практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
 Скачать 1.34 Mb.
|
|
Раздел 7. Водно-минеральный обмен. Значение изучаемой темы: Вода обязательный спутник жизни: нет ни одного известного нам организма, который мог бы обходится без нее. Большое количество воды внутри и вне клеток указывает на необходимость ее для процессов жизнедеятельности организма. Функции клеток зависит от общего количества внутриклеточной и внеклеточной воды, от обводнения субклеточных структур, от водного микроокружения макромолекул. Нарушение водного баланса клеток организма приводит к тяжелым последствиям, вплоть до гибели организма. С обменом воды тесно связан минеральный обмен. Минеральные вещества вместе с водой создают среду, в которой протекают все обменные процессы в клетках. С минеральными веществами связаны все биоэлектрические и электрофизиологические явления в организме. Минеральные вещества обеспечивают осмотическое давление. Нарушение минерального обмена приводит к тяжелым последствиям. 7.1. Методы исследования водно-минерального обмена. Для определения натрия и калия в плазме и эритроцитах крови используют два основных метода, это: 1. Пламенная фотометрия. Пламенная фотометрия представляет собой один из видов эмиссионного спектрального анализа, основанного на фотометрировании излучения элементов в пламени и позволяет определять их концентрацию с точностью до 2-4 %. Принцип метода заключается на способности ряда элементов испускать лучи света определенной длины волны в пламени газовой горелки. Натрий и калий способны интенсивно излучать свет в низкотемпературном пламени. Возникающее в пламени излучение определяемого элемента определяется посредством светофильтров от излучения других элементов и, попадая на фотоэлемент, вызывая фототок, интенсивность которого измеряется гальванометром. Натрий окрашивает пламя в ярко-желтый цвет. Калий – слабый красно-фиолетовый. 2. Ионометрический метод. Метод ионометрического определения натрия и калия, состоит в измерении электрохимического потенциала ионоселективного электрода, погруженного в исследуемый раствор. Электрическая схема потенциометра включает в себя электрод сравнения (потенциал которого известен) и индикаторный (ионоселективный) электрод, потенциал которого измеряется. Значение потенциала индикаторного электрода позволяет судить об активности присутствующих в растворе ионов: калия, натрия, кальция. Для определения других электролитов (кальция, хлоридов, магния, железа) обычно используют методы: 3. Колориметрический метод: основан на образовании цветных соединений электролитов с различными реактивами. 4. Титриметрический метод. Данный метод имеет основной недостаток - индикаторный переход не всегда удается зафиксировать точно. 5. Ферментативный колориметрический метод. 7.2. Преаналитический этап исследований водно-минерального обмена. При исследовании минерального обмена необходимо соблюдать следующие условия:
Практическая работа. 7.3. Определение калия в сыворотке крови. Цели занятия: - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать функции и распределение минеральных веществ в организме, регуляцию натрия и калия в организме, клинико-диагностическое значение определения калия в сыворотке крови; - Уметь определять содержание калия в сыворотке крови. Принцип метода: ионы К+ в присутствии ионов свинца меди и нитрита образуют нерастворимый в воде осадок, который растворяют в смеси риванола и уксусной кислоты. Оптическая плотность полученного раствора, прямопропорциональна количеству нитрит-ионов. Содержание калия находят используя постоянный коэффициент, рассчитанный исходя из соотношения нитрит-ионов и К+ в образовавшемся соединении.
Ход определения: В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл раствора ацетата натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,5 мл раствора №3. Содержимое пробирок перемешивают стеклянной палочкой, потирая о внутренние стенки пробирки в течение 5 минут. Оставляют на 1 час, после чего центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 1 мл ацетата натрия, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Аналогичное промывание осадка ацетатом натрия проводят до исчезновения голубизны осадка. Затем к осадку приливают 1 мл риванола и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь перемешивают и количественно переносят в колбу на 25 мл, и доводят до метки дистиллированной водой. Колориметрируют при 540 нм в кювете на 10 мм против воды. Рассчитывают результат по формуле: С, мг/% = Е * 36 Нормальные величины: в сыворотке – 14 – 24 мг/% в эритроцитах – 310 – 440 мг/% Клинико-диагностическое значение определения калия в сыворотке крови. Калий – основной внутриклеточный катион. 98% калия находится в клетках. В основном калий содержится в мышцах и печени. Суточная потребность составляет – 2.5 – 5.0 г. В течение суток поступает с пищей до 6г. Физиологическое значение:
В регуляции обмена калия участвует альдостерон, усиливающий его выделение с мочой. В норме содержание калия в плазме крови составляет 3,6 – 5,4 ммоль/л. Снижение ее до уровня 3,5 ммоль/л приводит к тяжелым нарушениям в организме человека: слабости мышц, появлению вялых параличей, прекращению перистальтики кишечника, вздутию живота. Увеличение концентрации калия в плазме выше 5,6 ммоль/л сопровождается ощущением «ползания мурашек», «одеревенения конечностей», нарушением ритма сердца. Может наступить остановка деятельности сердца, паралич дыхательных мышц. Гиперкалиемия наблюдается при:
Гипокалиемия наблюдается при:
Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
Практическая работа 7.4. Определение хлоридов в сыворотке крови. Цели занятия - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать классификацию минеральных веществ организма, клинико-диагностическое значение определения хлоридов в сыворотке крови; - Уметь определять содержание хлоридов в сыворотке крови. Принцип метода: в присутствии ионов хлора в кислой среде тиоцианат образует тиоцианат-ионы, образующие окрашенный комплекс с железом (+3). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации хлоид-ионов в пробе.
Ход определения.
Реакционную смесь тщательно перемешивают и через 5 минут опытную и калибровочную пробу фотометрируют против контрольной в кюветах на 5 мм при длине волны 460 – 490 нм. Расчет концентрации хлоридов проводят по формуле: Хлорид (ммоль/л) = 100 * Еопыт/Екалибровки Нормальные величины (сыворотка крови): 97 – 108 ммоль/л Клинико-диагностическое значение определения хлоридов в сыворотке крови. Хлрид-ион – основной внеклеточный анион плазмы крови, компенсирующий влияние катионов. Присутствует в виде солей калия, натрия, кальция и магния. Вместе с перечисленными катионами анионы хлора являются наиболее важными осмотически активными ионами плазмы крови, лимфы, спиномозговой жидкости, клеточного содержимого. Показатели нормы содержания хлорид-ионов в плазме крови составляют 95,0 – 110,0 ммоль/л. Гиперхлоремия отмечается при:
Гипохлоремия отмечается при:
Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
6*.Регуляция обмена натрия, калия, хлора. Практическая работа 7.5. Определение кальция в сыворотке крови. Цели занятия: - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать функции кальция в организме, регуляцию кальция в организме, клинико-диагностическое значение определения кальция в сыворотке крови; - Уметь определение содержания кальция в сыворотке крови. Принцип метода: ионы кальция в кислой среде образуют с индикаторным реактивом Арсеназо-III комплекс синего цвета. Степень изменения окраски пропорциональна содержанию кальция и определяется фотометрически.
Ход определения.
Перемешивают и оставляют стоять на 2 минуты при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность пробы (Е1) и стандарта (Е2) против рабочего раствора, при длине волны 620 - 660 нм, в кювете на 5 мм. Расчет проводят по формуле: Кальций (ммоль/л)= 2.5 * Еопыта/Естандарта Нормальные величины (сыворотка крови) – 2.25 – 2.75 ммоль/л Предупреждение: Лабораторная посуда, применяемая при определении кальция, должна быть совершенно чистой. После обычного мытья посуду следует поместить на ночь в 2% раствор Комплексона 3 в аммиачной воде, потом тщательно промыть дистиллированной водой и высушить. Клинико-диагностическое значение определение кальция в сыворотке крови. Кальций является внутриклеточным катионом, около 99% Са содержится в костях. Физиологически активным является ионизированный кальций, постоянно обнаруживаемый в плазме крови. Ионы кальция необходимы для передачи нервного импульса, поддержания мышечного сокращения, свертывания крови, контроля за протеканием некоторых ферментативных реакций. В норме концентрация общего кальция в сыворотке крови составляет 2,0 – 2,8 ммоль/л. Исследование сыворотки крови: посуда, используемая для выполнения анализа, должна быть изготовлена из материала, не содержащего ионов кальция. Взятие пробы необходимо производить натощак, а сыворотку быстро отделять от сгустка. Гиперкальциемия наблюдается при:
Гипокальциемия наблюдается при:
Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
5*. Назовите основные заболевания, связанные с нарушением обмена кальция, объясните механизм. Практическая работа 7.6. Определение фосфора в сыворотке крови. Цели занятия: - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать функции фосфора в организме, регуляцию фосфора в организме, клинико-диагностическое значение определения фосфора; - Уметь определять содержание фосфора в сыворотке крови. Принцип метода: неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую кислоту, которая реагирует с малахитовым зеленым с образованием комплекса зеленого цвета, стабилизированного в растворе наличием детергента. Оптическая плотность комплекса при 630 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в обазце.
Ход анализа.
Пробы тщательно перемешивают и через 10 минут определяют оптическую плотность при длине волны 630 нм против холостой пробы в кювете с толщиной 5 мм. Окраска устойчива в течении 2 часов. Расчет проводят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика: Для построения калибровочного графика из калибровочного раствора и дистиллированной воды готовят следующие разведения:
Нормальные величины: 0.8 – 1.6 ммоль/л (в плазме). Клинико-диагностическое значение определения фосфора в сыворотке крови. Фосфор – элемент, обмен которого тесно связан с метаболизмом кальция. Встречается главным образом в виде анионы РО-34. Принимает участие в обеспечении организма энергией. 80 – 85% фосфора входит в состав скелета, остальное количество распределено между тканями и жидкостями организма. Фосфор участвует в образовании нуклеиновых кислот, нуклеотидов, фосфолипидов. В норме содержание неорганического фосфора в сыворотке крови составляет 0,65 – 1,3 ммоль/л. Повышение концентрации неорганического фосфора – гиперфосфоемия - наблюдается при:
Снижение концентрации неорганического фосфора – гипофосфоемия - наблюдается при:
Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
4*. Дайте характеристику основным заболеваниям, связанным с нарушением обмена фосфора (болезнь Педжета, остеопороз, остеомаляция, рахит). Практическая работа 7.7. Определение магния в сыворотке крови. Цели занятия: - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать функции магния в организме, клинико-диагностическое значение определения магния в сыворотке крови; - Уметь определить содержание магния в сыворотке крови. Принцип метода: в щелочной среде Магон реагирует с ионами магния с образованием комплекса красного цвета оптическая плотность которого прямопропорциональна содержанию ионов магния в исследуемом материале.
Подготовка реактивов: Раствор 1 – содержимое одной ампулы с реактивом 1 количественно растворяют в 50 мл реактива 2. раствор можно употреблять лишь через 30 минут после приготовления. Реактив устойчив при 2-8 0С 1 неделю. Раствор 2 – реактив 3 точно разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 9, раствор содержит 0,823 ммоль/л. реактив устойчив 1 месяц при комнатной температуре. Ход определения.
Перемешиваем и оставляем при комнатной температуре на 15 минут. Затем измеряем оптическую плотность опыта (Д1) и калибровки (Д2) против контрольного раствора при 490-520 нм в кюветах на 5 мм. Расчет результатов: С магния, ммоль/л = 0,823 * Д1 / Д2. Нормальные величины: 0,7 – 1,07 ммоль/л. Клинико-диагностическое значение определения магния в сыворотке крови. Магний – внутриклеточный катион, 1/3 его сосредоточена в костях, зубах, мышцах. Среднесуточное поступление с пищей составляет 300 – 400 мг. Физиологическое значение:
Концентрация в плазме в норме составляет – 0.8 – 1.5 ммоль/л. Гипермагнемия сопровождается появлением сонливости, угнетением дыхательного центра, нарушения проводимости миокарда, блокады и остановки сердца; отмечается при:
Гипомагнемия проявляется обезвоживанием артерий, нарушением свертываемости крови, повышению артериального давления, снижению микроциркуляции в капиллярах. Дефицит магния вызывает нарушение всех энергозависимых процессов, уменьшение синтеза белков; отмечается при:
Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
Практическая работа 7.8. Определение железа в сыворотке крови. Цели занятия - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать функции железа в организме, клинико-диагностическое значение определения железа в сыворотке крови; - Уметь определять содержание железа в сыворотке крови. Принцип метода: железо освобождается из железо-связывающих белков сыворотки крови и восстанавливается при действии кислого рабочего раствора, содержащего восстановитель и детергент. Затем, после добавления буфера для создания в реакционной смеси необходимого рН (4,5 –4,8) и феррозина, образуется устойчивый окрашенный комплекс, оптическая плотность которого при 570 нм пропорциональна концентрации железа.
Ход определения.
Перемешивают и выдерживают 10 минут, измеряют оптическую плотность опытной (Д2) и калибровочной проб (Дк) при 560 нм против холостой в кювете на 1 см. Расчет колическтва железа проводят по формуле: С = 35,8 * (Д2 – Д1) / Дкалибровки. Нормальные величины: 10 – 27 мкмоль/л. Клинико-диагностическое значение определения железа в сыворотке крови. Железо относится к внутриклеточным микроэлементам. Является постоянной составной частью гема гемоглобина и окислительно-восстановительных ферментов. Некоторое количество железа постоянно обнаруживается в плазме крови в виде комплекса с белком – трансферрином. Входит в состав ферритина. В норме концентрация сывороточного железа у мужчин составляет 14,3 – 25,1 мкмоль/л, у женщин – 10,7 – 21,5 мкмоль/л. Увеличение содержания сывороточного железа происходит при:
Уменьшение концентрации железа в сыворотке крови отмечается при:
Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
4*. Опишите основной обмен железа в организме. 5*. Патология обмена железа, как она проявляется, чем сопровождается? Практическая работа
Цели занятия: - Усвоить представление о диагностическом значении определения электролитов в плазме крови; - Знать транспорт железа в организме, клинико-диагностическое значение определения ОЖСС сыворотки крови. - Уметь определять железо-связывающую способность сыворотки крови . Принцип метода: в щелочных условиях к сыворотке добавляется избыток ионов железа, которые специфически связываются с белками сыворотки. При добавлении феррозина образуется окрашенный комплекс, с максимумом поглощения при 560 нм, оптическая плотность которого пропорциональна концентрации оставшегося несвязанного железа. Разница между добавленным к сыворотке известным количеством железа и определенным в виде железоферрозинового комплекса соответствует железосвязывающей способности сыворотки (ЖСС). Общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) определяется как сумма ЖСС и количество железа в сыворотке.
Ход определения.
Расчет ЖСС проводят по формуле: ЖСС = 89,5 *(Дкалиб – Д2 + Д1) / Дкалиб Нормальные величины: Мужчины – 45 – 75 мкмоль/л Женщины – 40 – 67 мкмоль/л Клинико-диагностическое значение определения ЖСС. Железо транспортируется в виде комплекса с металлсвязывающим глобулином – трансферрином. Обычно этот белок переносит такое количество железа, которое соответствует 1/4 -1/3 максимальной способности трансферрина к связыванию этого иона. Поэтому в норме процент насыщения железом трансферрина составляет 25 –30%. ОЖСС повышается при:
ОЖСС снижается при:
О запасах железа в организме можно судить по определению в плазме крови ферритина. Концентрация ферритина плазмы крови 1 мкг/л соответствует содержанию 8 мг железа в организме. Нормальные величины концентрации ферритина в сыворотке крови (мкг/л): у новорожденных – 25 –200; 6 месяцев – 12 лет – 7 – 140; взрослых мужчин – 15- 200; взрослых женщин – 12 –150. Задание для самостоятельной работы:
Ответьте на вопросы:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||