Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
метабиозе продукты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляются другими микроорганизмами в качестве питательного материала. Между ними складываются синтрофные связи, при которых субстрат используется 36 одновременно несколькими видами микробов. В частности, некоторые инфекционные заболевания человека являются полимикробными, т. е. вызываются синтрофными ассоциациями бактерий. Газовая гангрена, например, обусловлена действием нескольких возбудителей из рода Clоstridium в ассоциации с различными аэробными бактериями, главным образом, стафилококками и стрептококками. Разновидностью метабиоза является сателлитизм, для которого характерно, что одни микроорганизмы выделяют в среду ростовые вещества (аминокислоты, витамины и др.), стимулирующие развитие другого микроорганизма или макроорганизма-хозяина, как, например, нормальная микрофлора у человека. При синергизме у членов микробной ассоциации взаимно повышается физиологическая активность за счет выделения продуктов, стимулирующих их развитие. Помимо благоприятных взаимоотношений между микроорганизмами наблюдаются и такие, при которых один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов, т. е между ними при их развитии наблюдается антагонизм. Причины, приводящие к антагонизму, разнообразны: 1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее. 2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий. 3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.). Процесс хищничества состоит в том, что некоторые микроорганизмы разрушают клетки других видов микроорганизмов и используют их в качестве питательного субстрата. К числу микроорганизмов-хищников относят, главным образом, миксоформы (миксобактерии, миксомицеты). Паразитизм характеризуется тем, что один вид микроорганизмов (паразит) поселяется в клетках другого (хозяина) и питается за его счет. Облигатные паразиты не могут развиваться в отсутствие хозяина. К типичным паразитам относятся бактериофаги. Наиболее существенной формой конкурентных взаимоотношений, имеющей важное практическое использование, является образование микробами-продуцентами специфических продуктов обмена, угнетающих или полностью подавляющих развитие микроорганизмов других видов. Практическое значение антагонизма для медицины: 1) применение бактериальных препаратов, содержащих живые антагонистические действующие микроорганизмы, для угнетьения па огенных и условно-патогенных микробов и лечения нарушений нормального микробиоценоза кишечника (дисбактериоза) – колибактерин. Бифидумбактерин, лактобактерин и др.; 2) использование микробов антагонистов для производства антибиотиков. Антибиотики – вещества, образуемые различными живыми клеточными структурами, способные подавлять рост и вызывать гибель определенных микроорганизмов. По происхождения антибиотики подразделяют на следующие группы: Антибиотики, образуемые бактериями (грамицидин, полимиксин и др.); Актиномицетами (линкомицин и др.); Грибами (пенициллин, цефалоспорины и др.); Растениями (фитонциды: аллицин, рафанин и др.); Животными клетками (экмолин, эритрин); Синтетические и полусинтетические. По химическому составу антибиотики относятся к следующим основным группам: Азотсодержащие гетероциклические соединения, имеющие в своем составе бэта-лактамовое кольцо (пенициллины); Ароматические соединения (левомецитин); Тетрациклины, содержащие четыре конденсированных шестичленных цикла (тетрациклины и др.); Аминогликозидные соединения, в составе которых имеются аминосахара (стрептомицин и др.); 37 Макролиды: содержат макроциклическое кольцо, связанное с аминосахарами (эритромицин и др.); Ациклические (полиеновые) соединения с несколькими двойными связями - /СН=СН/ (нистатин и др.); (Фтор)хинолоны. По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две группы: узкого и широкого спектра действия. Антибиотики узкого спектра действуют на определенные группы бактерий (например, пенициллин, оказывающий губительное действие только на шаровидные бактерии, спирохеты и некоторые грамположительные бактерии). Антибиотиками широкого спектра действия являются аминогликозиды, подавляющие рост кислотоустойчивых, многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших, риккетсий, хламидий. Антибактериальное действие антибиотиков измеряют в единицах действия (Е.Д.), содержащихся в 1 мл раствора препарата или в 1 мг химически чистого вещества. За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях. Механизм антибактериального действия антибиотиков различен. У одних он связан с нарушением или блокированием синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины). У других - с адсорбцией на ЦПМ и взаимодействием с ее стерольным компонентом, что приводит к быстрой потере клеткой низкомолекулярных водорастворимых веществ цитоплазмы или нарушением жизненно важных функций ЦПМ (нистатин. полимиксины). У третьих - в блокировании синтеза белка рибосомами бактерий и нарушении считывания генетического кода, что нарушает репликацию бактерий (стрептомицин). Антибиотики, обладающие противоопухолевым действием, избирательно подавляют синтез нуклеиновых кислот в клетках злокачественных опухолей, для которых характерен дефект репарационных механизмов, в связи с чем они не в состоянии восстанавливать поврежденную ДНК. Цель занятия 1. Изучить сущность и механизм действия различных ферментных систем у бактерий; освоить методику их изучения и применения для идентификации чистых культур. 2. Изучить особенности взаимоотношений между микроорганизмами как основу учения о антибиотизме и антибиотиках. 3. Освоить методы определения антибиотикочувствительности бактерий. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Классификация ферментов бактерий, механизмы их действия, методы изучения. 2. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация по биохимическим свойствам 3. Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Принципы атимикробной химиотерапии. 4. Симбиотические и конкурентные взаимоотношения между микроорганизмами. 5. Микробный антагонизм, его механизмы. Микроорганизмы – продуценты антибиотиков. 6. Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия, способам получения. 7. Методы определения антибиотикочувствительности бактерий. 8. Побочное действие антибиотиков на организм человека. Уметь: 1. Интерпретировать результаты изучения ферментативной активности бактерий и их антибиотикограммы. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Устойчивость ферментных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими признаками для идентификации бактерий и установления микробиологического диагноза. Для обнаружения исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы: среды, содержащие белковые вещества (желатину, молоко, свернутую сыворотку крови, куриный белок и т.д.) для выявления протеолитических ферментов; 38 среды с сахарами или многоатомными спиртами для определения сахоролитической активности; среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами; среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов. В состав дифференциально-диагностической среды обычно входит индикатор, указывающий на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента Сахаролитические свойства, т.е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты и альдегидов, цвет среды меняется за счет находящегося в ней индикатора, что создает впечатление пестроты - «пестрый ряд». В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий, подбирают среды с соответствующими моно- и ди-сахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крахмал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газообразные продукты /СО². Н². СН²/, последние накапливаются в «поплавке». Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кислота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны. Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается. При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя (цвет среды не изменяется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание. Среда Вильсона-Блера. Готовят из мясо-петонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na²SO³, хлористое железо FeCl². На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. При этом в анаэробных условиях осуществляется восстановление сернисто-кислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой и пептоном. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причем различные виды микробов дают характерную для него форму разжижения (послойно в виде гвоздя, елочки и т.д.). При посеве на свернутую сыво- ротку вокруг колоний появляются углубления (разжижение). В молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватыи цвет. Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для обнаружения индола по способу Мореля, узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) дает образование красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца. Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды - желтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора в красный. Определение образования ацетона проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола дает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа- нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол. Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой. 39 Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять самые разнообразные ферменты бактерий. Бумажки пропитаны индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и др. ве- ществами. Утилизация вещества приводит к изменению рН среды, изменению цвета индикатора. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Посев испытуемой культуры производится в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6). Наличие каталазы у аэробов и факультативных анаэробов выявляется внесением петли культуры бактерий в каплю 3% перекиси водорода. При этом выделяются пузырьки 0². У облигатных анаэробов каталаза отсутствует и перекись водорода оказывает на них губительное действие. Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. Бумажка синеет. Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют иодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, дает синее окрашивание среды. Тип окисления глюкозы в аэробных или анаэробных условиях устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Дяя создания анаэробных условий среда заливается слоем вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зеленый цвет среды в желтый. Утилизация глюкозы в аэробных и анаэробных условиях свидетельствует о преобладании бродильных процессов. Аэробы (Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, анаэробы - только в анаэробных. Факультативные анаэробы (Escherichia coli) утилизирует глюкозу в аэробных и анаэробных условиях. Гемолитические свойства микроорганизмов изучают при посеве их на среды с кровью. Жидкие среды при разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта. При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала лечения нтибиотиками. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведений в жидких и плотных средах. Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. В 2004 году Госсанэпиднадзором России утверждена новая инструкция определения чувствительности к антибиотикам, учитывающая общепринятые международные стандарты в этой области. Согласно этим рекомендациям для исследования берут 3-5 колоний выделенной чистой культуры, из которых затем готовится клеточная взвесь на физиологическом растворе или бульоне (Мюллер-Хинтона). С помощью оптического стандарта мутности на 0,5 ед. (по Mс Farland, что соответствует 1,5 х 10 8 КОЕ/мл) клеточная взвесь стандартизируется. Затем стерильным ватным тампоном, смоченным в приготовленной взвеси, исследуемые бактерии засевают в чашке Петри со специальной средой (чаще всего агар Мюллер-Хинтона). Заштриховав всю поверхность агара вначале один раз, еѐ заштриховывают еще дважды, предварительно вращая чашку каждый раз на 60º. Стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному соединению, то вокруг дисков образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируемым в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений. Жидкую среду (пригодную для роста данного микроба) разливают по 2 мл в 10 пробирок. Готовят раствор антибиотика. содержащий 100 ед. в 1 мл и добавляют 2 мл раствора в 1-ую пробирку. После тщательного перемешивания 2 мл переносят в следующую пробирку и т.д. Из 9-ой пробирки 2 мл удаляют. Десятая пробирка не содержит антибиотика и служит контролем. Суточную культуру микроба разводят с использованием стандарта мутности до густоты 10000 микробов в 1 мл. После чего в каждую пробирку вносят по 40 0.2 мл взвеси. После 20 ч инкубации в термостате учитывают результат. Среда в пробирках, в которых антибиотик находится в концентрациях, достаточных для подавления роста микроорганизмов, остается прозрачной. Наименьшая концентрация антибиотика, при которой размножение микроорганизмов уже не происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей концентрации данного антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма и рассматривается как бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения бактерицидной концентрации исследуемого антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма (это значит, концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из пробирок, содержимое которых не помутнело, на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие роста свидетельствует, что в данной пробирке микроорганизмы полностью убиты данным антибиотиком. Метод Е-тестов (от англ. еllipse – эллипс, т.к. при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы) – сочетает в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков. Вместо дисков используются полоски фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями антибиотика. Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, возникает эллипсовидная зона. Метод серийных разведений антибиотика в агаризованной среде удобен тем, что позволяет в одном опыте проверить чувствительность к данному антибиотику нескольких микроорганизмов. Разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на отдельный сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика. Чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий и инкубируют в течение 40 – 72 часов. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется. ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Демонстрация ферментативной активности бактерий с использованием СИБ для межродовой дифференциации бактерий. 2. Ферментативная активность представителей семейства кишечных бактерий на средах Гисса (E.coli). 3. Обнаружение выделения сероводорода и индола. 4. Действие летучих и нелетучих фракций фитонцидов чеснока у бактерии. 5. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методами: а) диффузии в агаре с помощью бумажных дисков и градуированных полосок (Е- тест); б) серийных разведении. 6. Определение концентрации антибиотика в сыворотке крови 7. Флаконы и ампулы с различными антибиотиками и дисками для определения антибиотикочувствительности. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Каждый студент учитывает рост культуры на косом агаре, приготавливает мазок, окрашивает по Граму. 2. Бригада студентов производит пересев культуры с косого агара на «Пестрый ряд» (изучение биохимических свойств). 3. Бригада студентов определяет чувствительность выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ: 1. Какую роль выполняют ферменты у бактерий? 2. Какова классификация ферментов у бактерий? 3. Каков принцип идентификации бактерий по биохимическим свойствам? 4. Как изучаются сахаролитические свойства бактерий, и какие питательные среды для этого применяются? 5. Как и на каких питательных средах изучаются протеолитические свойства бактерий? 6. Что такое «пестрый ряд»? 7. Что собой представляет СИБ и ее назначение? 41 8. Какие газообразные продукты образуются при расщеплении бактериями белков и как их определяют? 9. Назовите ферменты биологического окисления и как их выявляют? 10. Назовите формы симбиотических взаимоотношений между микроорганизмами. 11. Каковы формы конкурентных взаимоотношений между микроорганизмами? Что такое микробный антагонизм и каковы практические аспекты его применения? 12. Что такое химиотерапия, каковы ее принципы? 13. Какие существуют химиотерапевтические препараты? 14. Что такое химиотерапевтический индекс? 15. Что такое антибиотики? 16. Какова классификация антибиотиков по способам получения, по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия? 17. Каков механизм действия противоопухолевых антибиотиков? 18. Какие Вы знаете осложнения антибиотикотерапии? 19. Как предупредить развитие дисбактериоза при антибиотикотерапии? 20. Как предупредить или снизить выраженность побочного действия антибиотиков на организм больного? 21. Каковы механизмы формирования антибиотикорезистентных культур? 22. Что способствует формированию антибиотикорезистентности у бактерий? 23. Какие мероприятия могут способствовать предупреждению формирования антибиотикорезистенности у бактерий? 24. Какие существуют методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам? 25. В чем заключается проблема получения и применения противовирусных химиопрепаратов? 26. Что такое аномальные нуклеозиды и каков механизм их действия при лечении вирусных инфекций? 27. Каков механизм действия азидотимидина и других веществ, ему подобных, применяемых для лечения СПИДа? ЗАНЯТИЕ № 8 Темы: Методы выделения и идентификации чистых культур аэробных бактерий, определение чувствительности к антибиотикам (окончание). Медицинская экология микроорганизмов. Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды, пищевых продуктов. План занятий. 1. Идентификация выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам, учет чувствительности к антибиотикам. 2. Природные микробиоценозы. Экологические среды микробов. 3. Санитарно-показательные бактерии, их характеристика. 4. Определение микробного числа воздуха по методу Коха и с помощью аппарата Кротова. 5. Методы санитарно-бактериологической оценки воды: определение коли-титра, коли-индекса бродильным методом и с помощью мембранных фильтров. Определение микробного числа и коли-фагов. 6. Определение микробной обсемененности кожи рук и предметов обихода методом смывов. 7. Определение микробного числа и коли титра пастеризованного молока (для педиатров). ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ. Микроорганизмы распространены повсюду. Большинство их в естественных условиях находятся в определенных взаимоотношениях друг с другом. В окружающую среду патогенные бактерии попадают от больных, бактерионосителей и находятся здесь в течение определенного времени. В связи с этим санитарно- бактериологические исследования направлены на изучение и оценку различных объектов с целью определения их эпидемической безопасности. Методы проведения санитарно-микробиологических исследований предусматривают определение общей микробной обсемененности (ОМЧ), определение и титрование санитарно- показательных микроорганизмов, выявление в исследуемых объектах патогенных микробов и их метаболитов. 42 Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества, в связи с чем используются косвенные методы выявления микробной обсемененности постоянно сопутствующими патогенным бактериям санитарно-показательными микробами. ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами. Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде. Облигатные микробы кишечника и дыхательных путей являются санитарно-показательными; обнаружение на объектах окружающей среды E.coli, Е. faecalis свидетельствует об их фекальном загрязнении. Одновременное выделение St.aureus, Str hemolyticus из воздуха свидетельствует о его орально-капельном загрязнении. Содержание санитарно-показательных бактерий оценивается по титру и индексу. Цель занятия: 1. Изучить методы и показатели, необходимые для санитарно-бактериологической оценки объектов окружающей среды. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Природные микробиоценозы. Экологические связи в микробиоценозах. 2. Экологические среды микробов: микрофлора почвы, воды, воздуха, пищевых продуктов, бытовых и производственных объектов и ее роль в распространении инфекционных болезней. 3. Принципы санитарно-микробиологических исследований. Индикация патогенных микробов в объектах окружающей среды, косвенные методы: определение ОМЧ и санитарно-показательных микроорганизмов: бактерий группы кишечной палочки, клостридий, стрептококков и стафилококков. Уметь: 1. Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы, пищевых продуктов и смывов по микробиологическим тестам. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарно- показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, а Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП или, так называемые, колиформные бактерии), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численности сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы. Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микробному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру - наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды. 4) Кроме того, в воде определяют наличие спор сульфитредуцирующих бактерий и цист лямблий. Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному числу - количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий - представителей микрофлоры дыхательных путей - гемолитические стрептококки, золотистый стафилококк. Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение микробного числа и санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП), а также патогенных возбудителей. Микрофлора воздуха. Нормативы: чистый воздух зимой: ОМЧ не более 4500, гемолитических стрептококков - до 35; грязный воздух зимой: ОМЧ более 7000, гемолитических стрептококков - более 70. Нормативные показатели микробной обсемененности воздуха в помещениях больницы Операционные ОМЧ Золотистый стафилококк (в 250 л) до начала работы не более 500 не допускается во время работы не более 1000 не допускается родильные комнаты не более 1000 не допускается 43 палаты для недоношенных детей не более 750 не допускается Санитарно-бактериологическое исследование воздуха проводится седиментационным и аспирационным методами. Седиментационный метод по Коху заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на 5-10 минут на общую обсемененность и не менее 40 минут на обсемененность кокковой микрофлорой. Засеянные чашки инкубируют 24 часа в термостате и столько же при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха. На площадь 100 кв. см. в течение 5 минут оседает столько бактерий, сколько их содержится в 10 л. воздуха. Аспирационный метод более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью аппарата Кротова. Он устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью. Микрофлора воды Микробиологические и паразитологические показатели для питьевой воды. Показатели Единицы измерения Нормативы Термотолерантные колиформные бактерии (44º С) Число бактерий в 100 мл Отсутствие Общие колиформные бактерии (37ºС) Число бактерий в 100 мл Отсутствие Общее микробное число Число образующих колоний бактерий в 1 мл Не более 50 Коли – фаги Число бляшкообразующих единиц (БОЕ) Отсутствие Споры сульфитредуцирующих клостридий В 100 мл число спор в 20 мл Отсутствие Цисты лямблий Число цист в 50 мл Отсутствие Метод мембранных фильтров Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 0 С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 0 С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс. Метод бродильной пробы 1-й день. Воду в объме 100 мл берут 3 пробы, 10 мл (3 пробы) засевают соответственно на 10 мл и 1 мл концентрированной среды ГПС (глюкозопептонная среда) или ЛПС (лактозопептонная среда). 1 мл воды (3 пробы) засевают на 10 мл разведенной среды ГПС с «поплавками». Посевы инкубируют при 37°С 24 часа. 2-й день. Из всех объемов воды. независимо от результатов (кислота- газ) делают пересев на две чашки со средой Эндо (одна - с добавлением раствора основного фуксина или раствора разоловой кислоты, другая - с добавлением молока или желатина - для обнаружения протеолиза). Посевы инкубируют при 37°С 18 часов. 44 3-й день. С чашек из каждого засеянного объема отбирают 2-3 лактозоположительные, протеолизоотрицательные. оксидазоотрицательные, грам-отрицательные палочки и отвивают на полужидкий агар с глюкозой и индикатором Андреде или бромтимоловым синим (укол в столбик). Посевы инкубируют 20 часов при 37°С. 4-й день. Производят учет результатов. Определяют, какой объем воды на полужидком агаре с глюкозой дает образование кислоты и газа, и делают расчет коли-титра и индекса по таблице ГОСТа 48963-73. Микробное число определяют при посеве 1мл исследуемой, воды. Оксидазный тест позволяет отбросить оксидазоположительные колонии (псевдомонады, аэромонады, вибрионы и др.). Микроскопия мазков из колоний позволяет исключить грамположитель-ную споровую флору и шаровидные бактерии. Окисление глюкозы, лак- тозы до кислоты и газа при 37°С подтверждает принадлежность бактерий к кишечной группе. Микрофлора пищевых продуктов Нормативы: молоко и напитки - ОМЧ не более 75000 в 1 мл, коли-титр - не менее 3; мясо, колбасные изделия и мясные продукты - БГКП не должны содержаться в 1 г, сальмонеллы не должны содержаться в 25 г, протей - в 0,1 г, коагулазоположительные стафилококки - в 0,1 г, сульфитредуцирующие клостридии - в 0,1 г, ботулотоксин и клостридиум ботулинус в консервах не должен присутствовать. Ход исследования. Для определения ОМЧ пастеризованное молоко разводят стерильным изотоническим раствором NaCl 1:10, 1:100, 1:1000 и по 1 мл разливают на дно стерильных чашек, заливают расплавленным, остуженным агаром. Инкубируют в термостате при 37 0 С в течение 24 часов. Подсчитывают количество выросших колоний. Для определения коли-титра цельное пастеризованное молоко забирают в 6 пробирок со средой Кесслера: в 3 пробирки вносят по 1 мл, в остальные по 0,1 мл (разводят в 10 раз стерильной водой). Инкубируют при 43 0 С 24 часа. Из забродивших проб делают посевы на среду Эндо и идентифицируют БГКП. При обнаружении Гр- палочек ставят пробу на оксидазу и производят посев на среду с глюкозой и среду Козера. При наличии кислоты и газа на среде с глюкозой и отсутствие роста на среде Козера (1 л дистиллированной воды, 10 г фосфата однозамещенного калия, 0,2 г сульфата магния, 2,5-3,0 г цитрата натрия, 10 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего). Согласно ГОСТу 9225-68 учитывают только цитратонегативные разновидности кишечной палочки. Коли-титр вычисляют по таблице (Л. Б. Борисов и др. 1993. С. 69). При исследовании напитков определяют ОМЧ и коли-титр по методикам исследования питьевой воды. Лимонад нейтрализуют 10% раствором гидрокарбоната натрия (проверка рН лакмусовым индикатором). Коли- титр определяют методом мембранных фильтров. При микроскопии мяса - определяют количество бактерий в мазках-отпечатках из кусочков 2х1,5х2,5 см. Окраска по Граму. Мясо свежее - если в поле зрения не более 10 бактериальных клеток. Для определения ОМЧ, БГКП, сальмонелл, бактерий рода Протеус, коагулазоположительных стафилококков и клостридий из глубинных участков стерильно берут навески мяса 20 г и добавляют 80 мл стерильного физ. р-ра, гомогенизируют в электрическом смесителе. 0,1 и 0,01 г продукта засевают на МПА, инкубируют 48 часов и подсчитывают число колоний. Определение БГКП в 1 г продукта. 5 мл взвеси засевают на среду Кода (питательный бульон, сульфанол, лактоза, бромтимоловый синий), инкубируют 18 часов. Лак+ БГКП меняют синий цвет среды на темно-зеленый или ярко- желтый. Определение сальмонелл проводят посевом на среды Мюллера, Кауфмана или селенитовый бульон с последующим выделением чистой культуры. Протей выделяют по методу Шукевича, клостридии - на среде Вильсон-Блера, коагулазоположительные стафилококки на желточно-солевом агаре. Для выявления ботулинического токсина пробы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксической противоботулинической сывороткой типов А,В,С,Е и F на белых мышах. Микрофлора рук и предметов окружающей среды Осуществляется взятием смывов с рук обследуемых лиц, с посуды, поверхности столов, досок и т. д. При взятии смыва с рук пользуются стерильными ватными тампонами, которые перед употреблением смачивают в среде Кесслера. Смывы делают с обеих рук, тщательно протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства сначала левой руки, а затем правой. Смывы с поверхности предметов делают с помощью трафаретов из проволоки, имеющих площадь 25 см 2 . Тампоны помещают в пробирки со средой Кесслера и посевы выдерживают в термостате при температуре 43 0 С в течение суток. При наличии брожения в 45 среде Кесслера делают высев на среду Эндо. Колонии, подозрительные на кишечную палочку, подвергают дальнейшей идентификации. ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Определение микробного числа воздуха по методу Коха и с помощью аппарата Кротова. Определение микробного числа водопроводной воды. 2. Определение числа общих колиформных бактерий методом мембранных фильтров. 3. Определение фекального загрязнения предметов обихода и рук персонала. 4. Снитарно-бактериологическое исследование молока и молочных продуктов (для студентов педагогического факультета). ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Бригады студентов учитывает результаты изучения биохимических свойств чувствительности к антибиотикам ранее выделенной культуры. 2. Бригады студентов учитывает посевы воздуха по методу Коха: определяет микробное число воздуха, изучает культуральные, морфологические и тинкториальные свойства выросших колоний. 3. Каждый студент производит посев отпечатков пальцев на чашку с МПА. 4. Один студент в бригаде производит посев смыва с рук на среду Кода. 5. Две бригады студентов производят посев слизи из зева сахарный бульон, ЖСА и кровяной агар. 6. Две бригады студентов засевают слизь из носа на солевой бульон, ЖСА и кровяной агар. 7. Каждый студент производит оценку санитарно-бактериологических показателей молока и молочных продуктов по результатам проведенных исследований (только для студентов педиатрического факультета). КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ: 1. Что такое популяция, биотоп и микробиоценоз? 2. Что такое экосистема? 3. Что такое микробиоценоз? 4. Какие существуют экологические среды микробов, и какие из них являются антропогенными? 5. Какова роль экологических сред в распространении инфекционных заболеваний? 6. По каким критериям производится оценка санитарно-бактериологического состояния экологических сред: почвы, воды, воздуха и др.? 7. Какие микроорганизмы относятся к санитарно-показательным для воды, воздуха, почвы? 8. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние почвы? 9. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние воздуха? 10. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние воды? 11. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние пищевых продуктов? 12. Что такое коли-титр и коли-индекс воды? 13. Что такое микробное число воды? 14. Какие методы применяются для определения фекального загрязнения воды? 15. Как определяется микробное число воды? 16. Чему равняются микробиологические и паразитологические показатели питьевой воды? 17. Как проводится определение фекального загрязнение персонала и предметов обихода? ЗАНЯТИЕ №9 |