Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Тема: Инфекция и иммунитет План занятия: 1. Инфекционный процесс, формы его проявления, путипередачи, динамика развития инфекционного процесса. 2. Патогенность и вирулентность микроорганизмов, методы ее выявления и оценки. 3. Методы экспериментального заражения и иммунизации животных. 4. Бактериологическое исследование трупов животных. 5. Неспецифические клеточные и гуморальные факторы защиты организма человека (фагоцитоз, лизоцим, комплемент и др.) методы их изучения и оценки. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Инфекция - эволюционно сложившийся процесс взаимодействиятрехфакторов: патогенных микробов, макроорганизма и окружающейсреды. Крайней степенью выраженности этого взаимодействия является инфек- ционное заболевание. 57 Патогенность микроорганизмов - потенциальная способность вызывать инфекционное заболевание у человека и животного. Это видовой генотипический признак микробов. Несмотря на большое разнообразие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, все они пользуются примерно одинаковыми или сходными молекулярными инструментами для достижения своих целей при развитии инфекционного процесса. Сравнительно недавно установлено, что большая часть генов патогенности располагается на хромосомах отдельными кластерами из функционально связанных групп. Их стали называть «островками» или «островами» (в зависимости от величины) патогенности. Они располагаются на дискретных и часто имеющих чужеродное происхождение участках ДНК, кодирующих группы вирулентных признаков. Мобильность «островов» патогенности связана с тем, что они могут входить в состав ДНК бактериофагов, транспозонов или плазмид и участвовать в горизонтальном переносе генетической информации. Интеграция и экспрессия генов вирулентности лежит в основе формирования новых свойств у родственных непатогенных видов бактерий различных таксономических групп. Вирулентность - это степень патогенности или фенотипическое проявление патогенности. Вирулентность измеряют следующими единицами: DLM (dosis letalis minima) - минимальная смертельная доза микроорганизмов вызывающая гибель 70-80 % подопытных животных определенного вида и массы; DCL (dosis certa letalis) - безусловно смертельная доза,вызывающая 100 % гибель взятых в опыт животных; LD 50 - доза. вызывающая гибель 50% зараженных животных. Патогенность и вирулентность микроорганизмов обеспечивается наличием специальных биологических факторов, образуемых в результате метаболических процессов в бактериальной клетке. Их называют факторами патогенности. Каждый из них ответственен за проявление конкретных свойств микроорганизма в инфекционном процессе: факторы адгезии и колонизации (пили, фимбрии, адгезины) – с их помощью бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и заселяют клетки; факторы инвазии и агрессии (ферменты гиалуронидаза, плазмакоагулаза, фибринолизин, нейраминидаза, лецитиназа, ДНК-за и др.) – благодаря им бактерии проникают в ткани и распространяются; антифагоцитарные факторы – либо маскируют бактерии от фагоцитоза (капсула), либо подавляют фагоцитоз (белок А у стафилококка, белок М у стрептококков, корд-фактор у микобактерий, V-W- антигены у Y.pestis); эндотоксины (липополисахариды и связанные с ними белки клеточной стенки) – имеются у грамотрицательных бактерии, высвобождаются после гибели клетки и обладают воспалительным и пирогенным действием; экзотоксины - токсические микробные протеины, обычно ферменты, секретируемые в окружающую среду, которые убивают клетки хозяина в исключительно малых концентрациях (дифтерия, столбняк, ботулизм и др.). Заражение лабораторных животных проводят с различными целями: а) для моделирования инфекционных заболеваний; б) для выделения чистой культуры возбудителя болезни; в) для определения факторов вирулентности и измерения летальной дозы; г) для проверки качества вакцин и имунных сывороток. Заражение животных производят разными способами (подкожно, внутрикожно, накожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через рот, в мозг, интраорбитально и др.) в зависимости от задач исследования и используемых животных. ИММУНИТЕТ Иммунитет – защита организма от генетически чужеродных веществ (антигенов) экзогенного или эндогенного происхождения с целью сохранения и поддержания гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма. Различают естественный (врожденный) и приобретенный (адаптивный) иммунитет. А) Факторы естественного иммунитета: покровные ткани (кожа, слизистые оболочки); микробоцидные экзосекреты (соляная к-та желудочного сока, бактериоцидные компоненты слюны, литические пищеварительные ферменты кишечника, лизоцим, -лизин и т.п.); сосудистые реакции с целью не пропустить во внутреннюю среду чужеродные агенты (быстрый локальный отек в очаге повреждения); первичный фагоцитоз микробных тел нефтрофилами и макрофагами; естественные клетки-киллеры (NK-клетки); 58 система белков комплемента; белки острой фазы – С-реактивный протеин и маннансвязывающий лектин (МСЛ) цитокины (интерфероны α, β, фактор некроза опухолей, интерлейкины 1, 6; хемокины); липидные медиаторы (простогландины, лейкотриены, фактор активности тромбоцитов); нормальная микрофлора тела человека. Б) Приобретенный (адаптивный) иммунитет осуществляют Т- и В лимфоциты. Основные функции факторов естественного иммунитета: фагоцитоз, опсонизация, активация комплемента, хемотаксис, локальное воспаление, реакции острой фазы, лихорадка. Фагоцитоз, опсонины Фагоцитоз — поглощение фагоцитом корпускул, бактерий или крупных макромолекулярных комплексов. Процесс фагоцитоза усиливают опсонины, обволакивающие объект фагоцитоза. Фагоцитирующие клетки организма подразделяются на макрофаги и микрофаги. Макрофаги – это полиморфноядерные гранулоциты крови: нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Макрофаги различных тканей вместе с моноцитами крови и костного мозга объединены в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Моноциты составляют 5-10 %, а нейтрофилы — 60-70% лейкоцитов крови. Поступая в ткань, моноциты формируют популяцию тканевых макрофагов: купферовские клетки (или звездчатые ретикулоэндотелиоциты печени), остеокласты костной ткани, альвеолярные и интерстициальные макрофаги, микроглия ЦНС. Процесс фагоцитоза. Фагоциты направленно перемещаются к объекту фагоцитоза, реагируя на хемоаттрактанты: вещества микробов, активированные компоненты комплемента (С5а,СЗа) и цитокины. Плазмалемма фагоцита обхватывает бактерии или другие корпускулы и собственные поврежденные клетки. Затем объект фагоцитоза окружается плазмалеммой, и мембранная везикула (фагосома), погружается в цитоплазму фагоцита. Мембрана фагосомы сливается с лизосомой, и фагоцитированный микроб разрушается, рН закисляется до 4,5; активируются ферменты лизосомы. Фагоцитированный микроб разрушается под действием ферментов лизосом, катионных белков дефенсинов, катепсина G, лизоцима и других факторов. При окислительном (дыхательном) взрыве в фагоците образуются токсичные антимикробные формы кислорода — перекись водорода Н 2 0 2 , супероксиданион 0 2 », гидроксильный радикал ОН», синглетный кислород. Кроме этого антимикробным действием обладают окись азота и радикал N0». Защитная роль фагоцитов от инфекционных агентов была впервые обнаружена И.И.Мечниковым. Кроме этого фагоциты (А-клетки) осуществляют презентацию антигенной информации эффекторным клеткам иммунной системы (Т- и В лимфоциты), запуская тем самым реакции иммунного ответа. В заключительную стадию иммунного ответа Т-лимфоциты выделяют цитокины, активирующие макрофаги (приобретенный иммунитет). Активированные макрофаги вместе с антителами и активированным комплементом (СЗЬ) осуществляют более эффективный фагоцитоз (иммунный фагоцитоз), разрушая, фагоцитированные микробы, иногда выступают в роли киллеров. Фагоцитам присуща также секреторная функция, связанная с выработкой монокинов (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей) и других биологически активных веществ, играющих важную роль в иммуногенезе. Фагоцитоз может быть завершенным, в результате гибели захваченного микроба, и незавершенным, при котором микробы не погибают. Примером незавершенного фагоцитоза является фагоцитоз гонококков, туберкулезных палочек и лейшманий. Опсонины (лат. opsonin — усиливающий) — белки, обволакивающие микробы и усиливающие их фагоцитоз. Роль опсонинов выполняют иммуноглобулины, белки острой фазы, липополисахарид- связывающий протеин; компоненты комплемента (СЗЬ, С4Ь), сурфактантные протеины легких SP-A, SP-D. Грамположительные бактерии (стафилококки, стрептококки, пропионибактерии и др.) способны неспецифически адсорбировать гуморальные факторы в виде капсулоподобного покрова. За счет этого они более интенсивно фагоцитируются по сравнению с грамотрицательными бактериями (поэтому ряд авторов не рекомендует для оценки фагоцитоза использовать грамположительные бактерии). Так, стафилококки, обработанные сывороткой крови, неспецифически адсорбируют белки сыворотки (иммуноглобулины, комплемент, альбумин и др.) в виде капсулоподобного покрова, условно названного иммуноглобулиновым покровом. 59 NK-клетки (естественные киллеры) убивают клетки- мишени на основе лектинового распознавания или антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). NK-клетки убивают клетки-мишени, которые (в какой-либо момент) не экспрессируют МНС I. Цитотоксическое действие NK-клеток обусловлено перфоринзависимым механизмом и сходно с действием цитотоксических лимфоцитов. При соединении NK- клетки с Fc-фрагментом антител, прикрепленных к клеткам с чужеродными антигенами, развивается антителозависимая клеточная цитотоксичность и гибель клетки-мишени. Имеются две основные субпопуляции NK: одна из них участвует в антителозависимой клеточной цитотоксичности. Вторая - находится в синусоидах печени. Схожие клетки имеются в матке. Эти клетки убивают любые лимфоциты, которые активируются пищевыми антигенами и антигенами плода, обуславливая толерантность к этим антигенам. Различают также LAK-клетки и Ту5-клетки. LAK-клетка (лимфокин-активированный киллер — lymphokine-activated killer) происходит из небольшой субпопуляции NK-клеток. Она цитотоксична к опухолевым клеткам, особенно под влиянием интерлейкинов (IL2, IL1, IL6, IL15), интерферонов, TNFoc и других цитокинов. LAK-клетки активируют Т-лимфоциты и эозинофилы. LAK-терапию применяют в лечении меналомы и почечной карциномы. Ту5-клетки, или NK-T-клетки, являются небольшой субпопуляцией Т-клеток: возможный аналог NK-клеток. Находятся в барьерных органах и слизистых оболочках. Могут элиминировать возбудителей туберкулеза и оппортунистической инфекции. Комплемент (С) — система сывороточных белков (более 20 компонентов), которые каскадно (цепочкой) активируются при наличии в организме чужеродного антигена. Активация комплемента происходит по классическому, альтернативному и лектинозависимому пути. При активации комплемента образуется мембраноатакующий комплекс (МАК), формирующий трансмембранный канал в мембране клетки. Образовавшиеся фрагменты комплемента являются опсонинами (СЗЬ, С4Ь), участвующими в фагоцитозе и анафилатоксинами (напр., СЗа, С5а), принимающими участие в анафилактических реакциях. Классический путь активации комплемента начинается с присоединения С1 к комплексу антиген— антитело (к Fc-фрагменту антитела), последующим расщеплением С4, С2-компонентов комплемента и образованием СЗ/С5-кон-вертаз (протеаз) классического пути. Альтернативный путь активации комплемента происходит без участия антител, в результате активации антигеном системы комплемента и факторов В, D, Р, Н с образованием СЗ/С5-конвертаз (протеаз) альтернативного пути. Лектиновый путь активации комплемента инициируется маннан-связывающим белком (МСБ) — лектином крови, структурным аналогом Clq. МСБ связывается с маннозой поверхности микробной клетки с последующим расщеплением С4-, С2-компонентов комплемента и образованием СЗ-конвертазы классического пути (С4Ь2а). Мембраноатаиующий комплекс. Активация комплемента заканчивается формированием мембраноатакующего комплекса (МАК), состоящего из С5-, С6-, С7-, С8-, С9-компонентов комплемента, которые внедряются в мембрану клетки и образуют канал диаметром 10 нм. В результате образования многочисленных МАК-комплексов клетки разрушаются. Белки острой фазы воспаления (С-реактивный протеин и маннансвязывающий лектин) появляются в крови при тяжелых, системных воспалительных процессах. Они синтезируются в печени по сигналу цитокинов (TNF, IL-1, IL-6). При острой инфекции их можно определить в течение первых двух дней (когда нет еще антител). В этот ранний период СРП и МСЛ связывают и опсонизируют бактерии для фагоцитоза или активируют комплемент. Эндогенные пептиды – антибиотики – новое направление исследований в изучении факторов естественного иммунитета. Пептиды-антибиотики состоят из 13-80 аминокислот, синтезируются эукариотическими клетками и обладают способностью убивать бактерии. В настоящее время известно более 400 наименований пептидов- антибиотиков. Они обнаружены в клетках растений, насекомых, лягушек, а также млекопитающих животных (кроликов, свиней, коров) и человека. Цель занятия 1. Изучить особенности и динамику развития инфекционного процесса, формы его проявления, пути передачи. 2. Изучить патогенность и вирулентность микроорганизмов, методы выявления и оценки. 3. Освоить основные методы экспериментального заражения бактериологического исследования трупов животных. 60 4. Изучить виды и формы иммунитета. 5. Изучить неспецифические механизмы защиты организма. Фагоцитоз. Учебно-целевые задачи: Знать: 1. Определение понятия «инфекция».Общая характеристика инфекционного процесса. 2. Понятия: патогенность и вирулентность. Факторы патогенности. 3. Определение понятия «иммунитет». Общая характеристика иммунной системы и ее основные функции. 4. Неспецифические факторы защиты организма: клеточные (фагоцитоз, естественные киллеры), гуморальные (система комплемента, интерфероны, лизоцим, белки острой фазы, противовирусные ингибиторы и др.). Уметь: 1. Дать оценку значимости инфекционного процесса. 2. Провести бактериологическое исследование трупа лабораторных животных. 3. Дать оценку значимости неспецифических факторов защиты организма. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Для оценки доиммунных биологических механизмов резистентности к инфекции изучают: 1) содержание лизоцима, интерферона, комплемента, цитокинов в биологически активных средах (сыворотка, слюна, ликвор, слезная жидкость и т.д.) 2) фагоцитарную реакцию клеток крови, лимфатических узлов, селезенки и др. лемфоидных органов. Содержание лизоцима в слюне или сыворотке крови определяют методом титрования с использованием культуры Micrococcus lysodeikticus. Лизис бактерий можно наблюдать по просветлению или измеряя спектрофотометрическим методом изменение оптической плотности микробной взвеси после инкубации ее с разведениями лизоцима. Содержание комплемента сыворотки крови определяют методом титрования по 50% гемолизу. Метод основан на комплементзависимом лизисе нагруженных антителами эритроцитов барана. За единицу активности комплемента принимается такое количество комплемента, которое вызывает 50% гемолиз в стандартных условиях. Отдельные компоненты системы комплемента определяют иммунохимическими методами при помощи моноклональных сывороток. Экспериментальное заражение животных и бактериологическое исследование трупов. 1. Студенты отрабатывают различные методы заражения лабораторных животных: накожный методы (кролик, морская свинка), внутрикожный метод, подкожный, внутривенный (вена уха кролика, ретроорбитальное пространство у мышей), внутрибрюшинный метод. Знакомятся с правилами фиксации животных, осваивают правила асептики и антисептики. 2. Для обнаружения микроба, вызвавшего гибель животного, определения его локализации в организме производят вскрытие трупа мышки, зараженной накануне В. anthracoides. 3. Мышь фиксируют брюшком вверх на дощечку булавками за 4 лапки. 4. Шерсть животного протирается ватой, смоченной дезраствором или спиртом. 5. Делают срединный разрез кожи, осматривают брюшину, лимфоузлы. 6. Вскрывают брюшную полость, макроскопически изучают органы брюшной полости,отмечая их внешние изменения. 7. Готовят мазки-отпечатки из органов брюшной полости (селезенка, печень, почки) берут орган пинцетом, срезают кусочек ножницами и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу. 8. Вскрывают грудную полость, осматривают органы грудной полости, фиксируя их внешние изменения. 9. Готовят мазки-отпечатки из легочной ткани. 10. Стерильной пастеровской пипеткой после прижигания поверхности сердечной мышцы берут кровь из сердца и делают посев на сахарный бульон и готовят мазок на стекле. 11. Мазки-отпечатки, приготовленные на стекле, высушивают, фиксируют в жидком фиксаторе и окрашивают по Граму. 12. При микроскопии мазков необходимо обнаружить В. аthracoides и сделать заключение о форме инфекционного процесса и вирулентности возбудителя. Данные вскрытия заносятся в протокол. 61 Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток Фагоцитоз с латексом. 1. Кровь из пальца 0,1 мл с гепарином помещаем в центрифужную пробирку и добавляем 0,1 мл латекса (Латекс - 10% полистерольная опалесцерующая суспензия с размером частиц 1,5 мкм). Пробирку инкубируем в термостате 37 С в течение 30 мин. Каждые 10 мин инкубации пробирку встряхиваем. 2. Центрифугирование 5 мин. Надосадочная жидкость отбирается пипеткой, а из осадка делаем мазок на предметном стекле, высушиваем на воздухе, фиксируем этиловым спиртом и окрашиваем по Романовскому- Гимзе. 3. Учет результатов: в иммерсионном микроскопе (увеличение 630) подсчитываем процент фагоцитирующих клеток - фагоцитарный показатель (вычисляем количество фагоцитирующих клеток на 100 лейкоцитов). Далее определяем среднее количество поглощенных частиц латекса на 1 клетку (фагоцитарное число - фагоцитарный индекс). У здоровых людей ФП - 40-80%, а ФЧ - 6-9 частиц на 1 фагоцит (при размере частиц латекса 1,5 мкм). |