Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Тема: Генетика микроорганизмов. План занятия: 1. Организация генетического аппарата у бактерий и вирусов. Генотип и фенотип. 2. Рекомбинации у бактерий: трансформация, трансдукция, конъюгация. 3. Модификации у бактерий и вирусов. 4. Мутации у бактерий и вирусов. Диссоциации. 5. Идентификация нуклеиновых кислот. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), молекулярная гибридизация. 6. Генная инженерия. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ: Исследования в области генетики микроорганизмов ознаменовались выдающимися открытиями. Установлены генетическая роль дезоксирибонуклеиновой кислоты, структура гена, расшифрован генетический код, выявлены многие закономерности процессов мутагенеза, создано новое направление в изучении генетики - генная 52 инженерия, с помощью которой можно производить пересадку генов из одной клетки в другую, что позво- ляет управлять наследственностью микроорганизмов. У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. Обычная бактериальная хромосома имеет молекулярную массу около 10 10 Д (5х10 6 пар оснований; размер генома человека составляет 2,9х10 9 пар оснований). Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии, впервые установленная методом радиоавтографии, для клеток E.coli составляет около 1 мм. В некоторых бактериях обнаруживают внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами. Они не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды физически либо не связаны с хромосомой (автономное состояние), либо встроены в бактериальную хромосому (интегрированное состояние). В автономном состоянии они самостоятельно реплицируются. Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 10 6 - 10 8 Д, несущие от 40 до 50 генов, несут 2 функции - регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного репликона. Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку, например образованию пилей (F-плазмиды), резистентности к а/б (R- плазмиды), выделению бактериоцинов (col-плазмида). Конъюгативные плазмиды - переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или близкородственными видами) в процессе конъюгации, обычно это относительно крупные F-, R-, Col-плазмиды (чаще выявляются у Гр- палочек). Неконъюгативные плазмиды - обычно характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр - микроорганизмов; небольшие по размерам могут присутствовать до 30 на 1 клетку. Неконъюгативные плазмиды тоже могут быть перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид. R-плазмиды обуславливают устойчивость к лекарственным препаратам, например к сульфаниламидам, стрептомицину, пенициллину, тетрациклину, либо устойчивость к тяжелым металлам (ртуть, никель, кадмий, кобальт). R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар из бумажных дисков. F-плазмиды - удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т. е. увеличивает их «плодовитость». Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Hfr-плазмиды (от англ. High frequency of recombitions - высокая частота рекомбинации). F-плазмида контролирует синтез половых ворсинок (sex или F pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Col-плазмиды - контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ белковой природы - бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов. Роль этих продуктов связана с формированием микробных сообществ (напрмер, в кишечнике человека бактериоцины E. coli вызывают гибель патогенных энтеробактерий). Бактериоциногения более выражена у Гр- микроорганизмов, но распространена и у Гр+ бактерий. Способность к синтезу бактериоцинов используют в эпидемиологических исследованиях, выявляя тип колицина, вырабатываемого патогенным видом (колицинотипирование), либо тип плазмиды (колициногенотипирование). Плазмиды патогенности - контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. В частности F-,R-,Col-плазмиды в интегрированном состоянии включают tox + транспозоны, кодирующие токсинообразование. Нередко tox + транспозоны кодируют синтез интактных протоксинов (например, дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом. Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков называют модификациями, они не находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре, после действия фактора и его прекращения, утрачиваются. Модификации проявляются в мире бактерий довольно часто, они могут возникать в популяции любого вида. У бактерий чаще наблюдаются морфологические модификации, приводящие к обратимым изменениям формы бактерий. Так, например, в старых культурах палочковидные бактерии изменяются до кокковидных, 53 подвижные бактерии теряют подвижность на средах с формалином, пигментообразующие бактерии временно утрачивают синтез пигмента (Serratia marcescens). Биохимические модификации - основу составляют индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных генов, контролируемых регуляторными генами. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, разрушающий данный антибиотик. К модификациям относят включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов в результате чего происходит смена их антигенов в ходе инфекционного заболевания. Модификации могут возникать под непосредственным действием а/б, например пенициллина. Образующиеся при этом L-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина (бледная трепонема, микобактерии туберкулеза, гонококки). Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменение окружающей среды, что позволяет им быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции на жизнеспособном уровне. Своеобразной формой изменчивости является R-S диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-колонии (rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью; второй тип - S-колонии (smooth - гладкий) - имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т. е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых (М) или карликовых (Д) колоний. Обратный переход R- в S- форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые в R-форме являются вирулентными. В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды. Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехромосомных факторов наследственности - умеренных фагов, либо неконъюгативных крупных плазмид, которые кодируют образование детерминантных полисахаридных звеньев липополисахарида у Гр- бактерий (имеющих значение для инвазивности у шигелл Зонне, и пенетрации шигелл Флекснера в эпителиальные клетки кишечника). Утеря этих плазмид приводит к образованию R-мутантов. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is- последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций. Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R- формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке. S-R-диссоциация усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например, дизентерия Зонне, эшерихиоза, вызванного E.coli О124 и др. Мутации и индукция новых мутаций мутагенами представляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических исследованиях. Во-первых, изменения, которые вызывает мутация в определенном гене, позволяют не только его идентифицировать, но и точно указать его место в хромосоме с помощью методов генетического картирования. Во-вторых, анализ мутантных штаммов, у которых нарушены различные этапы сложной цепи биохимических процессов, может вскрыть детали организации генетического и биохимического аппаратов. В-третьих, знание механизмов действия различных мутагенов может помочь в установлении корреляции между мутагенным и канцерогенным действием множества факторов окружающей среды (химические агенты, радиоактивное излучение и др.). Прокариотам не свойственно половое размножение. Рекомбинации у них осуществляются в результате проникновения в клетку реципиента не всей хромосомы донора, а только еѐ части, определенного фрагмента, что приводит к формированию мерозиготы и образованию одного рекомбинанта. Генотип такого рекомбинанта представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом донорской ДНК. Передача генетического материала от одних бактерий другим может осуществляться путѐм передачи чистой ДНК, что 54 может быть осуществлено в экспериментальных условиях (трансформация), либо фрагмент донорской ДНК переносится клетке-реципиенту с генетическим материалом умеренного фага (трансдукция), либо фрагменты ДНК донора передаются клетке реципиенту при непосредственном контакте клеток с участием по- ловых ворсинок (конъюгация). Способы генетического обмена, наряду с процессами мутирования генов, играют важную роль и обусловливают генетическую изменчивость, поставляющую материал для эволюции. Эти процессы также важны и для понимания биохимических и генетических механизмов функционирования бактерий, установления принципов строения и регуляции генов, а также расшифровки сложных процессов синтеза макромолекул, роста и деления клеток. Современная генетика интенсивно изучает молекулярно-генетические основы патогенности и иммуногенности микроорганизмов, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, распространением антибиотикорезистентных штаммов на фоне расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Большое внимание уделяется получению микроорганизмов со сниженной вирулентностью и сохраненной иммуногенностью - вакцинных штаммов. Название «вакцина» было дано Луи Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорагнизмов и их продуктов. Э. Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vaccinus - коровий), идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но маловирулентной человеку, т. е. данная вакцина была заимствована из природы. В России применяется другая вакцина, заимствованная у природы - сибиреязвенная вакцина СТИ, названная в честь сотрудников санитарно- технологического института г. Ленинграда, выделивших из почвы бескапсульный вариант сибирской язвы. Заслугой Луи Пастера была разработка принципов направленного получения аттенуированных вакцинных штаммов - селекция спонтанных мутантов с пониженной вирулентностью и сохраненными иммуногенными свойствами путем культивирования их в определенных условиях, пассирования через организм устойчивых к данной инфекции животных, через куриный эмбрион, через культуру клеток, после длительного действия бактериофага, воздействия ультрафиолетовых, рентгеновских лучей. Антирабическая вакцина получена Л. Пастером в результате 133 пассажей уличного вируса бешенства через мозг кроликов. Чумная вакцина EV получена Г. Жераром и Ж. Робиком при культивировании чумных бактерий при температуре 16 О С в течение 5 лет. Вакцина БЦЖ получена А. Кальметтом и Ш. Гереном при длительном культивировании микобактерий туберкулеза бычьего типа на глицериновом картофеле с желчью. Желчь явилась фактором, неблагоприятным для микобактерий, что привело к ослаблению вирулентности этого штамма. Бруцеллезная, туляремийная вакцины были получены при культивировании на картофельной среде в течение 5 лет. Вакцина против вируса желтой лихорадки была получена 238 пассажами на белых мышах. Вакцины против гриппа, кори, краснухи, полиомиелита также получены под воздействием различных факторов - азотистая кислота, гидроксиламин, бромзамещенные основания, повышение температуры, понижение рН среды, ультразвук, ультрафиолетовые лучи, нуклеазы и др. Современная биотехнология приготовления вакцин включает ряд этапов: накопление значительных количеств микробной массы или токсина на специальных питательных средах при оптимальных температурных и других условиях при постоянной аэрации, а для анаэробов при отсутствии кислорода. Большинство вакцин высушивают из замороженного состояния в глубоком вакууме - лиофильная сушка. Это обеспечивает их длительное хранение. Достижение генной инженерии: получена рекомбинантная гриппозная вакцина, вакцина против гепатита В. Благодаря переносам генов человека, кодирующих синтез инсулина, интерферона в геном E.coli налажено производство генно-инженерного инсулина, интерферона. Цель занятия: 1. Ознакомиться с особенностями генома бактериальной клетки, его отличия от генома эукариотической клетки; видами и формами изменчивости микроорганизмов; основными механизмами изменчивости микроорганизмов. 2. Изучить методы генетической диагностики инфекционных заболеваний. Ознакомиться с практическим применением достижений генной инженерии. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Особенности генома бактериальной клетки. 55 2. Отличия генома бактериальной клетки от генома эукариотов и вирусов. 3. Внехромосомные детерминанты наследственности - плазмиды, их функции. 4. Механизмы передачи генетического материала у бактерий (конъюгация, трансформация, трансдукция). 5. Достижения генной инженерии в получении новых лекарственных препаратов. 6. Механизмы, обусловливающие изменчивость микроорганизмов (адаптации, мутации, рекомбинации). 7. Методы генетической диагностики инфекционных заболеваний (ПЦР, молеклярная гибридизация). МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Идентификация нуклеиновых кислот. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях, когда в исследуемом матенриале ДНК или РНК мало или недостаточно для того, чтобы установить ее точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определенного участка ДНК. Вначале проводят термическое (t 95°) разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. После охлаждения в пробирку вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклиотидным последовательностямобеих цепочек, содержащие не менее 20-30 нуклеотидов. Затем в среду вносят термостабильную tag-полимеразу (по названию микроба Thermus aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей РНК. Процесс удвоения повторяется 20-30 раз, что позволяет получить около миллиона копий ДНК. Полученную нуклеиновую кислоту идентифицируют с помощью электрофореза в 1% геле с окраской фракций ДНК бромидом этидия, яркосветящимся в ултрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы анализируются. При проведении ПЦР используются специальные термостаты-циклеры, позволяющие быстро проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб. Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза). ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1. Постановка опыта конъюгации. Бригада студентов из трех-четырех человек используют культуру-донор Е. Coli Hfr pro+, urac +. Str S и культуру реципиент - Е coli F- pro¯, urac¯, his¯, str R В стерильной пробирке смешать 1 мл культуры донора и 1 мл культуры реципиента и инкубировать в термостате 40 мин., после чего высевают 1мл смеси на минимальную среду в чашке Петри. Минимальная среда для данного опыта содержит стрептомицин в концентрации, задерживающий рост культуры донора. На ней могут вырасти лишь рекомбинанты родительских культур в случае их образования при конъюгации. Контроли: посев культур донора и реципиента на минимальную среду с антибиотиком. В обоих случаях роста не будет. 2. Постановка опыта трансдукции. Бригада студентов из трех-четырех человек использует культуру Е coli Lac+ в качестве реципиента и трансдуцирующий фаг, полученный путѐм индукции из лизогенной культуры Е coli Lac+. В стерильную пробирку вносят 1 мл культуры реципиента и 1 мл трансдуцирующего фага. Смесь инкубируют в термостате 40 мин и делают высев на среду Эндо. Контроли: 1. Высев культуры реципиента на среду Эндо (рост бесцветных колоний). 2. Высев на среду Эндо лизогенной культуры Е coli Lac+, из которой после облучения получен трансдуцирующий фаг (рост вишнево-красных колоний). На среде Эндо засеянной из опытной смеси вырастают и красные и бесцветные колонии. 3. Постановка опыта трансформации. Бригада студентов из трех-четырех человек использует культуру стафилококка, чувствительную к пенициллину в качестве реципиента и раствор ДНК, выделенной из донорской культуры St. устойчивой к пенициллину. В стерильную пробирку вносят по 1мл культуры стафилококка чувствительного к пенициллину и раствор ДНК, полученный из культуры St резистентной к пенициллину, инкубируют 40 мин., после чего производят высев на среду с пенициллином. На чашке вырастают отдельные колонии резистентного к пенициллину стафилококка. Контроль: Высев культуры St реципиента на ту же среду (отсутствие роста колоний). 4. Опыт элиминации R -фактора. Бригада студентов из трех-четырех человек разводит бульонную культуру Е coli R+ до концентрации 10-4 и переносит 0,1мл разведенной культуры в 1мл бульона (контроль) и в 1мл бульона, к которому добавлен 50мкг/мл акридиновый оранжевый, ph в обеих пробирках 7,6. После 18-24 инкубации в термостате из каждой пробирки готовят разведения культуры 10 -4 и по 0.1мл высевают на чашки МПА содержащим по 200 мкг/мл тетрациклина и левомицетина,. Посевы ставят в термостат на сутки, после чего 56 подсчитывают количество колоний в контрольном и опытном посевах. Количество колоний, выросших на чашке, засеянной из опытной пробирки значительно меньше, чем в чашке, куда высеяна культура из контрольной пробирки, так как акридиновый оранжевый разрушает плазмидный R -фактор. 5. Каждый студент готовит препарат из культуры Pr.vulgarus, выросшей на обычном или карболовом агаре и сравнивает его с препаратом напарника. ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Генетическая карта хромосомы Е coli (схема). 2. Действие колицинов на индикаторную культуру Е coli. 3. Опыты конъюгации, трансформации, трансдукции, элиминации R.-фактора. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ. Что такое рекомбинации у бактерий? 2. Что такое трансформация? 3. Что такое трансдукция? 4. Что такое конъюгация? 5. Что является трансформирующим агентом ? 6. Какие плазмидные элементы бактерий Вы знаете ? 7. Какую роль играют плазмиды в жизнедеятельности бактерий ? 8. Каким образом можно изменить генотип бактерий ? 9. Какими биологическими свойствами обладают рекомбинанты ? 10. В чем заключается феномен диссоциации бактерий 7 11. Какими признаками характеризуются S-и R-формы бактерий? 12. Что такое мутация? 13. Каким образом можно изменить генотип бактерий? 14. Какие вы знаете мутагенные факторы? 15. Что такое модификация у бактерий? 16. Что такое минимальная среда и когда она используется? 17. Что такое ауксотроф? 18. Как получить ауксотрофы? 19. Каково значение фенотипической и генотипической изменчивости в экологии 20. микробов? 21. В каких областях микробиологии применяется адаптационная изменчивость микробов 22. Как проводится картирование хромосом у бактерий? 23. Каковы достижения генной инженерии в микробиологии? 24. Что лежит в основе генетических методов диагностики инфекционных заболеваний? 25. В чем заключается метод диагностики инфекционных заболеваний методом ПЦР? 26. В чем заключается метод диагностики инфекционных заболеваний методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот? ЗАНЯТИЕ №11 |