|
практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
Высаливание – основано на удалении водной оболочки различными концентрациями солей щелочных и щелочно-земельных металлов и иона аммония. Это старый метод разделения белков.
Аминокислотный состав белков и пептидов после гидролиза определяют в аминокислотном анализаторе.
Определение количества белка по белковому азоту – пробу сжигают в присутствии серной кислоты и перекиси водорода (окислитель), при этом происходит минерализация белка в виде сульфата аммония, количество которого потом определяют реактивом Несслера.
Использование цветных реакций – например биуретовая на общий белок, ксантопротеиновая на циклические аминокислоты и т.д. интенсивность окраски измеряют колориметрически.
Иммунологические методы – используют для количественного определения индивидуальных белков. При взаимодействии со специфической антисывороткой образуется мутный раствор, интенсивность помутнения измеряют колориметрически.
Преаналитический этап исследования обмена белков.
Для характеристики обмена белков можно определять различные показатели (общий белок, белковые фракции, мочевину, билирубин и т.д.) в цельной крови (капиллярной и венозной), сыворотке, плазме, моче, спиномозговой жидкости. При заборе, хранении и транспортировке биологического материала нужно соблюдать ряд общих требований.
Подготовка обследуемых:
Забор крови делают утром с 8 до 10 часов утра. В экстренных случаях взятие крови осуществляется в любое время дня.
Кровь берут натощак, после 8-12-часового голодания.
Воздержание от приема алкогольных напитков не менее 24 часов.
Исключается физическое напряжение.
Получение и хранение биологического материала:
Для исследований используют чистую сухую посуду без следов моющих средств.
Желтушные, гемолизированные, хилезные сыворотка или плазма не пригодны для исследования.
Для получения плазмы венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку с антикоагулянтом. Соли ЭДТА, гепарин, гепаринат лития, оксалат натрия, цитраты снижают результаты. Центрифугирование проводят в обычном режиме не позднее 5 часов от забора материала.
Для получения сыворотки крови венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку. Центрифугирование проводят в обычном режиме не позднее 5 часов от забора материала.
Для исследования мочи используют утреннюю порцию. В экстренных случаях можно исследовать любую порцию мочи. Исследование проводят не позднее, чем через 2 часа после взятия пробы.
Условия хранения биологического материала:
Биологический материал хранят в хорошо закрытых контейнерах.
Цельная кровь не пригодна для хранения, даже в присутствии консервантов.
Плазму и сыворотку можно хранить 1 день при комнатной температуре, 7 дней при 4-8С, от 3 до 6 месяцев при –20 С.
В закрытых сосудах белок стабилен в моче 2 дня при комнатной температуре, до 17 дней в холодильнике (4-8 С).
Примечания:
уровень общего белка может зависеть от возраста (у детей и пожилых ниже), пола (у мужчин выше), характера питания.
Повышение белков в крови вызывают следующие факторы: длительное пребывание в вертикальном положении, стресс, прием алкоголя, некоторые лекарственные препараты (цефотаксим, фуросемид, фенобарбитал, преднизалон, прогестерон).
Понижение уровня белков в крови вызывают: травма, курение, беременность, голодание, перерыв в приеме алкоголя, нарушение питания, ожирение, некоторые лекарственные препараты (декстран, ибупрофен, пероральные контрацептивы).
4.3. Практическая работа
«Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции».
Цели практической работы:
закрепить знания о строении, свойствах и функциях белков в организме;
научиться исследовать содержание общего белка в сыворотке крови.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип метода.
Метод основан на образовании окрашенных комплексных соединений меди при взаимодействии пептидных группировок молекул белков с биуретовым реактивом.
Опыт № 1. Построение калибровочного графика для определения общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции.
Реактивы.
Раствор альбумина плацентарного 10 %.
Раствор натрия хлористого 0.9 %.
Биуретовый реактив
|
Оборудование.
ФЭК с кюветой на 1 см
Пробирки 5 шт.
Пипетки на 0.5 мл, 1 мл, 5 мл
|
Ход работы:
Приготовить контроль - к 50 мл биуретового реактива прибавляют 0.1 мл 0.9 % раствора хлористого натрия, смешивают, избегая образования пены. Через 30 минут (не позднее чем через 1 час) измеряют оптическую плотность.
Из калибровочного раствора белка готовят калибровочные растворы, как указано в таблице.
№
|
Калибровочный раствор белка, мл
|
0.9% раствор хлористого натрия, мл
|
Концентрация белка, г/л
|
1
|
0.4
|
0.6
|
40
|
2
|
0.6
|
0.4
|
60
|
3
|
0.8
|
0.2
|
80
|
4
|
1.0
|
-
|
100
|
Из каждого разведения берут 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл биуретового реактива.
Через 30-60 минут измеряют на ФЭКе оптическую плотность всех проб против контроля в кювете 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр). По полученным данным строят калибровочный график.
Опыт № 2. Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом.
Реактивы.
1. Раствор альбумина плацентарного 80 г/л.
2. Раствор натрия хлористого 0.9 %.
3. Биуретовый реактив.
Сыворотка или плазма крови.
|
Оборудование.
1. ФЭК с кюветой на 1 см
2. Пробирки 5 шт.
3. Пипетки на 0.5 мл, 1 мл, 5 мл.
|
Ход определения:
Проведите определение общего белка в сыворотке крови в соответствии с таблицей.
Реактивы.
|
Опытная проба, мл.
|
Калибровочная проба, мл.
|
Холостая проба, мл.
|
Биуретовый реактив.
|
5
|
5
|
5
|
Сыворотка.
|
0,1
|
-
|
-
|
Калибровочный раствор.
|
-
|
0,1
|
-
|
Физраствор.
|
-
|
-
|
0,1
|
Содержимое пробирок перемешать и оставить стоять для развития окраски на 30 минут при комнатной температуре.
Измерить оптические плотности опытных и калибровочных проб против холостой пробы не позднее чем через 60 минут. Измерения проводить при длине волны 540-560 нм в кювете на 1 см.
Расчет результатов провести по формуле:
С = Ск * Ео / Ек
Где:
С - концентрация белка, г/л.
Ск – концентрация калибровочного раствора альбумина (80 г/л).
Ео – оптическая плотность опытной пробы.
Ек – оптическая плотность калибровочной пробы.
Расчет можно проводить по калибровочному графику.
Примечание:
При содержании белка в исследуемой пробе больше 120 г/л, сыворотку развести физраствором в соотношении 1 : 1, а полученный результат умножить на 2.
Норма общего белка в сыворотке и плазме крови 65 – 85 г/л, у детей до 6 лет 56-85 г/л.
Клинико-диагностическое значение определения общего белка.
Гипопротеинемии (снижение уровня общего белка в крови) встречаются:
при недостатке белковой пищи (голодании, недоедании);
сужении пищевода, нарушениях работы ЖКТ (например, воспалительного характера - при энтеритах);
воспалительных процессах печени, при которых подавляется биосинтез белка (цирроз печени, интоксикации);
врожденные нарушения в синтезе отдельных белков (анальбуминемия, болезнь Вильсона-Коновалова);
при повышенном распаде белков (ожоги, злокачественные опухали, гиперфункции щитовидной железы);
при беременности и лактации;
при увеличении количества воды в кровеносном русле (например, при уменьшении диуреза, прекращении выделения мочи), внутривенном введении большого количества глюкозы, выделение в кровь большого количества антидиуретического гормона гипоталамуса.
Гиперпротеинемия (увеличение уровня общего белка в крови) бывает 2 видов:
Абсолютная гиперпротеинемия(не связанная с нарушением водного баланса) - встречается редко. Значительное возрастание концентрации общего белка (до 120 г/л) встречается при миеломной болезни. Менее выраженная гиперпротеинемия отмечается при хроническом полиартрите.
Относительная гиперпротеинемия (вызвана уменьшением содержания воды в русле крови) возникает из-за потери жидкости организмом больных, страдающих тяжелыми ожогами, генерализованным перитонитом, непроходимостью кишечника, неукротимой рвотой, поносом, несахарным диабетом, хроническим нефритом. Она может отмечаться при усиленном потоотделении.
Ответьте на вопросы:
Что понимают под определение «общий белок крови»?
Расскажите о строении белков.
Расскажите о свойствах белков.
Почему растворы белков устойчивы?
*Почему белки способны двигаться в электрическом поле? Ответ поясните на примере пептида МЕТ – ТРИ – ИЗОЛЕЙ – ПРО - АРГ.
*Что такое изоэлектрическая точка? Ответ поясните на примере пептида АРТ – ЦИС – ФЕН – АСП.
4.4. Практическая работа
«Определение альбумина в сыворотке крови
по биуретовой реакции».
Цели практической работы:
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
При добавлении к пробам сыворотки крови эталонного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) определенной концентрации альбумин, в отличии от других белков, не подвергается осаждению, оставаясь в подкисленном спиртовом растворе, что позволяет установить его содержание методом, основанном на биуретовой реакции.
Реактивы.
Изотонический раствор.
0,2 н раствор едкого натра.
Биуретовый реактив.
Стандартный раствор альбумина.
Спиртовой раствор ТХУ.
|
Оборудование:
Центрифуга.
ФЭК с кюветами на 1 см.
Пробирки.
Центрифужные пробирки.
Пипетки на 1, 5 и 0,1 мл.
Стеклянная палочка.
|
Ход определения:
В центрифужную пробирку вносят 0,75 мл раствора ТХУ и 0,25 сыворотки крови, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут при комнатной температуре.
Центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин.
0,2 мл центрифугата (должен быть совершенно прозрачным) переносят в другую пробирку и добавляют 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.
Параллельно определяют содержание общего белка, для чего к 0,1 мл сыворотки добавляют 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.
Пробы оставляют для окрашивания на 30 - 60 минут.
Фотометрируют при зеленом светофильтре 540-560 нм (546 нм) в кювете на 1 см. В качестве контроля берут биуретовый реактив.
Расчет.
Расчет ведут по калибровочной кривой. Для его построения из основного раствора белка готовят рабочие стандартные растворы.
Стандартный раствор белка, мл
|
Изотонический раствор, мл
|
Концентрация альбумина, г/л
|
0,2
|
0,8
|
20
|
0,3
|
0,7
|
30
|
0,4
|
0,6
|
40
|
0,5
|
0,5
|
50
|
0,6
|
0,4
|
60
|
0,7
|
0,3
|
70
|
На основании построенной кривой находят фактор пересчета F (для этого концентрацию делят на экстинцию F = C / А).
Для определения количества альбумина применяют формулу:
С (г/л) = Аоп * F * 2
Норма альбумина в сыворотке крови 35-55 г/л.
Клинико-диагностическое значение определения альбуминов в крови.
Альбумины - это простые белки (протеины) плазмы крови, которые определяют большую часть онкотического давления, участвуют в обезвреживании и транспортировке и жирных кислот, холестерина, билирубина, лекарственных веществ, образую с ними водо-растворимые комплексы. Альбумины сравнительно легко обновляются в организме. Основным местом их синтеза является печень.
Гипоальбуминемия (снижение концентрации альбумина в крови) - наблюдается при:
Голодании;
воспалительных заболеваниях;
циррозе печени;
злокачественных опухолях;
кровотечениях;
после удаления желудка;
выхода белка из русла крови: в просвет кишечника – при завороте кишок, перитоните; на ожоговую поверхность – при обширных ожогах; с мочой – у больных, страдающих нефротическим синдромом (для которых характерно повышенное выделение почками альбумина и некоторых других белковых фракций);
остром и хроническом гломерулонефрите, почечной недостаточности, лейкозах.
При падении уровня альбуминов ниже 30 г/л, «освободившаяся» вода перемещается из сосудов в более плотные ткани, вызывая отеки.
Гиперальбуминемия (возрастаниеуровня альбумина в крови) практически не встречается, а если и обнаруживается, то она, как правило, вызывается уменьшением содержания воды в кровеносном русле (дегидратацией), гемоконцентрацией и внутривенном введении больших количеств концентрированных растворов альбумина.
Ответьте на вопросы:
Расскажите о строении, свойствах альбуминов.
Перечислите функции альбуминов.
На каком свойстве альбуминов основано их определение в сыворотке крови?
При каких заболеваниях уровень альбуминов изменяется? Почему?
*Напишите строение пептида АЛА – ТРИ – ЦИС – ЛЕЙ. Какой зарад будет у него в водном растворе? Как он будет двигаться а электрическом поле? В какой среде он будет достигать изоэлектрической точки?
4.5. Практическая работа
«Определение белковых фракций
экспресс-методом в сыворотке крови».
Цели практической работы:
закрепить знания о составе и функциях белковых фракций крови;
изучить понятие о диспротеинемии и парапротеинемии;
научиться исследовать содержание белковых фракций в сыворотке крови.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе.
Зарисуйте протеинограммы схематично в виде графиков.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Метод основан на том, что растворы фосфатного буфера определенной концентрации осаждают с образованием очень мелких хлопьев различные фракции белков.
Реактивы:
Основной фосфатный буфер.
Рабочий раствор фосфатного буфера А.
Рабочий раствор фосфатного буфера Б.
Рабочий раствор фосфатного буфера В.
Рабочий раствор фосфатного буфера Г.
|
Оборудование:
Пробирки - 6 шт.
Пипетки на 0.5 мл, 1 мл, 5 мл
ФЭК с кюветой на 1 см.
|
Ход определения.
0,5 мл сыворотки крови, 0.75 мл воды, 3.75 мл основного фосфатного буфера вносят в пробирку, хорошо перемешивают.
Пять пробирок нумерую.
В нумерованные пробирки вносят по 0,5 мл полученной смеси.
В пробирку № 1 вносят 5 мл рабочего раствора А.
В пробирку № 2 вносят 5 мл рабочего раствора Б.
В пробирку № 3 вносят 5 мл рабочего раствора В.
В пробирку № 4 вносят 5 мл рабочего раствора Г.
В пробирку № 5 (контроль) вносят 5 мл воды.
Осторожно чтобы не образовалась пена, перемешать содержимое пробирок (перевернуть 5-6 раз) и оставить стоять при комнатной температуре на 15 минут.
Через 15 минут колориметрировать на ФЭКе пробирки № 1,2,3 и 4 против контроля в кювете 1 см при красном светофильтре.
Расчет количества белковых фракций проводят по формулам:
А = Е1 – Е2) / Е1 * 100%
А2 = Е2 – Е3) / Е1 *100%
В2 = Е3 – Е4) / Е1 *100%
Г = Е4 / Е1 * 100%
Где:
Е1 - экстинция пробирки № 1, указывает на содержание всех белковых фракций.
Е2, Е3, Е4 – экстинции соответственно 2, 3 и 4 пробирок.
А – содержание альбуминов, %.
А2 – содержание альфа-глобулинов, %.
В2 – содержание бетта-глобулинов, %.
Г – содержание гамма-глобулинов, %.
Норма белковых фракций в крови:
Альбумины - 52-76.7 % или 35-55 г/л.
Глобулины а1 - 3.5-6.0 % .
а2 - 6.9-10.5 %.
вся фракция альфа-глобулинов 10.4-16.5 % или 8-12 г/л.
бетта-глобулины - 7.3-12.5 % или 3-11 г/л.
гамма-глобулины 12.8-19 % или 11-13 г/л.
Клинико-диагностическое значение определения белковых фракций в сыворотке крови.
При многих заболеваниях на фоне нормальной картины общего белка крови, наблюдаются изменения в уровне концентрации отдельных белковых фракций, т.е. диспротеинемии. По изменению содержания отдельных фракций можно судить о направленности сдвигов входящих в их состав индивидуальных белков, а также о заболевании и ходе его лечения.
Альфа-1- и альфа-2-глобулины включают в себя белки «острой фазы» (они повышаются при острых воспалительных процессах, травмах, аллергических и стрессовых состояниях). Их количество в крови возрастает при многих острых, подострых и хронических воспалительных процессах, в том числе:
пневмонии;
туберкулезе легких (эксудативном);
острых инфекциях;
остром ревматизме;
остром полиартрите;
сепсисе;
злокачественных опухолях;
острых некрозах.
Бетта-глобулины увеличиваются в крови при:
злокачественных новообразованиях;
тяжелой форме туберкулеза легких;
инфекционном, токсическом гепатите, желтухе.
Гамма-глобулины увеличиваются при хронических воспалительных процессах:
в суставах (ревматоидный артрит);
лоханках почек (пиелит);
почках (нефрит);
желчном и мочевом пузыре (холецистит, цистит);
инфекционном гепатите, токсическом поражении печени, механической желтухе;
тяжелых формах туберкулеза легких и ряде др. заболеваний.
Протеинограммы.
Заболевания.
|
Альбумины.
|
Альфа-глобулины.
|
Бетта-глобулины.
|
Гамма-глобулины.
|
Острые инфекционные процессы.
|
Снижение.
|
Сильно увеличены.
|
Норма.
|
Повышение.
|
Хронические воспалительные процессы.
|
Снижение.
|
Норма.
|
Норма.
|
Сильно увеличены.
|
Нефриты, нефрозы.
|
Сильное снижение.
|
Повышение.
|
Повышение.
|
Снижение.
|
Гепатиты, гемолит-е процессы.
|
Снижение.
|
Норма.
|
Сильно увеличены.
|
Повышение.
|
Механическая желтуха.
|
Снижение.
|
Повышение.
|
Сильно увеличены.
|
Повышение.
|
Ответьте на вопросы:
на основе чего белки крови разделены на фракции?
Какие функции выполняют фракции белков крови? Приведите конкретные примеры.
Почему альфа-глобулины называют белками острой фазы?
При каких заболеваниях происходит возрастание количества гамма-глобулинов?
Что такое диспротеинемии и парапротеинемии?
Почему белковые фракции можно разделить методом электрофореза?
На каком свойстве белков основано определение белковых фракций экспресс-методом?
4.6. Практическая работа
«Определение С-реактивного белка (СРБ)».
Цели практической работы:
закрепить знания о белках острой фазы и их клиническом значении;
научиться исследовать содержание СРБ в крови.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип.
Для определения СРБ используется антисыворотка, которая в присутствии СРБ образует преципитат.
Реактивы:
Антисыворотка к СРБ.
Исследуемая сыворотка или серозная жидкость.
|
Оборудование:
Капилляры Панченкова.
Штатив (брусок пластилина).
|
Ход определения:
Капилляр Панченкова опустить в флакон с антисывороткой к СРБ и заполнить на 1/3 высоты.
Протереть конец капилляра ватой.
Опустить капилляр в исследуемый материал и заполнить на 1/3 высоты (между реагентами не должно быть воздуха).
Тщательно перемешать содержимое капилляра, покачивая его 10-12 раз и перемещая жидкость из одного конца к другому.
Погрузить конец капилляра в штатив (брусок пластилина) таким образом, чтобы конец капилляра был на 10-15 мм свободен от жидкости. Погружать следует, осторожно поддерживая капилляр в горизонтальном положении, а штатив – вертикально.
Оставляют стоять штатив при комнатной температуре.
Предварительный учет результатов проводят через 4 часа, окончательно учитывая через 24 ч.
Учет результатов:
Выпадение преципитата (хлопьев, осадок) в капилляре указывает на наличие СРБ в исследуемом материале.
Преципитат высотой 1 мм оценивается как (+) – реакция слабо положительная; 2 мм (++) и 3 мм (+++) – реакция положительная; 4 мм и более (++++) – реакция резко положительная.
Количество преципитата учитывают по всему капилляру.
Реакция не специфична, но может служить признаком активности воспалительного процесса.
Клинико-диагностическое значение определения С-реактивного белка.
СРБ в сыворотке здоровых людей обычными методами не обнаруживается. Проба на СРБ становиться положительной в остром периоде многих воспалительных заболеваний, при злокачественных новообразованиях. Так положительные результаты наблюдаются при инфаркте миокарда, ревматизме, системной красной волчанке, инфекционном неспецифическом полиартрите, нефрите, лимфогранулематозе.
Ответьте на вопросы:
Какие белки относятся к белкам острой фазы?
Почему белки острой фазы так называются?
В чем заключается клинико-диагностическое значение белков острой фазы?
На каком принципе основано определение СРБ в сыворотке крови?
4.7. Практическая работа
«Определение мочевины в биологических жидкостях».
Цели практической работы:
закрепить знания о превращениях и конечных продуктах распада белков в организме;
получить представления об азотистом балансе, остаточном азоте, азотемии;
научиться исследовать содержание мочевины в биологических жидкостях.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Опыт № 1. Определение мочевины в биологических жидкостях неферментативным методом.
Принцип метода.
Метод основан на том, что мочевина образует с диацетилмоноксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс, который фотометрируют.
Реактивы.
Эталон мочевины.
Диацетилмоноксим (яд!)
Состав реакционной смеси:
-диацетилмоноксим 5,0 ммоль/л;
-тиосемикарбазид 0,9 ммоль/л;
-кислота серная 0,9 ммоль/л;
-соль железа трехвалентного 25,0 мкмоль/л.
Дистиллированная вода.
Сыворотка крови.
|
Оборудование.
Пробирки - 3шт.
Пипетки на 0,01 мл и 2,00 мл.
Фольга.
Кювета на 1 см.
ФЭК.
Водяная баня.
|
Ход определения:
В пробирки вносят необходимые реактивы в следующих соотношениях.
Реактивы.
|
Проба, мл.
|
Эталон, мл.
|
Контрольный раствор, мл.
|
1. Сыворотка или разведенная моча.
|
0,01
|
-
|
-
|
2. Реактив 1.
|
-
|
0,01
|
-
|
3. Дист. вода.
|
-
|
-
|
0,01
|
4. Реактив 2.
|
2,00
|
2,00
|
2,00
|
Смеси перемешивают.
Отверстие пробирки закрываю алюминиевой фольгой, и нагревают на кипящей водяной бане точно 10 минут.
Содержимое пробирок быстро охлаждают в токе холодной воды.
До 15 минут измеряют оптическую плотность пробы (А1) и эталона (А2) против контрольного раствора. Измерения проводят при длине волны 490-540 нм в кювете 1 см.
Расчет количества мочевины проводят по формуле:
С мочевина = 16,65 * А1 / А2 (ммоль/л)
Опыт № 2. Определение мочевины в биологических жидкостях ферментативным методом.
Принцип:
Метод основан на том, что уреаза специфично гидролизует мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. Выделенный аммиак определяют фотометрически по окрашенному продукту реакции.
Реактивы:
Раствор 1 (уреаза).
Раствор 2 (хромоген).
Раствор 3 (натрия гипохлорит).
Стандарт мочевины 10,0 ммоль/л.
Биологическая жидкость.
|
Оборудование:
ФЭК с кюветой на 5 мм.
Термостат.
Штатив с пробирками.
Фильтровальная бумага.
|
Ход определения:
Проведите исследование количества мочевины в соответствии с таблицей.
Реактивы.
|
Опыт, мл.
|
Стандарт, мл.
|
Контроль, мл.
|
Сыворотка или моча.
|
0,02
|
-
|
-
|
Стандарт мочевины.
|
-
|
0,02
|
-
|
Раствор 1.
|
0,50
|
0,50
|
0,50
|
Смеси перемешиваю и инкубируют 10 минут при 37С в термостате.
|
Раствор 2.
|
1,00
|
1,00
|
1,00
|
Раствор 3.
|
1,00
|
1,00
|
1,00
|
Смеси перемешать и инкубировать 5 минут при 37С.
|
Измеряют оптическую плотность опытной (Ео) и стандартной (Ес) проб против контроля при длине волны 590 нм в кювете на 5 мм. Окраска стабильна несколько часов.
Расчет количества мочевины проводят по формуле:
С мочевины = Ео / Ес * Сст (ммоль/л)
Нормальные величины содержание мочевины.
В сыворотке крови 2,5-8,3 ммоль/л.
В моче 333-583 ммоль/л.
Предупреждение.
Мочу перед анализом разводят дист. водой в соотношении от 1:50 до 1:100 (результат умножают на разведение).
При содержании мочевины свыше 23 ммоль/л пробу разводят дист. водой и анализ проводят повторно, а результат умножают на разведение.
При определении мочевины в гемолитических или липемических сыворотках пробу необходимо депротеинировать, например 5 % раствором трихлоруксусной кислоты. В пробирке смешивают 0,10 мл пробы с 1,00 мл раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют. Точно также разбавляют и эталонный раствор мочевины. Для собственно анализа отмеривают 0,10 мл надосадочной жидкости. Далее определение проводят как при анализе без депротеинизирования. Таким же способом можно анализировать цельную кровь.
Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей. При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница нормальных величин содержания мочевины в сыворотке крови может быть повышена даже до 10 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение определения мочевины.
Увеличение содержания мочевины в крови наблюдается при:
усиленном её образовании в результате богатого белками рациона питания, чрезмерного катаболизма белка, лейкозов, желтухи, тяжелых инфекционных заболеваний, непроходимости кишечника, ожогов, дизентерии, шока;
уменьшении выведения с мочой при ретенционной почечной азотемии, ретенционной внепочечной азотемии (острой почечной недостаточности, опухолях мочевыводящих путей, предстательной железы, почечно-каменной болезни, недостаточности деятельности сердца);
кровотечении из верхних отделов желудочно-кишечного тракта;
приеме некоторых лекарств - сульфаниламидов, левомецитина, тетрациклина и других.
Снижение содержания мочевины в крови наблюдается при:
особенно тяжелых поражениях печени, в частности при отравлении фосфором, мышьяком, декомпенсированном циррозе;
голодании;
пониженном катаболизме белков;
после введения глюкозы;
после гемодиализа.
Увеличение экскреции мочевины с мочой наблюдается при:
злокачественной анемии (вследствие отрицательного азотистого баланса);
лихорадке;
после приема лекарственных препаратов (салицилатов, хинина и др.);
гиперпротеиновой диете;
гиперфункции щитовидной железы;
в послеоперационный период.
Уменьшение экскреции мочевины с мочой наблюдается при:
нефрите, уремии;
нарушении функции почек;
нефропатии беременных;
паренхиматозной желтухе (вследствие нарушения образования мочевины);
острой дистрофии печени;
прогрессирующем циррозе печени;
приеме анаболитических гормонов (положительный азотистый баланс).
Ответьте на вопросы:
Дайте определение понятиям азотистый баланс, остаточный азот, резидуальный азот, азотемии.
Назовите причины и виды азотемии.
Почему при поражениях ССС концентрация мочевины в крови увеличивается? К какому виду азотемии относиться это изменение?
Для диагностике каких заболеваний чаще всего исследуют уровень мочевины в крови и моче?
Что такое выделительная способность почек?
Как уровень мочевины может служить диагностике нарушений выделительной способности почек?
4.8. Практическая работа
«Определение креатинина в сыворотке крови методом Яффе».
Цели практической работы:
закрепить знания об остаточном азоте крови, азотемии;
научиться исследовать содержание креатинина в сыворотке крови.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
В щелочной среде креатинин образует с пикриновой кислотой комплексное соединение желто-красного цвета (реакция Яффе). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации креатинина в исследуемой пробе.
Реактивы:
Дистиллированная вода.
Реагент 1. Вольфрамат натрия, 10 % раствор.
Реагент 2. Серная кислота, 0,33 моль/л,
Реагент 3. Пикриновая кислота, 0,04 моль/л.
Реагент 4. Гидроксид натрия, 0,75 моль/л.
Реагент 5. Калибровочный раствор креатинина, 10 мг/л (88,4 мкмоль/л).
Сыворотка или моча.
|
Оборудование:
Центрифужные пробирки – 1 шт.
Химические пробирки – 3 шт.
Пипетки на 0,5 мл; 1,0 мл; 2,0 мл.
ФЭК с кюветой на 5 мм.
Термостат.
Центрифуга.
Секундомер.
Штатив.
| |
|
|
Скачать 1.34 Mb.