Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Цель занятия: 1. Изучить принципы классификации питательных сред, методы выявления культуральных свойств бактерий на различных питательных средах и вирусов в различных условиях культивирования. 2. Освоить технику посевов бактерий на плотных и жидких питательных средах. 3. Начать освоение методики выделения чистых культур аэробов. Учебно-целевые задачи: Знать: 27 1. Метаболизм микроорганизмов. 2. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов. Аутотрофы и гетеротрофы. Фототрофы и хемотрофы. 3. Питательные среды. Механизм переноса питательных веществ в бактериальную клетку. 4. Определение понятий: культура, штамм, клон. Колонии, особенности их формирования у различных видов бактерий. 5. Принципы культивирования различных групп микроорганизмов. Культуральные свойства бактерий. 6. Механизм и скорость размножения микроорганизмов. Фазы размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде в стационарных условиях. Образование микробами пигментов, токсинов, витаминов, аминокислот, полисахаридов и других веществ. 7. Особенности роста и размножения риккетсий, хламидий и вирусов. 8. Методы культивирования бактерий, в том числе облигатных внутриклеточных: (риккетсий, хламидий) и вирусов. Уметь: 1. Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды. 2. Описать культуральные свойства микроорганизмов. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Техника посева бактерий на питательные среды, выделение, идентификация чистых культур бактерий. Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов. Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов. Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры. Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах. При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка). Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера - определению фермента, антигена, чувствительности к фагам. Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. При посеве уколом в столбик желатины наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом. Посев уколом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур. При посеве уколом пробирку с прямым агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают обожженной на пламени платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки Посев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора (рис. 3), проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. 28 Рис. 3. Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний Выделение чистых культур бактерий по методу Дригальского. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. В одну из чашек на питательный агар пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев, после чего чашки помещаются в термостат. В последующем, в извлеченных из термостата чашках в зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии различных бактерий, отличающиеся между собой по форме, цвету, величине, консистенции пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. Отдельную "подозрительную", интересующую исследователя колонию снимают и засевают на косой агар. Из остатка колонии готовят микропрепарат и изучают при окраске по Граму. У выросших на косом агаре бактерий (как правило, одного вида) определяют биохимические, тинкториальные. антигенные свойства и делают заключение о выделенной культуре бактерий. При выделении чистой культуры бактерий по Гольду, внесенной на один из 4-х секторов пластинчатого агара в чашке Петри, материал равномерно штрихами засевается по всему сектору и петля прожигается. Ох- лажденной петлей материал снимается с одного из штрихов первого сектора и переносится во второй, где производится равномерный штриховой посев, аналогичный первому. В третий и четвертый сектор посев делается соответственно из второго и третьего секторов аналогично засеву второго сектора. После инкубации в термостате наиболее густой рост бактерий выявляется в области первых штрихов первого сектора. В каждом последующем секторе выявляется менее густой рост бактерий, чем в предыдущем, или рост отдельных колоний. Отдельную колонию отвивают на косой агар и идентифицируют по тинкториальным, биохимическим, серологическим свойствам. Данный метод применяется в тех случаях, когда одновременно с выделением чистой культуры необходимо определить количество бактерий в исследуемом материале. Определение количества бактерий всех видов в 1 г (1 мл) материала производят по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения. Количество микроорганизмов в 1,0 г = n'a'b, где n - число колоний, выросших на питательной среде; а - коэффициент посевной дозы (при посеве 0.1 мл а=10, при посеве 0,05 мл а=20); b - степень разведения посевного материала. Метод серийных разведений (пластинчатых разводок) по Коху также применяет для определения количества микробов в исследуемом материале, чаще всего в жидких средах. Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Б В Г А 29 ДЕМОНСТРАЦИИ 1. Агар-агар, пептон в порошке, МПБ, МПА. сывороточные среды, желчный бульон, сахарный бульон, кровяной агар, среды Гисса. Эндо, Левина, Клиглера, Левенштейна-Йенсена, среды обогащения (магниевая, селенитовая), среда 199. 2. Демонстрация всех вариантов посевов и пересевов бактерий: с косого агара на косой, с косого агара на бульон, с бульона на бульон с помощью петли и пастеровской пипетки. 3. Демонстрация методов посева для выделения чистых культур по Дригальскому иГольду. 4. Клеточные культуры, чистые и зараженные вирусами. 5. Схемы строения куриного эмбриона. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1. Каждый студент производит пересев с косого агара на косой. 2. Пересев с косого агара на бульон петлей и пастеровской пипеткой (два студента в бригаде). 3. Две бригады студентов из 3-4 человек производят посев взвеси испражнений шпателем по Дригальскому на чашки со средами Эндо и Левина. Две бригады студентов сеют слизь из зева в чашки Петри со средой ЖСА. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ: 1. Каковы основные фазы роста бактериальной популяции в жидкой питательной среде? 2. Какие механизмы поступления питательных элементов в бактериальную клетку? 3. Каким требованиям должны отвечать питательные среды? 4. Какие среды называются элективными, дифференциально-диагностическими, универсальными? Примеры. 5. Что такое чистая культура бактерий? 6. В чем сущность бактериологического метода выделения чистой культуры? 7. В чем сущность биолого-бактериологического метода выделения чистой культуры? 8. Что представляет собой колония бактерий на питательной среде? 9. В чем заключаются культуральные различия разных видов бактерий? 10. В чем заключаются особенности культивирования облигатных внутриклеточных бактерий и вирусов? 11. Назовите методы культивирования хламидий, риккетсий и вирусов? 12. Как проводится индикация роста хламидий, риккетсий и вирусов при их культивировании? 13. Для каких целей применяется метод посева исследуемого материала по Гольду? ЗАНЯТИЕ №6 Темы: Методы выделения чистых культур аэробных бактерий (продолжение). Основные типы биологического окисления субстрата (аэробный и анаэробный). Действие физико-химических факторов на микроорганизмы. Асептика и антисептика План занятия: 1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (2-день). Идентификация: культуральные, морфологические и тинкториальные свойства. 2. Методы культивирования анаэробных бактерий. 3. Методы выделения и идентификации чистых культур анаэробных бактерий 4. Методы стерилизации. Дезинфекция. Вводные замечания. Выделяя чистую культуру микроорганизма, следует обращать внимание на характер роста микроба, т.е. на культуральные особенности как на один из признаков, позволяющий идентифицировать род, вид микроорга- низма. При культивировании микроба на жидких средах, можно видеть рост бактерий в виде: а) диффузного помутнения; б) придонный и пристеночный рост в прозрачной среде; в) образование поверхностной пленки; г) рост в виде «комочка ваты». В полужидких средах можно наблюдать: а) диффузный рост вокруг посева уколом (подвижные бактерии); 30 б) рост по ходу укола (неподвижные бактерии); в) разрыв среды или образование пузырьков газа. На плотных средах: а) рост отдельными колониями; б) рост сплошным налетом. Определение чистоты выделенной культуры Изолированные колонии, выросшие на плотной среде, отсевают бактериологической петлей на поверхность скошенной агаризованной среды в пробирке. Поскольку изолированные колонии иногда могут формироваться не только из отдельных клеток, обязательным этапом выделения чистой культуры должна быть проверка их однородности. Это осуществляется несколькими способами: визуальным, микроскопическим и высевом на соответствующие питательные среды. При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на поверхности скошенной среды; в том случае, если рост неоднороден, считают, что культура загрязнена и требуется ее дополнительная расчистка. При описании колоний бактерий определяют их диаметр в миллиметрах, пигментацию, форму (точечная, круглая, волокнистая, неправильная, ризоидная), высоту, профиль (плоский, высокий, выпуклый), вид края. Край колонии может быть гладким, волнистым, лопастным, зубчатым, волокнистым, складчатым и т. д. Для рассмотрения краев используют микроскоп с малым увеличением. Следует описать также и поверхность колоний, которая бывает гладкой, блестящей, шероховатой, тусклой, неровной, гранулированной матовой, мукоидной, слизистой. Отмечают степень прозрачности колоний (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные) и их консистенцию при проверке иглой: маслянистую, вязкую, сухую. На характеристики колоний могут влиять среда, возраст культуры, условия культивирования. Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать путем микроскопии клеток. Для этого готовят препарат фиксированных окрашенных клеток, который микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки чистых культур микроорганизмов, как правило, однородны по размеру и окраске по Граму. Однако, следует помнить, что колонии, вырастающие из чистой культуры могут быть гладкие (S) и шероховатые ®. Кроме того, в чистых культурах многих бактерий могут появляться кокковидные клетки, цисты, споры. Наконец, многие микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Чистоту культуры клеток проверяют также и путем повторного рассева на селективные среды, обеспечивающие избирательный рост тех или иных микроорганизмов. Критерием чистоты в этом случае является однородность формирующихся при этом колоний. Особенности физиологии анаэробных бактерий Анаэробные микроорганизмы в отличие от аэробов не только не нуждаются для своей жизнедеятельности в кислороде воздуха, но последний, в ряде случаев, для них является даже губительным. Окисление субстрата в бактериальной клетке может осуществляться прямым окислением вещества кислородом воздуха (аэробный путь) или же путем дегидрирования (отнятия от субстрата водорода), что происходит как в аэробных условиях (аэробное дегидрирование), так и в анаэробных (анаэробное дегидрирование). Аэробное дегидрирование при широком доступе кислорода заканчивается окислением субстрата до конечных продуктов, при этом выделяется вся заключенная в субстрате энергия. Но оно может быть неполным, и образующиеся продукты окисления могут содержать еще большее количество энергии. Анаэробное дегидрирование протекает в бескислородной среде. Конечными акцепторами водорода при этом могут быть углерод, азот, сера восстанавливающиеся до СН^, .NH^ , H^S. Высвобождающаяся при этом энергия невелика, но образовавшиеся промежуточные продукты содержат еще значительное количество заключенной в них энергии. И аэробный и анаэробный типы окисления не могут идти без участия определенных ферментов, причем анаэробный путь окисления у микроорганизмов превалирует. Некоторые микроорганизмы способны менять аэробный тип дыхания на анаэробный и обратно - факультативные анаэробы. Другие микроорганизмы способны жить только в отсутствии свободного кислорода - облигатные, т.е. обязательные, анаэробы. Методы создания анаэробных условий. Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается: 1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества; 2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред; 3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы; 4) заменой воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом. 31 В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов. Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по методам Вейнберга и Веньяль-Вейона. Культивировать анаэробы Вейнберг предложил на сахарном агаре столбиком. Агар с глюкозой наливают в пробирку высоким столбиком до 2/3 их объема, охлаждают до 42-45 0 С. Исследуемый материал добавляют в агар, тщательно перемешивают. Пробирку ставят в штатив, питательная среда застывает и внутри нее (особенно в нижней части пробирки) создаются надежные анаэробные условия. Метод Веньяль-Вейона состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один коней трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50 0 С агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Веньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде. Удаление воздуха производят путем его механического откачивания их специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса. Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, СО 2 ) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона. Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na 2 S 2 O 4 |