|
|
практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
3.3. Практическая работа
«Обнаружение действия и специфичности ферментов».
Цели практической работы:
Задание для самостоятельной работы:
Законспектируйте методику проведения практической работы.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение действия и специфичности амилазы слюны.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Фермент слюны амилаза при определенных условиях производит гидролиз крахмала до мальтозы.
амилаза амилаза мальтаза
(С6Н10О5)у-----------(С6Н10О5)х-------------уС12Н22О11-----------nС6Н12О6
крахмал декстрины мальтоза глюкоза
Реактивы:
1% раствор крахмала.
2% раствор сахарозы.
1% раствор йода.
5% раствор сульфата меди.
10% раствор гидрооксида натрия.
Амилаза слюны.
Дистиллированная вода.
|
Оборудование:
Штатив с пробирками (7 шт).
Пипетки глазные.
Воронка.
Стаканчик.
Термостат.
Спиртовка.
Фильтровальная бумага.
|
Опыт № 1. Обнаружение действия ферментов.
Получите ферментативный препарат амилазы слюны (ополоскать рот водой, затем набирать 10-20 мл дистиллированной воды, выдержать во рту 2-3 мин и полученный раствор амилазы слить в стакан);
В две пробирки налейте по 10 капель раствора крахмала, подпишите пробирки контроль и опыт;
В контрольную пробирку налейте 5 капель воды, в опытную – 5 капель амилазы слюны;
Перемешайте и поставьте в термостат при 370С на 15 мин;
Затем опытную пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку;
В одну пробирку добавьте 1 каплю йода, в другую добавьте 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидрооксида меди и нагрейте до кипения (реакция Троммера);
Аналогичные реакции проведите с контрольной пробиркой;
Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.
-
№
|
Субстрат
|
Фермент
|
Реакция с йодом
|
Реакция Троммера
|
1
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
Опыт № 2. Специфичность действия ферментов.
В две пробирки налейте по 10 капель раствора слюны, в первую добавьте 10 капель раствора крахмала, во вторую – 10 капель сахарозы;
Пробы перемешайте и поместите в термостат при 370С на 15 мин;
Затем первую пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку, и проделайте две реакции: пробу Троммера и реакцию с йодом;
Со второй пробиркой проделайте реакцию Троммера;
Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.
-
№
|
Субстрат
|
Фермент
|
Реакция с йодом
|
Реакция Троммера
|
1
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
Ответьте на вопросы:
Напишите реакцию, которую катализирует амилаза слюны.
Назовите субстраты амилазы.
Для чего необходима инкубация фермента с субстратом?
Какой специфичностью обладает амилаза слюны?
Как можно измерить активность амилазы?
Дайте определения следующим понятиям: фермент, активный центр, аллостерический центр, простые ферменты, сложные ферменты, апофермент, кофермент, холофермент, обратимость действия, термолабильность, специфичность.
3.4. Практическая работа
«Зависимость активности ферментов от рН среды».
Цели практической работы:
закрепить знания о свойствах ферментов, кинетике ферментативных реакций, классификации ферментов по сложности строения;
научиться определять зависимость активности амилазы слюны от рН среды.
Задание для самостоятельной работы:
Законспектируйте методику проведения практической работы.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от рН среды.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Для амилазы слюны оптимальное значение рН лежит в пределах слабощелочной среды, в кислой и сильно щелочной среде активность фермента снижается, и расщепление крахмала происходит не полностью, до стадии декстринов, которые с йодом дают красно-фиолетовое или красно-бурое окрашивание.
Реактивы:
1% раствор крахмала.
1% раствор йода.
фосфатно-цитратный буфер с рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0.
Амилаза слюны.
|
Оборудование:
Штатив с пробирками (5 шт).
Пипетки на 1 мл, глазные пипетки.
Термостат.
|
Ход работы:
В 5 пронумерованных пробирок налейте по 1 мл фосфатно-цитратного буфера со значением рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0;
Во все пробирки добавьте по 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл раствора амилазы;
Затем во все пробирки добавьте по 3 капли раствора йода, тщательно перемешайте;
Все пробирки поместите в термостат при 370С на 15 мин;
Затем пробирки охладите под холодной водой и сравнит окраску во всех 5 пробирках;
Сделайте вывод о зависимости активности амилазы от рН среды.
Ответьте на вопросы:
Приведите примеры простых ферментов.
Приведите примеры сложных ферментов.
Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
*Назовите оптимальную рН для следующих ферментов: пепсин, химозин, гастриксин, амилаза слюны, трипсин, липаза, химотрипсин.
3. 5. Практическая работа
«Зависимость активности ферментов от температуры».
Цели практической работы:
закрепить знания о кинетике ферментативной реакции;
научиться определять зависимость активности амилазы слюны от температуры.
Задание для самостоятельной работы:
Законспектируйте методику проведения практической работы.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от температуры.
Сделайте выводы по работе, по полученным результатам построить график зависимости активности амилазы от температуры.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Все ферменты являются термолабильными веществами и проявляют свою максимальную активность при 370С. При снижении или повышении температуры активность ферментов падает, что приводит к образованию промежуточных продуктов или к полной остановке реакции. Так, нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, а декстрины (промежуточные продукты распада крахмала) в зависимости от величины своих частиц дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску. Таким образом, по окраске раствора йодом можно судить о степени гидролиза крахмала.
Реактивы:
1% раствор крахмала.
1% раствор йода.
Раствор амилазы.
Дистиллированная вода.
|
Оборудование:
Штатив с пробирками (4 шт).
Пипетки на 1 и 2 мл, глазные пипетки.
Термостат.
Водяная баня.
Ледяная баня.
Спиртовка.
|
Ход работы:
В четыре пронумерованной пробирки налейте по 0,5 мл раствора амилазы;
Пробирку №1 поставьте в лед, №2 – оставьте при комнатной температуре, №3 – в термостат, №4 – в кипящую водяную баню;
Через 5 мин, когда содержимое пробирок примет нужную температуру, в пробирку №1 добавьте 2 мл крахмала, охлажденного до температуры тающего льда.
Во 2-ю,3-ю и 4-ю пробирки добавьте по 2 мл раствора крахмала комнатной температуры;
Во все пробирки добавьте по 2 капли йода;
Перемешайте содержимое и поместите пробирки в те же самые условия на 15 мин;
Затем пробирки достаньте, охладите, и оцените активность амилазы по интенсивности и цвету окраски;
Результаты занесите в таблицу:
-
№
|
Субстрат
|
Фермент
|
t
|
Реакция с йодом
|
1.
|
|
|
|
|
2.
|
|
|
|
|
3.
|
|
|
|
|
4.
|
|
|
|
|
Ответьте на вопросы:
Перечислите основные свойства ферментов.
Как влияет температура на активность ферментов?
К какому классу ферментов относится амилаза слюны?
Перечислите классы ферментов с примерами.
5*. Нарисуйте графики зависимости активности ферментов от температуры, рН, концентрации S и Р.
3.6. Практическая работа
«Зависимость активности ферментов от влияния активаторов и ингибиторов».
Цели практической работы:
закрепить знания об активаторах и ингибиторах, видах ингибирования;
научиться определять зависимость активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.
Задание для самостоятельной работы:
Законспектируйте методику.
Подготовьте рабочее место для исследования.
Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.
Сделайте выводы по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его активации или ингибированию.
Реактивы:
1% раствор крахмала.
1% раствор йода.
1% раствор сульфата меди.
1% раствор хлорида натрия.
Амилаза слюны.
Дистиллированная вода.
|
Оборудование:
Штатив с пробирками (3).
Пипетки глазные.
Стаканчики.
Воронка.
|
Ход работы:
В 3 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель раствора амилазы;
Затем по одной капле добавьте в 1-ю – хлорид натрия, во 2-ю – сульфат меди, в 3-ю – воды (контроль).
Перемешайте, внесите в каждую пробирку по 5 капель раствора крахмала и оставьте стоять на 3 мин при комнатной температуре.
Затем добавьте по 1 капле йода, перемешайте, наблюдайте за окраской растворов и определите, в какой пробирке действовал активатор или ингибитор.
Результаты оформите в виде таблицы:
№
|
Субстрат
|
Фермент
|
Реакция с йодом в присутствии
|
СuSO4
|
NaCI
|
H2O
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ответьте на вопросы:
Дайте определения и характеристику изоферментам на примере ЛДГ и КК.
Дайте определение следующим терминам: активаторы, ингибиторы, денатурация, ингибирование.
Перечислите основные виды ингибирования.
Объясните принцип конкурентного ингибирования.
*Ингибитор снижает активность фермента до 30% от исходного уровня. Повышение концентрации субстрата катализируемой реакции восстанавливает 80% активности фермента. К какому типу относится данный ингибитор?
3.7. Практическая работа
«Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови».
Цели практической работы:
усвоить представление о диагностическом значении определения ферментов;
изучить клинико-диагностическое значение определения амилазы в сыворотке крови и моче;
научиться определять активность панкреатической альфа-амилазы в сыворотке крови.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.
Сделайте вывод по работе и рисунки.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Альфа-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.
Реактивы:
Крахмал-субстрат.
Фосфатный буфер рН=7.
Раствор йода 0,01н.
Вода дистиллированная.
Сыворотка крови.
|
Оборудование:
Штатив с пробирками (2 шт).
Пипетки на 1 мл, 5 мл.
Дозатор на 0,01 мл и на 0,5 мл.
Термостат.
ФЭК.
|
Ход определения:
Проведите исследование активности амилазы в сыворотке крови согласно таблице.
Реактивы.
|
Опытная проба, мл.
|
Холостая проба, мл.
|
Рабочий реактив
|
0.5
|
0.5
|
Выдержать в термостате при 370С в течение 5 мин.
|
Сыворотка крови
|
0.01
|
-
|
Вода дистиллированная
|
-
|
0.01
|
Выдержать в термостате при 37С в течение 7,5 мин. Время инкубации строго отсчитывать по секундомеру от момента внесения образца и затем сразу добавить:
|
Раствор йода
|
0.5
|
0.5
|
Объем проб довести дистиллированной водой до 5 мл, перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (А1) и холостой пробы (А2) против дистиллированной воды, при 630-690 нм в кювете на 10 мм.
|
Расчет проводим по формуле:
Активность амилазы = (А2 – А1)* 44.4/А2, мг/с*л
Активность амилазы показывает количество крахмала в мг, гидролизованного 1л биологической жидкости за 1с при 37 С.
Норма активности амилазы:
Сыворотка крови – 3.3 –8.9 мг/с*л или 16-30 г/ч*л.
Моча - до 44 мг/с*л или 20 –160 г/ч*л.
Клинико-диагностическое значение определения активности амилазы
Амилаза - фермент, осуществляющий расщеплении крахмала и гликогена. наиболее богаты им поджелудочная и слюнные железы. Содержание амилазы в сыворотке крови связано с приемом пищи: днем активность выше, чем ночью.
Активность амилазы в сыворотке крови повышается (гиперамилаземия) при:
Остром панкреатите (в 10-30 раз, приходя к норме на 6-7 сутки, если активность сохраняется увеличенной более 5 суток, это говорит о развитии хронического процесса);
Обострении хронического панкреатита;
Паротите (воспалении слюнных желез);
Почечной недостаточности;
Может быть вызвана приемом алкоголя, адреналина, наркотических веществ.
Снижение активности амилазы в сыворотке крови (гипоамилаземия) наблюдается при:
Заболеваниях печени (гепатитах, механической желтухе, циррозе);
Сахарном диабете;
Гипотереозе;
Повышение активности в моче (гиперамилазурия) наблюдается при:
Снижение активности фермента в моче (гипоамилазурия) наблюдается при:
почечной недостаточности.
Ответьте на вопросы:
Назовите место локализации, оптимальное рН и биологическое значение амилазы.
Напишите реакцию, которую катализирует амилаза.
К какому классу ферментов относится амилаза?
*Назовите основные заболевания, характеризующиеся повышением активности амилазы. Объясните причину.
*Расскажите о причинах, видах, лабораторной диагностике и профилактике панкреатита.
|
|
|
Скачать 1.34 Mb.