Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Тема: Физиология бактерий. Питание и выращивание бактерий и вирусов. План занятия: 1. Питание и выращивание бактерий. Классификация питательных сред. 2. Культивирование риккетсий, хламидий и вирусов. 3. Методы посевов и пересевов бактериальных культур, методы выделения чистых культур: по Дригальскому, Гольду, Коху и биобактериологический. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Физиология микробов изучает вопросы питания, ферменты, рост и размножение микробов, их конструктивный и энергетический метаболизм. Для роста и размножения микробной клетке необходима энергия. Она высвобождается в процессе окислительно-восстановительных реакций. Поступление питательных веществ в бактериальную клетку происходит в основном за счет осмоса и диффузии, а также обменной адсорбции. Для культивирования бактерий используются питательные среды. Их применяют для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения микроорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях. Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления восстановленных углеродных (органических) соединений. Некоторые из них, такие как E.coli, способны к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Другие, например, молочнокислые бактерии - растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода – до 0,1 мг/л в день. Они получили название олиготрорфных, противоположную группу для них составляют бактерии копиотрофные – способные к росту на богатых пищевых субстратах. По составу среды подразделяются на естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт животного или растительного происхождения - молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в точно указанных концентрациях. Например, минимальная среда Ледерберга часто используется для получения ауксотрофных мутантов. На таких средах культивируются прототрофы, использующие углерод глюкозы как единственный источник углерода, и аммонийные соединения как единственный источник азота. По консистенции среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и сухие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные - для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др. Сыпучие среды обычно используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором. В качестве уплотнителей в настоящее время используют агар, реже желатин и силикагель. Агар - полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде 24 гели, плавящиеся при 100 0 С и уплотняющиеся при 45 0 С и ниже, не используемые микроорганизмами в качестве питательного субстрата. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать. Агар к средам добавляют в количестве 1,5-2% - для плотной среды или 0,4-0,7% - для полужидкой среды, которая может применяться для длительного хранения культуры без пересевов. В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав. Микротест - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ- облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях. По назначению среды подразделяются на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические. Обычные среды используют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), сусло жидкое, сусло-агар. Специальные среды используют для выделения, культивирования и идентификации определенных групп или видов микроорганизмов. Элективные среды используют при выделении определенного вида микроорганизмов из мест его естественного обитания и содержат компоненты с учетом биологических особенностей выделяемых микробов. Например, дифтерийные бактерии в силу их высокого паразитизма лучше всего растут на сывороточных средах или кровяных средах (Ру, Леффлера, Тинсдаля, Клауберга). В последних двух случаях в состав сред входит теллурит калия или натрия, в результате чего рост сопутствующих бактерий сильно задерживается. В противоположность этому холерный вибрион можно выращивать даже на «голодной» водной среде, содержащей всего 1% пептона, но при этом рН среды должна быть более 8.0. Дифференциально-диагностические среды (например, среды Гисса, Симонса, Кларка, бульон Штерна) предназначены для изучения и индикации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической активности и политропные, или комбинированные, среды. В такие среды также часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андреде, бромкрезоловый пурпурный, крезоловый красный), помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разделяют на 4 основные группы. А. Содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространенными средами являются МПЖ, свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА). Б. Содержащие индикаторы, углеводы или многоатомные спирты; ферментативное расщепление приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР) и лакмусовое молоко (среда Минкевича). Также широко распространены среды Хисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты либо кислоты и газа. Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андраде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования; иначе такой набор называют «пестрый», или цветной, ряд. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин). Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника - микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой средой является среда Эндо, в состав которой входит лактоза. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и окрашивает колонии 25 в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, так как они не сбраживают лактозу. В. Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный - агар Ротберга, индигокармин - агар Омилянского), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет). Г. Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определенной группой бактерий. Наиболее распространенными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях. Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза, т. е. торможению процессов обмена веществ. Хранение микроорганизмов осуществляется в специальных коллекциях типовых культур. В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов может поддерживается следующими методами: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием; 4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких температур. Выделение чистой культуры аэробных бактерий. В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются довольно редко. Тем не менее, основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому совершенно необходимой задачей является выделение чистых культур различных видов бактерий, существующих в естественных условиях. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2 – 3 суток, однако для некоторых (например, бактерии туберкулеза), этот процесс может затягиваться до 4 – 6 недель. Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки. Для выделения чистой культуры применяют методы, основанные на: 1) принципе механического разделения микроорганизмов: а) механическое разобщение бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред шпателем (по Дригальскому), рассев штрихами калиброванной петлей (по Гольду) или тампоном после забора им исследуемого материала; б) метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин). 2) получении серийных разведений в жидкой среде с последующим высевом на чашки с агаром (метод пластинчатых разводок по Коху). 3) на биологических свойствах микроорганизмов: а) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре для получения культур психрофильныхбактерий. б) метод Шукевича. Клетки бактерии (протея), характеризующиеся скользящим типом движения, засеянные в конденсационную жидкость свжеприготовленного косого агара, поднимаются («всползают») по поверхности среды и разрастаются далеко за зону внесения посевного материала. в) метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80 0 С 10-15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают. г) бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина 26 позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях. д) метод заражения лабораторных животных или растений. Основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопроба). Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным. Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов. Для культивирования вирусов (так же как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий) используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных. Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов с целью получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость отверстие заливают парафином; если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37 0 С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион- аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА). Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок) длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона, образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток. Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД), которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса. Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста. Культивирование риккетсий Риккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях. Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона. Патогенные риккетсии вызывают сыпной тиф, Ку-лихорадку и другие риккетсиозы. Культивирование хламидий. Хламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных. Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33-41 0 С и даже более широких, но чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду. |