (возбудитель возвратного сыпного тифа); спирохеты имеют вид тонких спиралевидных клеток со множеством завитков и петель (возбудитель сифилиса). Нитчатые бактерии – это цепочки (трихомы) из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток. Типичными представителями данных бактерий являются бактерии, окисляющие серу (Beggiatoa, Thiotrix). К мицелийобразующим бактериям относятся истинные актиномицеты, которые имеют сильно разветвленный мицелий. У нокардий и микобактерий мицелий является временным и возникает на определенных стадиях роста. У коринеподобных бактерий клетки имеют только тенденцию к ветвлению, но при росте культуры наблюдается плейоморфизм клеток. К бактериям, образующим выросты, относятся почкующиеся и стебельковые бактерии. Выросты – это выпячивания клеточного содержимого, окруженного клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной и не отделенные от клетки перегородкой. У некоторых бактерий выросты служат для размножения, у других – для прикрепления к субстрату или друг к другу. Кроме выше перечисленных, известны бактерии, которые не имеют клеточной стенки – микоплазмы. В культуре одного вида можно одновременно обнаружить сферические, эллипсовидные, грушевидные, дисковидные и даже разветвленные и неразветвленные нитчатые формы. Основными задачами микроскопии являются следующие: 1. Выявление микроорганизмов в различных материалах. 2. Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуемом образце. 3. Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.). 4. Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур. Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. Максимальная разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм (минимальное расстояние, при котором различимы два объекта). Общее увеличение складывается из произведения увеличений объектива и окуляра. Разрешение микроскопа можно увеличить за счет увеличения коэффициента преломления (иммерсии). В микроскопии применяют несколько иммерсионных систем: масляную, глицериновую, водную. При работе с микроскопом производят следующие действия: 8 С помощью зеркала и суховоздушного объектива малого увеличения (×8) добиваются наиболее интенсивного и равномерного освещения поля зрения. В центральной части столика микроскопа устанавливают препарат. Если дальнейшие исследования проводят с суховоздушным объективом (×40), то следует прикрыть диафрагму конденсора, перевести револьвер микроскопа на данное увеличение и опустить вниз тубус микроскопа с помощью микровинта до появления в поле зрения микроскопа исследуемых объектов. Если исследования проводятся с помощью иммерсионной системы (увеличение ×90), то в центр препарата следует нанести каплю иммерсионного масла, осторожно перевести объектив микроскопа вниз таким образом, чтобы дотронуться до предметного стекла. Затем, глядя в окуляр, поднять объектив вверх с помощью макровинта до появления в поле зрения микроорганизмов. С помощью микровинта добиваются максимальной четкости изображения. После просмотра всех препаратов следует снять масло с иммерсионного объектива, перевести микроскоп на малое увеличение, снять осветитель, опустить конденсор и тубус микроскопа вниз до упора. Хранить микроскоп следует в условиях, предотвращающих попадание пыли на линзы. Фазово-контрастная микроскопия представляет ценность в том, что с ее помощью можно наблюдать живые объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. С точки зрения увеличения никакого выигрыша не происходит, однако прозрачные объекты видны более четко, чем в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа. При отсутствии специального микроскопа обычный световой может быть оснащен специальным фазово-контрастным устройством, которое переводит фазовые изменения световых волн, которые проходят через объект, в амплитудные. В результате этого живые прозрачные объекты становятся контрастными и видными в поле зрения. С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д. Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света (эффект Тиндаля). При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если в исследуемом препарате содержатся клетки микроорганизмов, то косые лучи отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. На интенсивно черном фоне видны сияющие объекты. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор светлопольного микроскопа. При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру. Люминесцентная микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться под действием падающего на них света. Микроорганизмы, содержащие хлорофилл, витамин В 12 , алкалоиды, некоторые антибиотики, обладают первичной люминесценцией. Клетки микроорганизмов, в которых люминесценция слабо выражена или отсутствует, обрабатывают специальными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500 – 1:100000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку. В зависимости от химического состава клеточные структуры в разной степени адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и мертвыми клетками. Это позволяет использовать данный вид микроскопии для цитологических и иммунологических исследований, определения жизнедеятельности клеток, изучения микроорганизмов в почве, воде и т. д. Проведение люминесцентной микроскопии предполагает использование специальных микроскопов (например, МЛ-2). Разработанные на основе люминесцентной микроскопии иммунофлюоресцентные методы используются для визуализации иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии антигена изучаемого объекта и меченых флюоресцентными красителями антител. Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании световых или ультрафиолетовых лучей. Короткая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет различить объекты размером 0,5 – 1,0 нм (или большие чем 0,0002 мкм). В современных электронных микроскопах достигается увеличение на экране или пленке 5000 – 15000. Благодаря столь высокому разрешению становится возможным выявление деталей бактериальных структур. Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования. 9 Детали внутреннего строения выявляют на срезах бактерий, залитых в полимерный материал. Предварительно бактерии фиксируют и обрабатывают солями тяжелых металлов для получения необходимого контраста. Часть электронов проходит через образец, а другие рассеиваются компонентами структуры, в результате чего формируется изображение на экране или пленке. Электронный микроскоп, в котором изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют просвечивающим (или трансмиссионным). В сканирующем (растровом) микроскопе, как следует из названия, пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране. Сканирующий микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать сразу трехмерное изображение. При методе сколов (замораживании–оттаивании) проводят изучение внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота ( – 196 °С) в присутствии криопротектора и используют для получения сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнаженную внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной. Полученные реплики изучают в сканирующем электронном микроскопе. Помимо вышеуказанных разработаны также и другие методы визуализации: 1. Компъютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур; 2. Лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить четкое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. При сочетании с компъютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта. 3. Рентгеновская микроскопия, позитронная эмиссионная томография позволяют наблюдать объекты не в вакууме, а в обычных условиях. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий используют окрашенные (зафиксированные) или неокрашенные (нативный материал) препараты (мазки), приготовленные из естественных образцов либо из колоний выросших микроорганизмов. Процесс приготовления мазка состоит из трех этапов: а) собственно приготовление мазка: на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды. Затем на пламени горелки прокаливают петлю до красного каления, мизинцем правой руки открывают у огня пробирку с культурой, после остывания петли (она не должна плавить агар), берут ею небольшое количество культуры. После этого закрывают пробирку пробкой (через огонь) и эмульгируют бактерии в капле воды так, чтобы она помутнела. Затем прожигают петлю с избытком культуры, охлаждают ее и быстрыми круговыми движениями равномерно распределяют каплю на площади диаметром 15-25 мм и снова прожигают петлю. Для приготовления мазка методом отпечатка вырезают блок агара с выросшей колонией и помещают на покровное стекло бактериями вниз, резко прижимают блок к стеклу, после этого препарат сразу же фиксируют. б) высушивание препарата: препарат после высыхания должен быть равномерно тонким. Высушивание можно ускорить, держа препарат высоко над пламенем спиртовки. в) фиксация мазка: чаще всего осуществляется термически (фламбирование), т. е. над пламенем горелки. Хотя данный метод фиксации и является достаточно грубым, но сохраняет морфологию и отношение бактерий к красителям. Препарат проносят 2 – 4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до такой степени, чтобы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение). Фиксация мазка преследует следующие цели: а) инактивировать микроорганизмы; б) закрепить их на поверхности стекла и предотвратить их смывание при последующем окрашивании; в) повысить восприимчивость клеток к красителям. Для более детального изучения структуры клеток используют фиксирующие растворы, предовращающие ферментативный автолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их сшивания. Наиболее часто применяют формалин, спирты, жидкость Карнуа, ацетон и др. Мазки фиксируют, помещая в раствор фиксатора или нанося на мазок. Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на: позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя; кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками). Щелочные – связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами). 10 Основные цвета окрашивания могут быть следующими: а) красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго красный); б) фиолетовый (генциановый фиолетовый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый); в) синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий); г) зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый). Способность клеток воспринимать различные красители отражает их тинкториальные свойства. Это определяется структурой и составом клеточной стенки. Выделяют простые и сложные (дифференцирующие) методы окраски. Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне. Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативной клетке. Техника приготовления препарата заключается в следующем: Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок наносят 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1 – 2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, промокая его фильтровальной бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла и микроскопируют с иммерсионной системой. ДЕМОНСТРАЦИИ 1. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории. 2. Современные методы работы с иммерсионным объективом. 3. Устройство фазово-контрастного, электронного и люминесцентного микроскопов. 4. Микроскопия в темном поле. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1. Каждый студент микроскопирует с сухим и иммерсионным объективом готовые окрашенные мазки дрожжей, антракоида. стафилококка, стафилококка в крови. 2. Каждый студент готовит 3 мазка препарата из бактериальных культу ( сарцина, стафилококк, антракоид, кишечная палочка, вибрион) окрашивает фуксином Пфейффера, метиленовой синькой; микроскопирует с иммерсионным объективом, зарисовывает. 3. Освоить и записать в тетрадь: а) методы обеззараживания отработанного материала и контаминированных микробами объектов внешней среды; б) методы антисептической обработки рук, контаминированных исследуемым материалом, культурами патогенных микробов. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Какие задачи выполняет медицинская микробиология? 2. Какова структура и оснащение микробиологической лаборатории? 3. Почему необходимо выполнять правила работы в микробиологической лаборатории? В чем они заключаются? 4. Как определить увеличение микроскопа? 5. Что такое разрешающая способность микроскопа и от каких факторов она зависит? 6. Каковы преимущества иммерсионного объектива? 7. Изложите правила работы с иммерсионным объективом. 8. Из каких двух основных систем состоит электронный микроскоп? 9. Каковы основные отличия электронного микроскопа от светового? 10. Как готовят препараты для электронной микроскопии? 11. Основные принципы работы фазово-контрастного микроскопа. 12. Основные принципы работы люминесцентного микроскопа. 13. Принцип микроскопии в тѐмном поле. 11 14. Что лежит в основе выбора метода микроскопического исследования микропрепаратов? 15. Назовите основные формы шаровидных, палочковидных и извитых бактерий. 16. Из каких этапов состоит процесс приготовления мазка? 17. Для чего осуществляют фиксацию бактериального микропрепарата и как она проводится? 18. Что такое тинкториальные свойства бактерий? 19. Назовите основные краски, применяемые для окраски микропрепаратов 20. Для чего изучают тинкториальные свойства бактерий? 21. Что такое простая окраска? ЗАНЯТИЕ №2 |