Микра методичка. Методические указания к практическим занятиям по микробиологии с иммунологией и вирусологией для студентов
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
Фагоцитоз с культурой стафилококка. Реактивы - пирогенал (стимулятор фагоцитоза), гепарин, суточная культура стафилококка, краситель Романовского-Гимзе Постановка опыта: 1. Кровь из пальца 0,2 мл помещаем в первую пробирку с гепарином и во вторую пробирку, куда добавляем 0,1 мл пирогенала для стимуляции фагоцитоза (стимулированный фагоцитоз - ФС). В каждую из пробирок добавляем суточную культуру стафилококка в объеме 0,05 мл (стандарт мутности - 1 млрд). 2. Инкубируем пробирки в термостате 30 мин, центрифугируем, отбираем надосадочную жидкость. 3. Из осадка делаем мазок, высушиваем, фиксируем этиловым спиртом, окрашиваем по Романовскому-Гимзе. 4. Учет результатов при иммерсионной микроскопии (увеличение 630): 1 пробирка: Спонтанный фагоцитоз - учет результатов через 30 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс. Завершенный фагоцитоз - учет результатов через 120 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс. Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) определяется как отношение фагоцитарного индекса 30 мин к фагоцитарному индексу 120 мин (ИЗФ= ФИ 30 мин/ФИ 120 мин ) Если ИЗФ более 1, то это указывает на завершенный характер фагоцитоза. Если ИЗФ менее 1, это указывает на незавершенный характер фагоцитоза. 2 пробирка: Стимулированный фагоцитоз (в присутствии пирогенала). После инкубации и центрифугирования из осадка готовим мазки, которые высушиваем, фиксируем и окрашиваем аналогичным способом. В мазках подсчитываем фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза через 120 мин. Стимуляция пирогеналом может привести к завершенности фагоцитоза. Эти данные необходимо учитывать при коррекции иммунодефицитных состояний. Изучение функционального состояния фагоцитов по кислородному метаболизму ( метод хемилюминесценценции ) 1. Из периферической крови выделяем взвесь лейкоцитов (нейтрофилов). 2. Во флаконы для сцинтилляционного счета добавляем раствор Хенкса и люминол (люминол обладает свойством окисляться под влиянием кислородных метаболитов и генерировать квант света (длина волны 425 nm). 3. Во флаконы вносим суспензию нейтрофилов, перемешиваем и помещаем в счетную камеру для регистрации фонового показателя хемилюминесценции. 4. Через 45-60 мин во флаконы вносим суспензию зимозана или латекса и снова измеряем хемилюминесценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 60 мин. Далее делаем пересчет импульсов на 1 клетку и выражаем хемилюминесценцию условно в импульс/минута/клетка. Результат хемилюминесценции оценивается по максимальному значению (пик А) на кинетической кривой. 62 сцинтилляционный -спектрометр Для постановки опыта нужен жидкостный (хемилюминометр) и специальные стеклянные флаконы для сцинтилляционного счета. ДЕМОНСТРАЦИЯ: 1. Гемолитическая активность стафилококков на кровяном агаре. 2. Лецитиназная активность стафилакокков на ЖСА. 3. Реакция плазмокоагуляции. 4. ДНК-азная активность микробов. 5. Реакция титрования лизоцима слюны с тест-микробом Micrococcus lysodeikticus. 6. Мазки гноя с незавершенным фагоцитозом (от больных острой гонореей). 7. Мазки из культуры Klebsiella pneumoniae с капсулой (окраска по Бурри-Гинсу) ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 1. Освоение методов экспериментального заражения животных 2. Провести бактериологическое исследование мышей, погибших от экспериментальной инфекции. Заполнить протокол вскрытия. 3. Приготовить мазки-отпечатки из органов мышей, окрасить их по Граму, промикроскопировать, обнаружить в мазках-отпечатках возбудителя, сделать выводы. 4. Изучить по готовым демонстрациям факторы патогенности микробов. 5. Микроскопия готовых мазков с фагоцитозом латекса. 6. Микроскопия мазков гноя от больных с гонореей. 7. Определение титра лизоцима в слюне в реакции титрования. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Понятие "инфекция", "инфекционное заболевание". Условия возникновения. Формы проявления: местная, генерализованная инфекция. 2. Что такое рецидив, реинфекция, суперинфекция? 3. Что такое смешанная инфекция, вторичная инфекция? 4. Что такое бактериемия, септицемия, септикопиемия, токсинемия? 5. Что такое бактерионосительство? 6. Понятие "патогенность" и "вирулентность". Единица измерения вирулентности, методы определения. 7. Периоды динамика инфекционного процесса. 8. Токсины микробов. Экзо- и эндотоксины, их природа, характеристика, отличия. 9. Факторы патогенности у микробов: инвазивность, ее материальная основа; адгезия. Защита от фагоцитоза. 10. Экспериментальная инфекция. Цели и задачи. Способы заражения животных. 11. Защитные механизмы и факторы естественной резистентности: барьерные и бактерицидные свойства кожи, слизистых оболочек, значение нормальной микрофлоры. 12. Лизоцим, комплемент, его свойства, роль в естественной резиД.-тентности. 13. Бактерицидность выворотки крови и факторы ее обеспечивающие: В-лизины. система пропердина. нормальные антитела. 14. Фагоцитоз как клеточный неспецифический защитный фактор. Виды фагоцитов, стадии фагоцитоза. Незавершенный фагоцитоз. 15. Постановка опыта фагоцитоза, определение активности и завершенности реакции. Опсоно-фагоцитарная реакция. 16. Вскрытие и бактериологическое исследование трупа животного, погибшего от экспериментальной инфекции. Для педиатрического факультета: 17. Реактивность новорожденных и детей первых месяцев жизни, отличие от реактивности взрослых. 18. Состояние факторов естественной резистентности у детей раннего возраста. ЗАНЯТИЕ 12 (рубежный контроль по разделу « Физиология микроорганизмов») 63 ЗАНЯТИЕ №13 (коллоквиум) Темы: Система иммунитета организма человека. Антигены. Антитела. Специфические формы иммунного ответа. План занятия: 1. Органы иммунной системы: центральные и периферические. Лимфоидные и вспомогательные клетки: Т- и В-лимфоциты, субпопуляции Т- и В-лимфоциты, макрофаги (А-клетки). 2. Специфические формы иммунного ответа: синтез антител, клеточный иммунитет, реакции гиперчувствительности, иммунологическая память и толерантность. 3. Понятие о межклеточной кооперации в иммуногенезе. Медиаторы иммунного ответа (цитокины, лимфокины, интерлейкины). 4. Антигены: полноценные, неполноценные (гаптены). Антигены бактерий и вирусов. Антигены групп крови, аутоантигены, опухолевые, эмбриоспецифические, трансплантационные антигены человека. 5. Антитела (иммуноглобулины). Химическая структура, функция. Классы иммуноглобулинов. Неполные антитела. Динамика и механизм образования антител. 6. Феноменология взаимодействия антигена с антителом. Практическое значение реакций антиген-антитело в лабораторной аналитике. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ Система иммунитета – это совокупность клеток, органов и тканей, осуществляющих реакции приобретенного (адаптивного) иммунитета. Факторами клеточного иммунитета являются: В-лимфоциты, Т- хелперы (Thl, Th2), цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры), иммунные фагоциты; гуморального - антитела (иммуноглобулины). Формы иммунного реагирования: 1. Антителообразование 2. Иммунный фагоцитоз 3. Киллерная функция лимфоцитов 4. Аллергические реакции (ГНТ, ГЗТ) 5. Иммунологическая память 6. Иммунологическая толерантность Главный элемент системы иммунитета – лимфоциты – популяция клеток, морфологически относительно однородны, но гетерологичны в функциональном отношении и по своим поверхностным маркерам. Они способны отличать собственные структуры организма от генетически чужеродных и элиминировать последние, включая для этого механизмы иммунного ответа. Все клетки крови, в том числе и лимфоциты, возникают из единой гемопоэтической стволовой клетки, которая находится у эмбрионов в костном мозге и печени, а у взрослых только в костном мозге. В процессе дифференцировки на мембранах системы иммунитета появляются макромолекулы гликопротеинов (CD-антигены - cell differentiation antigens или cluster definition – антигены кластеров дифференцировки клеток). Они специфичны для определенной стадии развития. В настоящее время их известно более 200. CD-антигены, а также различные рецепторы на поверхности лимфоцитов используются в качестве маркеров для их идентификации. Развитие и созревание лимфоидной ткани у новорожденных происходит под влиянием микроорганизмов нормальной микрофлоры, заселяющей слизистые оболочки. У экспериментальных животных - гнотобионтов, выращенных в стерильных, безмикробных условиях, тимус и другие лимфоидные органы остаются недоразвитыми. Различают центральные и периферические органы иммунной системы, в которых развиваются, созревают и дифференцируются клетки иммунной системы. Центральные органы иммунной системы — костный мозг и тимус. Кроветворный костный мозг — место рождения всех клеток иммунной системы и созревания В- лимфоцитов. Тимус (вилочковая железа) отвечает за развитие Т-лимфоцитов. В тимусе отбираются Т- лимфоциты (CD4 и CD8) и уничтожаются высокоавидные к собственным антигенам клетки. Гормоны тимуса завершают функциональное созревание Т-лимфоцитов, повышают секрецию ими цитокинов. 64 Периферическими лимфоидными органами следует считать селезенку, лимфоузлы, миндалины, пейеровы бляшки, циркулирующие лимфоциты крови, лимфоидная ткань, ассоциированная с кожей, со слизистыми оболочками желудочно-кишечного, респираторного и мочеполового трактов В центральных органах начинается процесс созревания лимфоцитов (в основном без влияния антигенов), в периферических органах в присутствии антегенов заканчивается дозревание лимфоцитов. Антигены проникают из просвета кишки в пейеровы бляшки через эпителиальные клетки (М-клетки). Существует два класса лимфоцитов: Т-лимфоциты, прошедшие дифференцировку в тимусе, и В-лимфоциты - созревающие в костном мозге. Т-лимфоциты осуществляют реакции клеточного типа, обеспечивая защиту от внутриклеточных и грибковых инфекций, внутриклеточных паразитов, опухолевых клеток и чужеродных трансплантатов. В-лимфоциты осуществляют гуморальный иммунитет, вырабатывая антитела, направленные чаще всего против внеклеточных бактерий, вирусов и чужеродных белков. Помимо лимфоцитов, в иммунных реакциях участвуют и другие типы клеток, в частности, макрофаги, дендритические клетки, выполняющие вспомогательные функции. Они захватывают попавший в организм антиген, перерабатывают его, подготавливая таким образом для контакта с лимфоцитами. Т-лимфоциты (тимусзависимые. лимфоциты) дифференцируются в тимусе. Т-лимфоциты имеют антиген-распознающий рецептор — TcR (Т-клеточный рецептор). TcR распознает антигенный пептид, свя- занный с МНС антиген-презентирующих клеток (АПК). В результате, при действии костимулирующих факторов, клетки дифференцируются в Т-хелперы или цитотоксические Т-лимфоциты. Важными корецепторными взаимодействиями между Т-лимфоцитом и антиген-презентирующей клеткой являются, так называемые, Т-регуляторные (Т-рег.) клетки (CD28 — CD80 и CD154 (CD40L) — CD40). Т-хелперы (Th — от helper— помощник) имеют Т-клеточный рецептор (TcR) и корецептор CD4, которые участвуют в распознавании комплекса антигенный пептид + МНС II класса антиген-презентирующих клеток. Нативные Т-хелперы под действием различных факторов дифференцируются на Thl и Th2: Thl- лимфоциты отвечают за стимуляцию клеточного иммунитета; Тh2-лимфоциты — за стимуляцию гуморального иммунитета. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ или Т-киллеры) имеют Т-клеточный рецептор (TcR) и корецептор CD8, которые участвуют в распознавании комплекса антигенный пептид + МНС I класса Активированные, дифференцированные цитотоксические Т-лимфоциты вызывают гибель клеток-мишеней в результате контакта и участия перфорина, гранзимов, Fas-рецепторов (CD95) и факторов некроза опухолей. К реакциям клеточного типа относятся инфекционная аллергия, отторжение трансплантатов, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ). В-лимфоциты дифференцируются в костном мозге (или в бурсе — фабрициевой сумке, находящейся в клоаке птиц). Выполняют роль АПК и, после преобразований (в результате связывания антигена) В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела. В-лимфоциты получают антиген при его рецептор-опосредованном поглощении или от фолликулярных дендритных клеток (FDC), несущих иммунные комплексы антиген-антитело. В-лимфоциты экспрессируют следующие молекулы: 1) Антиген-распознающий В-клеточный рецептор (BcR), представленный главным образом мембранными иммуноглобулинами — мономерами mlg M, mlg D; 2) Ко-рецепторный комплекс мемб- ранных молекул [CD19/CR2 (CD21)/TAPA-1], связанных с системами внутриклеточного проведения сигналов; 3) BcR-ассоциированные молекулы [Igoc (CD79a) и Ig(3 (CD79b)], необходимые для сигнальной трансдукции; 4) Ко- стимулирующие молекулы (CD80, CD40 и др.) для дополнительных стимулов и переключения синтеза разных изотипов антител; 5) Адгезивные молекулы (ICAM-3 и др.) для контакта клеток. Иммунный ответ: гуморальный, клеточный Иммунный ответ происходит в результате взаимодействия (кооперации) дендритных клеток, макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, цитокинов. Различают гуморальный и клеточный иммунный ответ. Презентация антигена, кооперация иммунокомпетентных клеток Презентация (presentation) - представление антигена Т-лимфоцитам осуществляется в результате следующих процессов: поглощения антигена антиген-презентирующей клеткой (АПК); расщепления его внутри клетки ферментами; связывания образующихся антигенных пептидов с молекулами МНС («загрузка» антигенных пептидов в желобки собственных молекул МНС I, II класса); выхода их на поверхность клетки для контакта с Т-лимфоцитами. Антиген распознают рецепторы В- и Т-лимфоцитов. Профессиональными антигенпрезентирующими, (АПК) для лимфоцитов являются дендритные клетки, В-лимфоциты и макрофаги. Роль АПК могут также выполнять эндотелиальные клетки, юные бласты, кератиноциты и некоторые другие клетки, способные при активации экспрессировать МНС и цитокины. 65 Дендритные клетки (DC) (отростчатые, ветвистые клетки) - основные представители антигенпрезентирующих клеток (АПК). Они активируют наивные Т-лимфоциты при первом контакте их с антигеном. Дендритные клетки костномозгового происхождения находятся в слизистых оболочках и коже (клетки Лангерганса, или белые отростчатые эпидермоциты). Они более активны, чем макрофаги, в индукции имунного ответа. Захватив и переработав антиген, DC перемещаются в регионарные лимфоидные образования, тимуезависимые зоны (в виде интердигитальных клеток), где с помощью молекул МНС презентируют антиген Т- лимфоцитам. В тимусе имеются интердигитальные медуллярные клетки, являющиеся антигенпрезентирующими клетками. Дендритные клетки некостномозгового происхождения — фолликулярные дендритные клетки (FDC — Follicular Dendritic CeLL) находятся в первичных и вторичных фолликулах лимфоузлов, селезенки и лимфоидной ткани слизистых оболочек. Они несут на поверхности иммунные комплексы антиген-антитело (без поглощения) и презентируют антиген В-лимфоцитам с помощью антительного Fc-рецептора (FcyR) и рецептора к комплементу (CR1, CR2), связанных с мембраной FDC. Фолликулярные дендритные клетки не имеют молекул МНС II. Во вторичных В-клеточных фолликулах лимфоидной ткани обнаружены дендритные клетки центров размножения. Они имеют молекулы МНС II, могут мигрировать и взаимодействовать с Т- лимфоцитами. Антиген-распознающие рецепторы В- и Т-лимфоцитов Антигенраспознающий В-клеточный рецептор В-лимфоцитов (BcR — англ. B-cell Receptor) построен из молекулы мембранного иммуноглобулина (mlg, состоящий из двух одинаковых тяжелых Н-цепей и двух одинаковых легких L-цепей) и двух молекул CD79 (Iga, Igp). Мембранные иммуноглобулины представлены мономерными mlgM и mlgD. BcR имеет трансмембранные и внутрицитоплазматические сегменты, пе- редающие внутриклеточные сигналы. Антигенраспознающий Т-клеточный рецептор Т-лимфоцитов (TcR — англ. T-cell Receptor) имеет две формы — оф и у8, которые соединены в мембране клетки с молекулой CD3. Димеры ар и уб, так же как молекулы иммуноглобулина, имеют V- и С-домены. TcR совместно с корецепторами CD8 или CD4 распознает комплекс антиген-пептид + МНС первого (I) или второго (II) класса антиген-презентирующие клетки. В иммунном ответе клетки взаимодействуют при межклеточном контакте мембранами и с помощью цитокинов. Различают следующие молекулы межклеточной адгезии: селектины, муциноподобные адрессины сосудов, интегрины, кадгерины, хоминговые рецепторы и молекулы из суперсемейства иммуноглобулинов. Thl-хелперы CD4 + распознают на поверхности длительно инфицированных макрофагов микробные пептиды в комплексе с МНСII класса. Происходит активация макрофагов и гибель внутриклеточных микробов. Селектины — молекулы (рецепторы) поверхности лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов, взаимодействующие с лигандами (муциноподобными молекулами адрессинов CD34, GlyCAM-1 и MAdCAM-1) эндотелия сосудов. Участвуют в остановке клеток для их миграции через эндотелий сосудов. Интегрины — молекулы поверхности Т-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, нейтрофилов, взаимодействующие с молекулами клеточной адгезии, фрагментами комплемента или с компонентами внеклеточного матрикса. Суперсемейство иммуноглобулинов представлено молекулами, сходными (по доменам) с иммуноглобулинами: молекулы МНС I и II классов, Т-клеточный рецептор, молекулы CD2, CD3, CD4, CD8, ICAM, VCAM, LFA-1 и некоторые Fc-рецепторы. Кадгерины — кальцийзависимые адгезивные молекулы. Хоминговые рецепторы — молекулы, ответственные за попадание лимфоцитов в лимфоидную ткань. Гуморальный иммунный ответ (антителообразование). Основой гуморального иммунного ответа является активация В-лимфоцитов и их дифференцировка в антителообразующие плазматические клетки — плазмациты (Р). Иммуноглобулиновый рецептор В-лимфоцитов (BcR) распознает антиген и клетка поглощает его. После процессинга (расщепления поглощенного антигена до низкомолекулярных пептидов и встраивания их в МНС II класса) В-лимфоциты представляют образовавшийся комплекс Тп2-хелперам, которые взаимодействуют с ним рецептором TcR и корецептором CD4. Тп2-хелперы экспрессируют СD40-лиганд (CD40L, или CD154). Последний связывается с CD40 на В-лимфоците и клетки активируются комплексом CD40+CD40L. Происходит пролиферация В-лимфоцитов. Под влиянием интерлейкинов (IL-4, 5, б, 10 и др.), образуемых Тh2-хелперами происходит переключение иммуноглобулиновых генов В-лимфоцитов, которые синтезируют иммуноглобулины различных классов. Указанная схема характерна для обычных лимфоцитов В-2 (CD5"). Другая популяция В- лимфоцитов, обозначаемая В-1 (CD5 + ), находится в лимфоидных образованиях слизистых оболочек, кожи и секретирует преимущественно IgM, участвуя в антибактериальном иммунитете. |