|
|
практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
4.8. Практическая работа
«Определения гликозилированного гемоглобина
в венозной и капиллярной крови”
Цели практической работы:
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Метод основан на аффинной хроматографии гликозилированной и негликозилированной фракций гемоглобина в гемолизате крови. Используемый в микроколонках набора сорбент с привитой 3-аминофенилборной кислотой обеспечивает на первой стадии специфическое связывание гликозилированного гемоглобина и его отделение от негликозилированной фракции. На второй стадии происходит полная элюция гликозилированной фракции за счет вытеснения с сорбента сорбитолом.
Измерение оптических плотностей обеих фракций при длине волны 414 им позволяет рассчитать относительное содержание гликозилированного гемоглобина в анализируемой пробе.
Реактивы:
Рабочий буферный раствор 1.
Рабочий буферный раствор 2.
Регенерирующий раствор (уксусная кислота, 10%).
Вода дистиллированная;
Контрольный образец гликозилированного гемоглобина.
Цельная кровь.
|
Оборудование:
Пластиковые микроколонки.
Фотоэлектроколориметр.
Штатив для пробирок.
Пипетки на 0,02 и 5,0 мл.
Пробирки химические на 5 мл.
Емкость для воды (кастрюля, поддон) на 2-5 л;
Бумага фильтровальная;
Перчатки резиновые хирургические.
|
Ход определения:
1. Подготовительные операции.
Поместить колбу с рабочим буферным раствором 1 в емкости с воды (температура воды 25 С) и выдержать в течение 15 мин при периодическом перемешивании.
Промаркировать по 2 стеклянных пробирки для каждого анализируемого образца крови (А и Б).
Вставить микроколонку в пробирку А и выдержать в течение 15-20 минут при комнатной температуре.
2. Проведение анализа образцов крови.
В микроколонку внести 5,0 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь.
После полного стекания жидкости в микроколонку влить 0,1 мл цельной крови.
Выдержать 1 -2 мин.
Затем в микроколонку внести 0,1 мл рабочего буферного раствора 1 и выдержать 5-10 мин.
Затем внести в микроколонку 5,0 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь.
Микроколонку перенести пробирку Б и внести 4,0 мл рабочего буферного раствора 2.
Дать жидкости стечь.
Вынуть микроколонки из пробирок.
Растворы в пробирках А (фракция А) и Б (фракция Б) перемешать.
Измерить оптическую плотность растворов из пробирок А и Б при длине волны 414 нм в кювете на 1 см, используя в качестве контроля дистиллированную воду.
Расчет содержания гликозилированного гемоглобина в процентах рассчитать по формуле:
% GHb = (ЕБ*100) / (ЕБ + 2,55*ЕА)
где:
ЕБ - оптическая плотность фракции Б;
ЕА - оптическая плотность фракции А;
2,55 - пересчетный коэффициент оптической плотности фракции А;
100 - пересчетный коэффициент для вычисления процентного содержания.
Норма гликизированного гемоглобина в крови здоровых людей 4,4 - 8 %.
Клинико-диагностическое значение определение гликозилированного гемоглобина.
Определение гликозилированного гемоглобина проводят для ранней диагностики сахарного диабета, особенно при массовых обследованиях населения на скрытые формы диабета, а также для ретроспективной оценки степени декомпенсации данного заболевания за последние три месяца для улучшения контроля за эффективностью лечения сахарного диабета.
Ответьте на вопросы:
Перечислите основные лабораторные исследования при сахарном диабете.
Чем опасна длительная гипергликемия?
Почему при длительной гипергликемии количество гликозилированного гемоглобина возрастает?
Чем опасно для организма человека увеличесние количества гликозилированного гемоглобина?
На клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия:
а) с инсулином; б) с глюкагоном; в) адреналином; б) йодтиронинами?
*Напишите схематично образование гликированных белков в крови.
*Каково влияние инсулина и адреналина на ферменты: а) гликолиза? б) биосинтеза и распада гликогена? в) глюконеогенеза? г) ЦТК?
4.9. Практическая работа
«Глюкозотолерантный тест».
Цели практической работы:
закрепить знания о причинах, осложнениях и диагностике сахарного диабета;
научиться строить гликемическую кривую и определять её тип при ГТТ;
научиться решать ситуационные задачи.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения ГТТ.
Зарисуйте схематично гликемические кривые в норме, при латентном и явном сахарном диабете.
Решите предложенные преподавателем задачи.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип.
В ответ на поступление в организм углеводов, вырабатывается инсулин, который ограничивает повышение уровня глюкозы в крови. Если степень гипергликемии превосходит обычную, то говорят о снижении толерантности организма к глюкозе.
Методика проведения ГТТ с однократной нагрузкой.
Натощак берут кровь из пальца и определяют в ней содержание глюкозы унифицированным методом.
Затем дают выпить раствор 75 грамм глюкозы на 200 мл воды (1,75 г глюкозы на 1 кг веса), подкисленный лимонной кислотой.
Через 30, 60, 120, 180 минут после приема сахара определяют уровень глюкозы в крови.
Результаты вносят в таблицу и на их основании строят гликемические кривые, откладывая на оси абсцисс время забора крови, а на оси ординат – найденное содержание сахара в крови в ммоль/л.
При анализе гликемических кривых обращают внимание на следующие параметры:
Начальное содержание глюкозы в крови.
Быстроту и высоту подъема гликемической кривой.
Продолжительность гипергликемии и характер её снижения.
Методика проведения ГТТ с двойной нагрузкой.
ГТТ с двойной нагрузкой проводится подобно ГТТ с однократной нагрузкой с тем лишь отличием, что обследуемый получает 2 порции глюкозы с интервалом в 1 час.
При оценке результатов учитывают, что в норме второй пик гипергликемии должен быть меньше первого или отсутствовать. Если же инсулина недостаточно на второй прием глюкозы, то уровень гликемии будет выше –что указывает на сахарный диабет.
Методика проведения преднизалоновой пробы.
Учитывая, что глюкокортикоиды повышают содержание глюкозы в крови, предварительный прием преднизалона, способствует выявлению скрытых форм сахарного диабета.
Суть преднизалоновой пробы в том, что обследуемому за 12 и за 2 часа до сахарной нагрузки дают по 10 мг преднизалона. При этом в норме величина гликемии оказывается выше, и патология выявляется чаще.
Остальное обследование и оценка результата проводиться подобно ГТТ с однократной нагрузкой.
Факторы, влияющие на результаты ГТТ:
Характер питания.
Характер труда.
Курение.
Беременность.
Гормональные нарушения.
В связи с этим были разработаны следующие рекомендации по проведению преаналитического этапа ГТТ:
Обследуемый на протяжении трех дней не должен менять привычного режима питания и работы.
За 3 дня отменяются инъекции глюкозы, кофеина, адреналина.
Последний прием пищи должен быть не позднее, чем в 20 часов вечера накануне обследования.
Перед проведением теста необходимо 30 минут спокойно посидеть.
Во время пробы нельзя курить, нервничать, заниматься физической работой и принимать лекарственные препараты.
Анализ гликемических кривых.
Кривая здорового человека отличается быстрым подъемом, максимальный подъем отмечается через 30 минут после приема глюкозы. Количество глюкозы в крови может при этом удвоится, но не повышается более 10 ммоль/л.
При сахарной болезни уровень сахара в крови возрастает дольше и достигает максимума через 30-60 минут или еще позднее, причем достигает очень высоких цифр – 14 ммоль/ л глюкозы крови и более.
Понижение гликемической кривой (уменьшение глюкозы в крови) у здорового человека наступает быстро и через 1,5-2,5 часа возвращается к исходной величине, а иногда оказывается ниже её.
При диабете повышение глюкозы в крови держится 5-7 часов и возвращается к исходной величине очень медленно. При сахарном диабете происходит снижение толерантности к глюкозе.
|
Глюкоза натощак
|
Глюкоза через 1 час
|
Глюкоза через 2 часа
|
Глюкозурия
|
Норма
|
Менее 6,7
|
Менее 10
|
Менее 6,7
|
Нет
|
Сомнительный результат
|
Менее 6,7
|
Менее 11
|
Менее 8,3
|
Нет
|
Латентный диабет
|
Менее 7,2
|
Более 11
|
Более 8,3
|
Часто отсутствует
|
Явный диабет
|
Более 7,2
|
Более 11
|
Более 8,3
|
Почти всегда есть
|
Диагноз сахарный диабет ставят в тех случаях, когда гликемия натощак белее 7,0 ммоль/л и через 2 часа после нагрузки более 11 ммоль/л.
Ответьте на вопросы:
На каком принципе основано проведение ГТТ.
Почему у здорового человека при проведении ГТТ с двойной нагрузкой второго пика гликемии чаще всего не бывает.
Постройте в тетради гликемические кривые характерные для нормы, сомнительного результата, латентного диабета и сахарного диабета.
Дайте определение понятиям: сахарный диабет, гликемические кривые, почечный порог для глюкозы, латентный диабет, нарушение толерантности к глюкозе.
*Объясните, почему характер питания, труда и эмоциональное состояние могут влиять на результаты ГТТ.
Расскажите о преаналитическом этапе исследований обмена углеводов.
Раздел 5. Обмен белков в норме и при патологии.
Значение изучаемой темы:
В количественном отношении белки занимают первое место среди всех содержащихся в живой клетке макромолекул. Велико также их многообразие, в одной клетке можно обнаружить сотни различных видов белков. Выполняя ряд уникальных функций, белки определяют не только микро- и макроструктуру отдельных субклеточных образований, специфику клеток, органов и целого организма, но и, в значительной степени, динамическое состояние между организмом и окружающей средой.
Белковый обмен строго специфичен, обеспечивая непрерывность воспроизводства и обновления белковых тел в организме. Кроме этого белки выполняют каталитическую и гормональную функции, благодаря чему координирует, регулирует и интегрирует многообразие химических превращений в организме.
Состояние белкового обмена определяется множеством факторов, как экзогенных (окружающая среда, характер питания и др.), так и эндогенных (физиологическое состояние организма). Знание закономерностей изменений обмена белков необходимо для правильной диагностики, мониторинга, лечения и профилактики заболеваний.
4.1. Методы исследования белкового обмена.
Используя знания о свойствах белков и пептидов можно применять различные методы определения белков и пептидов в биологических жидкостях. В практике используют следующие методы определения:
Электрофоретический – основан на разделении белков в постоянном электрическом поле в зависимости от величины белковой молекулы.
Ультрацентрифугирование – основано на различной скорости седиментации отдельных белков в зависимости от их молекулярной массы.
Хроматографические:
Ионнообменная хроматография основана на различной способности отдельных белков к обмену с ионами ионнообменных смол,
Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация) – на сефадексах – белки разделяются в зависимости от величины молекулы,
Аффинная хроматография – белки делятся на индивидуальные в зависимости от сродства к аффинату (наполнителю колонок).
|
|
|
Скачать 1.34 Mb.