Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов

• Название: Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
• Дата: 04.05.2021
• Размер: 1.32 Mb.
• Имя файла: Микра методичка.pdf
• Тип: Методические указания; #201488
• страница: 5 из 14

Биологические методы (метод Фортнера). Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается 2 агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 суток). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
Влияние физических факторов на микроорганизмы.
Температура является наиболее значительным фактором, оказывающим влияние на жизнедеятельность микробов. Температура, необходимая для роста и размножения бактерий одного и того же вида варьирует в широких пределах. Различают температурный оптимум, минимум и максимум.
Температурный оптимум соответствует физиологической норме данного вида микробов, при которой размножение происходит быстро и интенсивно. Для большинства патогенных и условно-патогенных микробов температурный оптимум соответствует 37 0
С.
Температурный минимум соответствует температуре, при которой данный вид микроба не проявляет жизнедеятельность.
Температурный максимум - температура, при которой рост и размножение микробов прекращается, все процессы метаболизма снижаются и может наступить гибель.
В зависимости от температуры, оптимальной для жизнедеятельности, различают 3 группы микроорганизмов:

32 1)
психрофильные, холодолюбивые, размножающиеся при температуре ниже
20 0
С
(иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонады, вызывающие заболевания человека. Размножаясь в пищевых продуктах, они более вирулентны при низких температурах);
2) термофильные, оптимум развития которых лежит в пределах 55 0
С (в организме теплокровных не размножаются и медицинского значения не имеют);
3) мезофильные, активно размножаются при температуре 20-40 0
С, оптимум температуры развития для них
37 0
С (патогенные для человека бактерии).
Микроорганизмы хорошо выдерживают низкие температуры. На этом основано длительное сохранение бактерий в замороженном состоянии. Однако ниже температурного минимума проявляется повреждающее действие низких температур, обусловленное разрывом клеточной мембраны кристаллами льда и приостановкой метаболических процессов.
Низкая температура не оказывает бактерицидного действия на микроорганизмы, но приостанавливает вызываемые ими гнилостные и бродильные процессы. Это лежит в основе консервации субстратов (в частности, пищевых продуктов) холодом. Однако нужно учесть, что некоторые возбудители инфекционных заболеваний
(листерии, иерсении, легионеллы и др.) будучи психрофилами при низкой температуре получают селективное преимущество над другими бактериями. В этих условиях они начинают усиленно размножаться и достигают критической массы, достаточной для возникновения заболевания при попадании в организм человека.
Губительное действие высокой температуры (выше температурного максимума для каждой группы) используется при стерилизации. Стерилизация - обеспложивание - это процесс умерщвления на изделиях или в изделиях или удаление из объекта микроорганизмов всех видов, находящихся на всех стадиях развития, включая споры (термические и химические методы и средства). Для гибели вегетативных форм бактерий достаточно действия температуры 60 0
С в течение 20-30 мин; споры погибают при 170 0
С или при температуре 120 0
С пара под давлением (в автоклаве).
Асептика - условия и комплекс мероприятий, направленных против возможности попадания микроорганизмов в рану, ткани, органы, полости тела больного при хирургических операциях, перевязках, инструментальных исследованиях, а также на предотвращение микробного и другого загрязнения при получении стерильной продукции на всех этапах технологического процесса. Составной частью противоэпидемических и противоинфекционных мероприятий является также дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение конкретных патогенных микробов
Рост и размножение микробов происходит при наличии воды, необходимой для пассивного и активного транспорта питательных веществ в цитоплазму клетки. Снижение влажности (высушивание) приводит к переходу клетки в стадию покоя, а затем к гибели. Наименее устойчивыми к высушиванию являются патогенные микроорганизмы - менингококки, гонококки, трепонемы, бактерии коклюша, ортомиксо-, парамиксо- и герпес- вирусы. Микобактерии туберкулеза, вирус натуральной оспы, сальмонеллы, актиномицеты, грибы устойчивы к высушиванию. Особой устойчивостью к высушиванию обладают споры бактерий. Устойчивость к высушиванию повышается, если микробы предварительно замораживают. Для сохранения жизнеспособности и стабильности свойств микроорганизмов в производственных целях используется метод лиофильной сушки - высушивание из замороженного состояния под глубоким вакуумом.
В процессе лиофилизации производят: 1) предварительное замораживание материала при t -40-45 0
С в спиртовых ваннах в течение 30-40 мин; 2) осуществляют сушку из замороженного состояния в вакууме в сублимационных аппаратах в течение 24-28 часов.
Процесс высушивания имеет 2 фазы: сублимация льда при t ниже 0 0
С
и десорбцию - удаление части свободной и связанной воды при t выше 0 0
С.
Лиофилизацию используют для получения сухих препаратов, когда не происходит денатурации белков и не изменяется структура материала (антисыворотки, вакцины, сухая бактериальная масса). В лабораторных условиях лиофилизированные культуры микробов сохраняются в течение 10-20 лет, причем культура остается чистой и не подвергается мутациям.
Действие лучистой энергии на микроорганизмы. Солнечный свет, особенно его ультрафиолетовый и инфракрасный спектры, губительно действуют на вегетативные формы микробов в течение нескольких минут.
Инфракрасное излучение используется для стерилизации объектов, которая достигается за счет теплового воздействия температурой 300 0
С в течение 30 мин. Инфракрасные лучи оказывают воздействие на свободнорадикальные процессы, в результате чего нарушаются химические связи в молекулах микробной клетки.
Для дезинфекции воздуха помещений лечебно-профилактических учреждений и аптек широко используются ртутно-кварцевые и ртутно-увиолевые лампы, являющиеся источником ультрафиолетовых лучей.

33
При действии УФЛ с длиной волны 254 нм в дозе 1,5-5 мк Вт т/с на 1 см
2
при 30-ти минутной экспозиции погибают все вегетативные формы бактерий. Повреждающее действие УФ излучения вызвано повреждением
ДНК микробных клеток, приводящим к мутациям и гибели.
Ионизирующая радиация обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном микробов действием. Для стерилизации инструментов одноразового использования (игл, шприцев) используют гамма- излучение, источником которого являются радиоактивные изотопы
60
Со и
137
Сs в дозе1,5-2 MN.рад. Этим методом стерилизуют также системы переливания крови и шовный материал. Действие ультразвука в определенных частотах на микроорганизмы вызывает деполимеризацию органелл клетки, денатурацию входящих в их состав молекул в результате локального нагревания или повышения давления. Стерилизация объектов ультразвуком осуществляется на промышленных предприятиях, так как источником УЗ являются мощные генераторы. Стерилизации подвергаются жидкие среды, в которых убиваются не только вегетативные формы, но и споры.
Стерилизацию в ионизированной плазме, так же как и газовую стерилизацию, следует считать комбинированным физико-химическим воздействием.
Пастеризация - стерилизация при 65-70 0
С в течение 1 часа для уничтожения бесспоровых микроорганизмов (молоко освобождается от бруцелл, микобактерий туберкулеза, шигелл, сальмонелл, стафилококков). Хранят на холоде.
Тиндализация - дробная стерилизация материалов при 56-58 0
С в течение 1 часа 5-6 дней подряд.
Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови, витамины и др.).
Стерилизация фильтрованием - освобождение от микробов материала, который не может быть подвергнут нагреванию (сыворотка крови, ряд лекарств). Используются фильтры с очень мелкими порами, не пропускающими микробы: из фарфора (фильтр Шамберлана), каолина, асбестовых пластинок (фильтр Зейтца).
Фильтрование происходит под повышенным давлением, жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник или создается разрежение воздуха в приемнике и жидкость всасывается в него через фильтр. К фильтрующему прибору присоединяется нагнетающий или разрежающий насос. Прибор стерилизуют в автоклаве.
Стерилизацию сухим жаром осуществляют в сухожаровых шкафах (печь Пастера). Сухим жаром стерилизуют лабораторную посуду. Режим стерилизации: 160 0
С - 60 мин, 180 0
С - 15 мин, 200 0
С - 5 мин.
Жидкости, питательные среды, предметы из резины и синтетических материалов нельзя стерилизовать сухим жаром.
Стерилизации паром.
Существует 2 режима стерилизации:
1. Текучим паром в автоклаве или аппарате Коха при не завинченной крышке и открытым выпускном кране, когда антибактериальное действие пара проявляется в отношении вегетативных форм. Так стерилизуют среды с витаминами и углеводами, мочевиной, молоком, картофелем и желатиной. Для полного обеспложивания применяют дробную стерилизацию (при 100 0
С) 20-30 мин 3 дня.
2. Стерилизация паром под давлением в автоклаве - наиболее эффективный метод обеспложивания. При однократной обработке при 1-2 атм в течение 15-25 мин. погибают как вегетативные, так и споровые формы бактерий. Этим методом стерилизуют перевязочный материал, операционное белье, хирургические инструменты, лабораторную посуду, инфицированный материал, инъекционные растворы. Материал помещают в емкости (биксы). На дно бикса помещают прокладки из ткани, впитывающие влагу после стерилизации.
Стерильность материала сохраняется 3 суток.
Паром под давлением стерилизуют также и питательные среды, кроме сред, содержащих нативные белки, жидкости, приборы, имеющие резиновые части. Простые среды (МПА, МПБ) стерилизуют 20 мин при 120 0
С (1 атм). Среды, содержащие нативные белки и углеводы, при этой температуре нельзя стерилизовать, т. к. это легко изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100 0
С или при 112 0
С (0,5 атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют при 120 0
С (1 атм) в течение 20 мин.
При дезинфекции химическим методом применяют следующие дезинфицирующие вещества: хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин Б), окислители (перекись водорода, перманганат калия), фенолы, йод и йодофоры, соли тяжелых металлов, четвертичные аммониевые соединения, спирты, альдегиды, красители, кислоты.
Контроль стерилизации.
Для контроля используют различные тесты, представляющие чаще всего порошкообразные вещества, меняющие консистенцию или цвет при достижении определенной температуры стерилизуемого материала (бензойная кислота 121 0
С, антипирин - 113 0
С, резорцин - 110 0
С). В настоящее время используются бумажные индикаторы

34 стерилизации одноразового применения для контроля параметров режимов работы паровых и воздушных стерилизаторов. Бумажные полоски закладываются в разных местах со стерилизуемым материалом и после окончания цикла сверяют изменение окраски индикатора с эталоном. Если индикатор светлее эталона – стерилизуемые объекты подлежат повторной стерилизации.
Для экспресс-контроля концентраций рабочих растворов для дезинфекции также используются индикаторные полоски (Дезаконт-ПВ-01).
Цели занятия:
1. Изучить сущность дыхания бактерий, классифицировать микробы по типу дыхания.
2. Освоить методику посевов и выделения чистых культур аэробов и анаэробов.
3. Изучить характер влияния на микроорганизмы физических и химических факторов.
4. Освоить методы стерилизации и принцип работы автоклава и сухожарового шкафа.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Сущность дыхания бактерий. Классификация микробов по типу дыхания.
2. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления.
3. Принципы культивирования анаэробных бактерий.
4. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация.
5. Действие на микроорганизмы физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция.
Асептика и антисептика.
Уметь:
1. Готовить посуду к стерилизации в сухожаровом шкафу и автоклаве.
2. Описать культуральные свойства бактерий.
3. Освоить методику создания анаэробных условий.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Просматривая извлеченные из термостата чашки с пластинчатым агаром, засеянные в первый день исследования, обращают внимание на наличие колоний разных типов по форме, цвету, величине, консистенции.
Каждому виду микроба свойственен определенный характер колоний. Это помогает выбрать колонию искомого микроба и поставить диагноз заболевания. Снимают изолированную колонию петлей и пересевают на косой агар, а из остатка пересеянной колонии готовят микропрепарат и исследуют его, окрасив по Граму. После инкубации посева в термостате, на косом агаре вырастает чистая культура микроба.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1.
Бригада студентов учитывают пересевы бактериальных культур
2.
Каждый студент изучает и подробно описывает различные типы колоний, выросшие на чашках. Отсевает одну из колоний на косой агар а из остатка бактерий на. петле делает мазок, окрашивает по Граму и микроскопирует.
Результаты записывают в протокол.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Колонии на пластинчатом агаре в чашках Петри. Отсев одной колонии на косой агар.
2. Рассмотрение различных методов культивирования анаэробов: анаэростат, посев во Фортнеру, посев на среду Китт-Тароцци, столбик среды Вильсона-Блера, кровяной агар Виньяль-Вейона, использование щелочного раствора пирогалола.
3. Демонстрация аппаратуры для стерилизации: автоклавы, сухожаровые печи, электрический стерилизатор, фарфоровые свечи и фильтры Зейтца. Термостат и терморегуляторы, свертыватель Коха. Тесты контроля стерилизации.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Что называется стерилизацией?
2. Что такое дезинфекция?
3. Что такое асептика и антисептика?
4. Что такое пастеризация?

35 5. Какие условия стерилизации в автоклаве?
6. Какие условия стерилизации в сухожаровых печах Пастера?
7. Какие тесты контроля стерилизации вы знаете?
8. Что такое дробная стерилизация и в каких случаях к ней прибегают?
9. Почему в отдельных случаях при пересеве одной колонии получаем рост смеси бактерий?
10. Какие свойства необходимо учитывать при изучении колоний?
11. Как характеризуется рост бактерий на жидких и полужидких питательных средах?
12. В чем сущность аэробного типа окисления?
13. В чем сущность анаэробного типа окисления?
14. Какие среды применяют для культивирования анаэробов?
15. Какие существуют методы культивирования анаэробов?
16. Какой способ чаще всего применяется для стерилизации стеклянной лабораторной посуды?
17. Как стерилизуются дифференциално-диагностические среды, содержащие углеводы?
18. Как стерилизуют сывороточные питательные среды?
19. Как стерилизуют простые питательные среды?
20. Какие существуют методы выращивания облигатных анаэробов?
21. Какие бактерии называют микроаэрофилами?
22. Какие бактерии называют психрофилами, мезофилами, термофилами?
ЗАНЯТИЕ №7
Темы:

Методы выделения и идентификация чистых культур аэробных бактерий
(продолжение): биохимическая активность бактерий.

Антибиотики.
План занятия:
1. Идентификация выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам.
2. Антагонизм микроорганизмов.
3. Классификации антибиотиков.
4. Механизмы антимикробного действия важнейших групп антибиотиков.
5. Методы определения антибиотиков в жидкостях организма.
6. Количественное и качественное определение чувствительности бактерий к антибиотикам.
7. Механизмы развития антибиотикорезистенности бактерий и пути ее преодоления.
8. Осложнения при лечении антибиотиками.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
А. Идентификация выделенной на скошенном агаре культуры бактерий проводится после установления чистоты (однородности) культуры по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам.
Определяют ферментативные (биохимические) свойства микробов, фаго- и батерициночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую принадлежность. В некоторых случаях у выделенных бактерий определяют также эпидемиологические маркеры (серовар, фаготип, хемовар, колициновар), с помощью которых можно установить очаги инфекции и пути ее распространения.
Б. В естественных условиях микроорганизмы существуют в сложных ассоциациях, внутри которых складываются разнообразные взаимоотношения, определяющиеся, в первую очередь, физиолого- биохимическими особенностями членов ассоциаций, а также различного рода экологическими факторами.
Взаимоотношения между микроорганизмами могут быть симбиотические (симбиоз, метабиоз, сателлитизм, синергизм) и конкурентные (антагонизм, паразитизм, хищничество).
Симбиоз - взаимоотношения микроорганизмов, при которых два или более вида микроорганизмов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия. Типичный пример таких взаимоотношений – совместное развитие аэробных и анаэробных бактерий. В кефирных зернах одновременно развиваются молочнокислые бактерии и дрожжи, при этом молочнокислые бактерии, испытывающие потребность в витаминах, получают их в результате развития дрожжей, последние получают благоприятные условия для развития за счет подкисления среды. При