Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Тема: Структура бактериальной клетки, сложные методы окраски (метод Грамма), подвижность бактерий. План занятия: 1. Строение бактериальной клетки. 2. Сложные методы окраски. Окраска по Граму. 3. Исследование микроорганизмов в живом остоянии, подвижность бактерий. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ По классификации Берджи бактерии относятся к прокариотам. Клетки прокариот имеют более простое строение, чем у эукариот. Они имеют: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, рибосомы, мезосомы и ядерную субстанцию (нуклеоид), состоящую из ДНК. Бактериальная клетка по своим размерам (1-10 мкм) меньше эукариотов, величина последних колеблется от 10 до 100 мкм. У прокариотов в отличие от эукариотов отсутствует ядерная мембрана, гистоны, аппарат Гольджи, митохондрии и хлоропласты, в клеточной стенке отсутствуют стероиды и отсутствует тканевая дифференцировка. У бактерий всего одна хромосома, а эукариоты имеют диплоидный набор хромосом. У бактерий бинарный способ размножения, а эукариот – митотический. У бактерий часто встречается анаэробный тип дыхания, у эукариотов он обычно отсутствует. Бактериальная клетка также может иметь необязательные (дополнительные) компоненты, такие как капсула, споры, жгутики, включения (например, зерна волютина). Они выявляются с помощью сложных методов окраски или специальных методов исследования (например, микроскопия препаратов, приготовленных из живых бактерий). Рис. 2. Схема строения оболочек грамотрицательных и грамположительных бактерий. 12 Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный (до 40 слоев) пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка). В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана (не более 2-х слоев). На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической (рис.2). Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид. Липополисахарид наружной мембраны состоит из 3 фрагментов: липида А — структуры , практически одинаковой у всех грамотрицательных бактерий; ядра, или стержневой, части и высоковариабельной О-специфической цепи полисахарида (0-антиген). Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гид- рофильные молекулы. Между наружной и цитоплазматической мембранами находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, бета - лактамазы) и компоненты транспортных систем. При резком нарушении синтеза клеточной стенки бактерии чаще всего погибают. Например, это может происходить под воздействием антибиотиков-ингибиторов синтеза пептидогликанов (пенициллин и др.) В ряде случаев под влияние лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма могут образоваться клетки с измененной (часто шаровидной) формой: протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты — бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Бактерии сферо- или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются L-формами. Они способны поддерживать развитие хронического инфекционного процесса. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к изменениям бактерий, могут реверсировать, «возвращаясь» в исходную бактериальную клетку. Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (1 пара дисков — у грамположительных и 2 пары дисков — у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик. Жгутики состоят из белка — флагеллина (от flagellum — жгутик), являющегося Н-антигеном. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали. Число жгутиков у бактерий различных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен жгутиков, отходящих по периметру бактерии (перитрих) у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки. Пили (фимбрии, ворсинки) — нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм х 0,3 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, т. е. за прикрепление бактерий к поражаемой клетке, а также пили, ответственные за питание, водно-солевой обмен и половые (F-пили), или конъюгационные, пили. Пили многочисленны — несколько сотен на клетку. Однако половых пилей обычно бывает 1-3 на клетку: они образуются так называемыми «мужскими» клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды (F-, R-, CoL-плазмиды). Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми «мужскими» сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях. Цель занятия: 1. Ознакомиться со структурными (дифференциальными) особенностями прокариот и овладеть некоторыми методами их изучения (окраска по Граму и изучение подвижности). Учебно-целевые задачи: Знать: 13 1. Постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки, их функции. 2. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий. 3. Методы изучения структурных особенностей микроорганизмов в нативном и окрашенном состоянии: а) технику приготовления и особенности микроскопии нативных препаратов; б) сложный метод окраски по Граму. Уметь: 1. Окрасить методом Грама. 2. Приготовить и микроскопировать препараты из живых бактерий МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 1. При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др., которые играют роль дифференциаторов. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, запасные вещества, включения и т. д.). Окраска по методу Грамаявляется самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и иода, либо терять его после обработки спиртом. В характеристике микроба каждого вида обязательно указывают на отношение к окраске по Граму. Все бактерии по отношению к этому методу окраски делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные: (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы. Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианвиолета и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды - муреин (пептидогликан) в соединении с тейхоевой кислотой и рибонуклеатом магния. У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располоагается в глубине клетки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется также меньшим диаметром пор у грамположительных бактерий, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом. Техника окраски по Граму (модификация Синева) 1. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, окрашенной карболовым генцианвиолетом. и смачивают несколькими каплями воды. 2. Через полторы-две минуты бумажку снимают и на препарат наносят раствор Люголя на 1 минуту. 3. Сливают раствор Люголя и, не промывая водой, действуют спиртом несколько секунд до прекращения отхождения красителя от мазка. 4. Тщательно промывают препарат водой. 5. Докрашивают разведенным фуксином 1-2 минуты. 6.Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают препарат с иммерсионной системой. Грамположительные микробы - фиолетового цвета, грамотрицательные - красного. 2. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий иногда используют неокрашенные препараты (нативные), приготовленные из естественный образцов, либо из колоний выросших микроорганизмов. Нативные препараты чаще всего готовят для исследования живых неокрашенных бактерий с целью установления их подвижности. Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя светлопольный микроскоп с приопущенным конденсором, но лучше всего исследовать в темноном поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа. Для прижизненного изучения бактерий часто используют методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами. Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды. В нее стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю. Препарат микроскопируют с использованием объективов х40 или х90. 14 Препарат «висячая капля» используют при продолжительном наблюдении за ростом и развитием микроорганизмов. Небольшая капля бульонной культуры микроорганизмов помещается с помощью бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с лункой. Капля должна свободно свисать в лунку, не затрагивая ее краев и дна. Для создания влажной камеры и предохранения от высыхания, края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют также, как и препарат «раздавленная капля». Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском. Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания. Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO 4 ) 2 , HgCl 2 ) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды. ДЕМОНСТРАЦИИ 1.Методика окраски по Граму 2. Приготовление препарата «висячая капля» из живых подвижных бактерий (вибрион), микроскопирование в фазово-контрастном микроскопе. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1. Приготовить препараты из грамположительных и грамотрицательных культур (стафилококк, антракоид, кишечная палочка, вибрион), окрасить по Граму, микроскопировать, зарисовать. 2. Приготовить препарат «раздавленная капля» из зубного налета и чистой культуры водного вибриона, микроскопировать в темном поле, записать результат. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. В чем заключаются различия в анатомии эукариот и прокариот? 2. Какие свойства бактерий можно изучить в результате окраски простыми и сложными методами? 3. Какие методы окраски называют дифференциальными? Назовите их. 4. Какие свойства бактерий влияют на их способность воспринимать разные красители? 5. Какой метод окраски позволяет разделить все бактерии на две альтернативные группы? 6. Каково строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий? 7. Объясните последовательность и механизм окраски по Граму. 8. В какой цвет при этом могут окрашиваться бактерии и почему? 9. Назовите морфологические разновидности грамположительных и грамотрицательных бактерий. 10. Какое значение имеют жгутики в биологии бактерий? 11. Как определяют подвижность бактерий микроскопическим методом? 12. Как определяют подвижность бактерий методом посевов? 11. Какое практическое значение имеет изучение подвижности бактерий? 12. Как готовятся висячая и раздавленная капли и каковы особенности их микроскопии? 13. Какие существуют варианты расположения жгутиков у бактерий? Как обнаружить жгутики? ЗАНЯТИЕ №3 Тема: Структура бактериальной клетки (продолжение.) Сложные методы окраски. План занятия: 1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена. 2. Выявление спор у бактерий. Окраска по Ожешко. 3. Выявление капсул у бактерий. Окраска по Бурри-Гинсу. 15 4. Выявление включений по методу Нейссера. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану (2 темных слоя толщиной по 2,5 нм разделены светлым — промежуточным). По структуре она похожа на плазмалемму клеток животных и состоит из двойного слоя фосфолипидов с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются внутрицитоплазматическими мембранами. Цитоплазма состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул — рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков. Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 80S-ри6ocoм, характерных для эукариотических клеток. Рибосомные РНК (рРНК) — консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S рРНК входит в состав малой субъединицы рибосом, а 23S рРНК — в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов. В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигметные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, по наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко- красный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен. Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется из бактериальной цитоплазмы, которая принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно фиксировавшие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а палочки желтого. Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК, содержащая до 4000 отдельных генов. Ядерные структуры можно наблюдать в фазово-контрастный микроскоп. Для их выявления в фиксированных мазках применяют реакцию Фѐльгена. Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности в виде ковалентно замкнутых колец ДНК, так называемые плазмиды. Они не являются жизненно необходимыми, т.к. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды (другое названия — эписомы) представляют двунитчатые кольцевые ДНК с молекулярной массой в несколько миллионов дальтон, реплицируемые клеткой и несущие от 40 до 50 генов. Они вначале были обнаружены у прокариотов, и с их существованием связаны разные свойства бактерий, например устойчивость к антибиотикам. Поскольку плазмиды обычно не связаны с бактериальной хромосомой (хотя многие из них способны к интеграции), их считают экстрахромосомными факторами наследственности. Плазмиды были обнаружены и у эукариотов (дрожжей и других грибов), более того, обычные вирусы высших животных также могут существовать в виде плазмид, т.е. кольцевых ДНК, лишенных собственных белков и реплицируемых клеточными ферментами синтеза ДНК. В частности, в виде плазмид могут существовать вирусы У бактерий известны плазмиды, выполняющие регуляторные и кодирующие функции. Например, R-плазмида обусловливает устойчивость бактерий к лекарственным препаратам, плазмида бактериоцирогении кодирует синтез бактериоцинов, т.е. особых белковых продуктов, вызывающих гибель близкородственных бактерий. Капсула, микрокапсула, слизь. Капсула — слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках- отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при специальных методах окраски мазка (например, по Бурри—Гинсу), создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь образует темный фон вокруг капсулы. 16 Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда — из полипептидов; например, у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна, препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы). Многие бактерии образуют микрокапсулу — слизистое образование толщиной менее 0,2 мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слизь — мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких границ. Слизь растворима в воде. Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам), их еще называют гликокаликсом. Кроме синтеза экзополисахаридов бактериями, существует и другой механизм их образования: путем действия внеклеточных ферментов бактерий на дисахариды. В результате этого образуются декстраны и леваны. Кислотоустойчивые бактерии обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, щелочам и спиртам, что связано с наличием в теле микроба нейтральных жиров, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для выявления кислотоустойчивых бактерий применяют концентрированные красители, приготовленные в растворе карболовой кислоты, и подогревание. Карболовая кислота при подогревании разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства. При последующем воздействии серной или азотной кислотой тело микробной клетки не обесцвечивается, что дает возможность отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от бактерий, не обладающих этим свойством. К патогенным кислотоустойчивым бактериям относятся палочки туберкулеза и проказы. К непатогенным - палочка смегмы, нередко находящаяся в моче человека. а также микробы, встречающиеся в организме холоднокровных, на различных злаках, почве, навозе, в молоке, масле. В отличие от туберкулезных бактерий они обесцвечиваюся спиртом. Окраска кислотоустойчивых микробов производится по методу Циля-Нильсена. Споры у бактерий образуются при неблагоприятных условиях существования микроба. По расположению споры могут находиться в центре микробной клетки, например, у сибиреязвенной палочки, ближе к концу - субтерминально - у Bac.perfringes, и на конце (терминально) - у палочки столбняка. Спорообразование наблюдается среди некоторых палочковидных бактерий и актиномицет. Образование спор происходит в присутствии кислорода и при температуре не ниже 15° и не выше 43°. Споры очень устойчивы к температуре, погибают при кипячении в течение 2-6 часов, при стерилизации в автоклаве, при температуре 120°, погибают в течение 15-30 минут. Споры у бактерий служат для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. Бактериальные споры могут быть выявлены с использованием как простых, так и сложных методов окраски. Простой, например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина микроорганизм окрашивается в зеленый цвет, споры – бесцветные, а фон – черный. Наиболее часто применяют сложные методы окрашивания эндоспор по Ожешко и по Шеферу – Фултону. Капсула располагается поверх клеточной стенки и представляет ослизненную клеточную оболочку. Патогенные бактерии образуют капсулу только находясь в организме животных или человека, а при культивировании может появляться при добавлении к питательной среде нативного белка. Капсула защищает их от действия фагоцитов и антител. "Капсульные" бактерии образуют капсулу и в организме, и на питательных средах, где они дают характерный слизистый рост. Для обнаружения капсул у бактерий применяют специальные методы окраски. Чаще всего используется метод Гинса. В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигметные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, по наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен. Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется из бактериальной цитоплазмы, которая принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно фиксировавшие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а палочки желтого. 17 Цель занятия: 1. Освоить методы микроскопического выявления структурных элементов клетки (споры, капсулы, включения, оболочка кислотоустойчивых бактерий). Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Структурные элементы бактериальной клетки, их назначение и роль в распознавании микробов. 2. Методы микроскопического изучения структурных элементов бактериальной клетки: - оболочка кислотоустойчивых бактерий (окраска по Цилю-Нильсену); - споры (окраска по Ожешко); - зерна волютина (окраска по Нейссеру) - капсулы (окраска по Бурри и по Бурри-Гинсу) Уметь: 1. Окрашивать препараты сложными методами с целью выявления кислотоустойчивых бактерий, спор, зерен волютина у дифтерийной палочки, капсул у бактерий. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Для выявления туберкулезных бактерий обычно исследуют мокроту. Пинцетом или препаровальными иглами наносят комочек мокроты на середину предметного стекла, затем его покрывают вторым пролетным стеклом так, чтобы одна треть нижнего и одна треть верхнего стекла были свободными. Затем берут за свободные концы стекла и растирают комочек между ними, после чего раздвигают оба стекла. Таким образом, получаются два мазка, которые затем высушивают на воздухе и фиксируют на пламени. На фиксированный мазок мокроты, для окраски туберкулезных бактерий по Цилю-Нильсену, кладут листок фильтровальной бумаги размером меньше предметного стекла и наливают на него карболовый фуксин Циля. Окрашиваемый мазок подогревают на пламени до появления пара, который хорошо заметен, если смотреть на препарат сбоку, так подогревают его 2-3 раза. Препарату дают остыть, сбрасывают бумажку с краской и наносят 5% серную или 25% азотную кислоту. Докрашивают препарат метиленовой синькой в течение 4-6 мин, после чего промывают водой, высушивают и рассматривают под иммерсионной системой. Туберкулезные палочки окрашиваются в рубиново - красный цвет, а форменные элементы, некислотоустойчивые бактерии в синий цвет. Для окрашивания спор по методу Ожешко готовят густой мазок на одном конце предметного стекла и высушивают на воздухе, после чего на него наносят 1% раствор соляной кислоты и нагревают на пламени до появления паров в течение 1-2 минут. Препарат промывают водой, высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циля-Нильсена. При иммерсионной микроскопии обнаруживают красного цвета споры и синего цвета вегетативные тела. Метод Шефера – Фултона: фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 – 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров. Сняв фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и в течение 30 с докрашивают 0,5 % раствором сафранина и вновь промывают водой.темой. Спорыокрашиваются в зеленый цвет, клетка – в красный. Для выявления капсул по методу Гинса на предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок, как мазок крови, ребром одного стекла проводят по поверхности другого. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой. Для выявления зерен волютина н а фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин. Снять бумагу, промыть мазок водой. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания. Промыть водой, докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин., вновь промыть водой, высушить и микроскопировать. ДЕМОНСТРАЦИИ 1. Приготовление препаратов из нативной мокроты и их окраска по Цилю-Нильсену. 2.Окрашенные препараты, приготовленные из мокроты туберкулезных больных и из чистой культуры дифтерийной палочки. 3.Споры антракоида, окрашенные по методу Шефера-Фултона. 18 САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА 1. Приготовить препарат из мокроты, окрасить по Цилю-Нильсену, микроскопировать и зарисовывать. 2. Приготовить препарат из Kl. Pneumoniae или Kl. ozaenae методом Бурри-Гинса, микроскопировать и зарисовать их. 3. Микроскопировать окрашенные по Ожешко препараты спор антракоида и зарисовать их. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Какие палочковидные формы принято называть бациллами? 2. В каких условиях образуется капсула у бактерий? 3. В каких условиях образуется спора у бактерий? 4. Каково назначение капсулы у бактерий? 5. Каково назначение споры у бактерий? 6. Какие химические вещества входят в состав капсулы? 7. Как обнаружить капсулу у бактерий? 8. Каким преимущественно формам бактерий присуще спорообразование? 9. Как можно убить спору? 10. Чем обусловлена кислотоустойчивость спор? 11. В какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые бактерии по методу Циля- Нильсена? 12. Чем обусловлена кислотоустойчивость бактерий? 13. Каково назначение зерен волютина? 14. Как можно выявить зерна волютина? 15. Что такое метахромазия? 16. Какое значение имеет обнаружение зерен волютина у бактерий? ЗАНЯТИЕ №4 План занятия: Морфология спирохет, грибов, риккетсий, хламидий, простейших, вирусов (бактериофагов). План занятия: 1. Изучение морфологии нитчатых и дрожжеподобных грибов. 2. Изучение морфологии простейших. 3. Морфология вирусов. Бактериофаги: строение бактериофагов, получение бактериофагов, титрование. Применение в медицине. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Спирохеты— тонкие, длинные, извитые (спиралевидной формы) бактерии, отличающиеся от спирилл подвижностью, обусловленной сгибательными изменениями клеток. Спирохеты имеют наружную мембрану клеточной стенки, окружающую протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной. Под наружной мембраной клеточной стенки (в периплазме) расположены периплазматические фибриллы (жгутики), которые, как бы закручиваясь вокруг протоплазматического цилиндра спирохеты, придают ей винтообразную форму (первичные завитки спирохет). Фибриллы прикреплены к концам клетки и направлены навстречу друг другу. Другой конец фибрилл свободен. Число и расположение фибрилл варьируют у разных видов. Фибриллы участвуют в передвижении спирохет, придавая клеткам вращательное, сгибательное и поступательное движение. При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые названы вторичными завитками. Спирохеты плохо воспринимают красители. Их окрашивают по методу Романовского—Гимзы или серебрением, а в живом виде исследуют с помощью фазово-контрастной или темнополь-ной микроскопии. Спирохеты представлены 3 родами, патогенными для человека: Treponema, Borrelia, Leptospira. Трепонемы имеют вид тонких штопорообразно закрученных нитей с 8-12 равномерными мелкими завитками. Вокруг протопласта трепонем расположены фибриллы. Патогенными представителями являются Т.pallidum — возбудитель сифилиса, T.pertenue — возбудитель тропической болезни — фрамбезии. Боррелии более длинные, имеют по 3-8 крупных завитков и 8-20 фибрилл. К ним относится возбудитель возвратного тифа (B.recurrentis) и возбудители болезни Лайма (В. burgdorferi и др.). Лептоспиры имеют завитки неглубокие и частые — в виде закрученной веревки. Концы этих спирохет изогнуты наподобие крючков с утолщениями на концах. Образуя вторичные завитки, они приобретают вид букв «S» или «С»; имеют 2 осевые нити. Патогенный представитель L interrogans вызывает лептоспироз. 19 Микоплазмы — мелкие бактерии (0,3-0,8 мкм), не имеющие клеточной стенки, окруженные цитоплазматической мембраной, содержащие стеролы Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмо- тически чувствительны. Имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную, похожи на L-формы. Самые мелкие из них – элементарные тельца. Эти формы видны при фазово-контрастной микроскопии чистых культур микоплазм. Микоплазмы – внеклеточные патогенны, прикрепляются к эпителию посредством специальных белков – адгезинов. Отсутствие клеточной стенки определяет устойчивость микоплазм к пенициллинам, цефалоспоринам и др. антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки. Патогенные микоплазмы вызывают хронические инфекции — микоплазмозы, некоторые из нихвходят в состав нормальной микрофлоры (полости рта). Актиномицеты — ветвящиеся, нитевидные или палочковидные грамположительные бактерии. Свое название (от греч. actis — луч, mykes — гриб) они получили в связи с образованием в пораженных тканях друз — гранул из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся колбовидными утолщениями. Актиномицеты могут делиться путем фрагментации мицелия на клетки, похожие на палочковидные и кокковидные бактерии. На воздушных гифах актиномицетов могут образовываться споры, служащие для размножения. Споры актиномицетов обычно нетермостойки. Общую филогенетическую ветвь с актиномицетами образуют так называемые нокардиоподобные (нокардиоформные) актиномицеты — собирательная группа палочковидных, неправильной формы бактерий. Их отдельные представители образуют ветвящиеся формы. К ним относят бактерии родов Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Нокардиоподобные актиномицеты отличаются наличием в клеточной стенке сахаров арабинозы, галактозы, а также миколовых кислот и больших количеств жирных кислот. Миколовые кислоты и липиды клеточных стенок обусловливают кислотоустойчивость бактерий, в частности, микобактерий туберкулеза и лепры (при окраске по Цилю—Нильсену они имеют красный цвет, а некислотоустойчивые бактерии и элементы ткани, мокроты — синий цвет). Грибы представляют собой растительные организмы, лишенные хлорофилла. В отличие от бактерий, клетки грибов имеют дифференцированное ядро и размножаются бесполым и половым способом. По особенности строения мицелия и образования половых спор грибы делят на несколько классов. Представители класса фикомицетов имеют несептированный мицелий и относятся к низшим грибам (мукоровая плесень). Мукоровые грибы представляют собой сильно разветвленную клетку, от которой отходят плодо- носящие гифы - спорангеносцы с шароподобными образованиями наверху спорангиями, наполненными эндоспорами. К классу аскомицет относится аспергиллус и пенициллиум. Аспергилус имеет расчлененный мицелий, одноклеточный конидиеносец, на головке которого веерообразно расположены короткие стеригмы, от которых отшнуровываются экзоспоры (при микроскопии напоминают струйки вытекающей из лейки воды). У пенициллиума или кистевика мицелий и конидиеносец многоклеточные, плодоносящее тело имеет вид кисточки. Представители этих двух классов грибов широко распространены в природе и, как правило, ведут, сапрофитический образ жизни. В отдельных случаях могут вызывать поражение дыхательных путей, среднего уха, глаз. Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 микронов. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная. Наружных спор, типа конидий, и внутренних, типа аскоспор, дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10-20 микронов, форма округлая, оболочка толстая, двуконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами. Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называют псевдомицелием и отличаются они от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования. В патологии человека определенную роль играют дрожжеподобные грибки из рода Candida, поражающие чаще всего слизистую желудочно-кишечного тракта. Лучистые грибки - актиномицеты - по строению совмещают свойства бактерий и грибов. В патологии человека встречаются актиномицеты, вызывающие актиномикоз - заболевание, характеризующееся образованием лучистых друз в гнойно - восполительных инфильтратах различных тканей. Представители семейства Streptomycetaceae служат источником для получения антибиотиков. Риккетсии - занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. Это мельчайшие грамотрицательные микроорганизмы кокковидной или палочковидной формы, не способные расти на искусственных питательных средах. Они могут развиваться только в живой клетке с пониженным 20 метаболизмом. Их культивируют также в желточном мешке куриного эмбриона. Клетка содержит клеточную стенку, ЦПМ, цитоплазму, нуклеоид и рибосомы, что сближает их с бактериями. Внутриклеточное размножение и абсолютный паразитизм сближает их с вирусами. По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе. По П. Ф. Здродовскому, наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсий): 1) кокковидные (0,5мкм), 2) палочковидные (короткие - 1-1,5мкм), 3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3-4мкм), 4) нитевидные (20-40мкм). Все формы полиморфны. Риккетсии окрашивают по Граму (грамотрицательны), по Романовскому-Гимзы и по Здродовскому. У человека риккетсии вызывают сыпной тиф и другие риккетсиозы. Хламидии - грамотрицательные, мелкие кокковидные бактерии, размножаются только в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, т.е., как и риккетсии, они относятся к числу облигатных внутриклеточных бактерий. Попавшие в чувствительную клетку элементарные тельца хламидий превращаются в ретикулярные тельца, которые делятся пополам. После нескольких делений образуются промежуточные формы, превращающиеся затем в элементарные тела. У человека хламидии вызывают поражение глаз, урогенитального тракта, легких и др. Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располагаются группами по 4-6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагромождения чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам, макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину. Хламидии окрашивают по Романовскому-Гимзе, они хорошо видны в нативных препаратах при фазово- контрастной микроскопии. Чаще всего для их выявления в соскобах клеток применяют метод иммунной люминесцентной микроскопии. Простейшие имеют более сложную функциональную организацию по сравнению с бактериями и грибами. Снаружи тело простейших покрывает элактичная и ригидная мембрана – пелликула, образованная внешним слоем цитоплазмы. У некоторых видов кдеточная мембрана может включать опорные фибриллы и даже минеральный скелет. Клеточная структура и набор органоидов идентичен клеткам многоклеточных животных организмов. Многие простейшие активно двигаются за счет псевдоподий, жгутиков или ресничек. Простейшие включены в царство Protozoa, подцарство Animalia, разделенное на 7 типов. Виды, патогенные для человека, например, малярийные плазмодии, лямблии, трихомонады, токсоплазмы, саркоцисты, изоспоры, пнемоцисты, криптоспоридии, трипаносомы и др. входят в сотав 3-х типов – Apicomplexa, Sarcomastigophora и Ciliophora. Всего насчитывается около 7 000 видов, патогенных для растений, животных и человека. Жизненый цикл паразитических простейших нередко включает образовавние промежуточных форм в различных хозяевах, что дает им возможность более эффективно инфицировать восприимчивые организмы. Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей возбудителя и значительно зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации. Морфология простейших изучается как в живом их состоянии, так и в окрашенном виде. Простая окраска (фуксином или метиленовой синей) непригодна, так как она не позволяет выявить сложную структуру этих микроорганизмов. Наиболее простым способом, дифференцирующим отдельные элементы клетки, является метод окраски по Романовскому-Гимзе. При этом фиксация мазков должна производиться не на пламени, а в каком-либо фиксаторе (например, смесью спирта с эфиром по Никифорову). При выявлении подвижности лучшие результаты достигаются, применяя подогрев предметного столика и исследуя в первые 30 минут после взятия материала. Вирусы - автономные, проходящие через бактериальные фильтры генетические структуры, способные функционировать и репродуцироваться в восприимчивых клетках животных, растений, бактерий, простейших, грибов. Вирусная частица - вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой - капсидом. У некоторых вирусов капсид покрыт дополнительной оболочкой. Капсид состоит из субъединиц - капсомеров, имеющих чаще всего симметричное строение. Особенностями вирусов являются: фильтруемость, неспособность размножаться на искусственных питательных средах, отсутствие собственных белоксинтезирующих систем, наличие только одной какой либо нуклеиновой кислоты, дисъюнктивный (разобщенный) способ размножения. Вирусы культивируют в организме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц и культурах клеток (тканей). Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов: цитопатогенного действия 21 (ЦПД) вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции гемагглютинации, гемадсорбции, реакции иммунофлюоресценции. Вирусы, поражающие бактерии (бактериофаги) состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту и отростка. Некоторые фаги не имеют отростка, или он очень короткий. Проникновение фага в бактериальную клетку может закончиться гибелью клетки и выходом фага (продуктивная инфекция - вирулентный фаг). В других случаях геном фага интегрирует с геномом клетки. Клетка не погибает, а геном фага репродуцируется с геномом клетки. Такая культура бактерий называется лизогенной. ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, сам процесс – лизогенией. Профаги могут спонтанно или под действием индуцирующих агентов (УФ-лучи, митомицин С и др.) Лишь в отдельных клетках лизогенных бактерий фаг размножается и вызывает гибель клеток (умеренный фаг). Профаг может придавать бактерии новые свойства, что получило название фаговой конверсии. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает еѐ способность продуцировать дифтерийный экзотоксин. Бактериофаги получают путем фильтрации материала через бактериальные фильтры. Количество бактериофагов можно определить путем серийных разведений с последующим добавлением их к индикаторным бактериям, выращиваемым на жидкой питательной среде (метод Аппельмана), или выращиваемым на плотной среде в чашках (метод Грациа). Бактериофаги применяют для профилактики, лечения инфекций, в генной инженерии, а также для диагностики. Цель занятия: 1. Изучить особенности строения спирохет, хламидий, риккетсий, нитчатых и дрожжеподобных грибов, простейших, вирусов, в том числе бактериофагов. 2. Познакомиться с лечебно-профилактическими и диагностическими препаратами из бактериофагов. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Морфологию спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир). 2. Морфологию нитчатых и дрожжеподобных грибов. 3. Морфологию простейших (лямблий, трихомонад, токсоплазм, дизентерийной амебы, малярийного плазмодия). 4. Морфологию хламидий, риккетсий и вирусов, в том числе бактериофагов. 5. Получение бактериофагов, титрование, применение в медицине. Уметь: 1. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов в готовых препаратах. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ: Методика окраски спирохет по методу Романовского-Гимзы. Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Для изучения морфологии грибов необходимо на предметное стекло нанести каплю воды, в которую препаровальными иглами вносится и расправляется мицелий грибков; препарат прикрывается покровным стек- лом и рассматривается под сухой системой микроскопа. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла - многоклеточный. У мукора оганы плодоношения представлены в виде большого спорангиеносца с эндоспорами, у аспергилла конидиеносцы несептированные в виде лейки, у пеницилла - септированные в виде кисти рук. Микроскопические методы исследования вирусов. 1. Этапы репродукции многих вирусов можно наблюдать с помощью электронного микроскопа. Однако крупные вирионы (300-400 нм) видны в виде скоплений (элементарные тельца Пашена - при натуральной оспе) даже в обычном световом микроскопе после обработки соответствующих препаратов методом серебрения по Морозову. 2. На отдельных этапах внутритканевого размножения о наличии вирусных особей можно судить по образованию довольно крупных внутриклеточных включений. В этих случаях применяются гистохимические методики, метод электронной и непрямой люминесцентной микроскопии. Так, например, при заболевании бешенством в цитоплазме ганглиозных клеток аммонова рога, мозжечка и продолговатого мозга после окраски (по Манну, Муромцеву или по Туревичу) обнаруживаются цитоплазматические включений – тельца Бабеша- 22 Негри. При натуральной оспе можно выявить внутриклеточные включения, состоящие из больших скоплений белковых компонентов вируса, локализующихся в цитоплазме эпителиальных клеток - тельца Гварниери. Выявление вирусов по цитопатическому эффекту. Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса. ДЕМОНСТРАЦИИ: 1. Приготовление препарата из нитчатых грибов. 2. Препарат-мазок из дрожжеподобных грибов Candida albicans. 3. Схемы морфологии и строения риккетсий и хламидий. 4. Токсоплазмы, малярийный плазмодий в готовых препаратах. 5. Схема строения вирусных частиц. 6. Тельца Бабеша- Негри в мозговой ткани животного, погибшего от бешенства. 7. Схема строения бактериофагов. 8. Титрование бактериофага по Аппельману и по Грациа. 9. Биопрепараты бактериофагов. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Каждый студент готовит по 1 препарату нитчатых грибов, микроскопирует, зарисовывает в альбом. 2. Каждый студент готовит препарат из культуры дрожжевых клеток, окрашивает по Нейссеру, микроскопирует, зарисовывает. 3. Приготовление мазка из риккетсиозного диагностикума. 4. Каждый студент готовит препарат из культуры грибка Candida albicans, окрашивает по Граму (или метиленовой синькой), микроскопирует и зарисовывает. 5. Студенты изучают бакпрепараты из бактериофагов. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Каковы морфологические отличия аскомицет от фикомицет? 2. Чем грибы по морфологии отличаются от бактерий? 3. Какое место в системе микроорганизмов занимают спирохеты? 4. Какие роды спирохет имеют медицинское значение? 6. Какие бактерии относятся к числу облигатных внутриклеточных? 7. Какие свойства указывают на принадлежность риккетсий к бактериям? 8. Какое главное биологическое свойство сближает риккетсий с вирусами? 9. Какова форма риккетсий? 10. Какой механизм обеспечивает внутриклеточное выживание риккетсий? 11. Какие свойства указывают на принадлежность хламидий к бактериям? 12. В чем особенность жизненного цикла хламидий? 13. В чем особенность функциональной организации простейших по сравнению с бактериями? 14. Назовите типы простейших, в которые входят виды, патогенные для человека. 15. Что лежит в основе диагностики протозойных инфекций? 16. Каковы структурные элементы вирионов? 17. Какие биологические свойства отличают вирусы от других микроорганизмов? 18. Какие свойства лежат в основе классификации вирусов? 19. Каким способом размножаются вирусы? 20. Какие изменения могут возникать в клетке в результате заражения ее вирусом? 21. Что такое элементарные вирусные частицы? Как их можно определить? 22. Какие структурные элементы имеет фаговая частица? 23. Чем отличается вирулентный бактериофаг от умеренного? 24. Какие фазы взаимодействия вирулентного фага и бактериальной клетки Вам известны? 25. Что такое явление лизогении? 26. Как измерить количество фаговых частиц в материале? |