|
|
практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
2.3. Практическая работа
«Необратимое осаждение белков (денатурация белков)».
Цели практической работы:
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Белки в водных растворах имеют два фактора устойчивости: гидратную оболочку и заряд белковой молекулы. При удалении только одного фактора устойчивости, белки осаждаются обратимо. При удалении обеих факторов устойчивости одновременно, происходит необратимое осаждение, т.е. денатурация белка.
Реактивы:
1 % раствор яичного белка.
1 % раствор уксусной кислоты CH3COOH.
10 % раствор уксусной кислоты CH3COOH.
10 % раствор гидрооксида натрия NаОН.
Концентрированная серная кислота Н2SO4.
Концентрированная соляная кислота HCl
Концентрированная азотная кислота HNO3.
10 % раствор сульфлсалициловой кислоты.
10 % раствор трихлоруксусной кислоты.
10 % раствор сульфата меди СuSO4.
5 % раствор ацетата свинца Pb(CH3COO)2.
Желатин сухой.
0,5 % раствор желатина.
Буферные растворы с рН = 1,0; 3,7; 4,7; 5,7; 9,0.
|
Оборудование:
Пробирки – 11 шт.
Глазные пипетки – 4 шт.
Спиртовка.
Штатив под пробирки.
Стеклограф.
|
Опыт 1. Осаждение белков при кипячении.
В 4 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель 1 % раствора белка.
Затем в пробирку № 2 добавьте 1 каплю 1 % раствора CH3COOH, в пробирку № 3 – 1 каплю 10 % раствора CH3COOH, в пробирку № 4 – 1 каплю 10 % раствора NaOH.
Все 4 пробирки нагрейте до кипения и наблюдайте образование осадка белка. Почему осадок белка образуется не во всех пробирках? Какие факторы устойчивости белка удаляются в каждом отдельном случае?
Опыт 2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами. В 3 сухие пробирки налейте по 5 капель концентрированных минеральных кислот – серной, соляной и азотной. Наклонив пробирку под углом 45*, осторожно, по стенке пробирки, так чтобы жидкости не смешивались, наслоите такой же объем 1 % раствора яичного белка во все пробирки. На границе 2-х слоев наблюдается белое кольцо. Почему? Осторожно встряхните пробирки. Что наблюдаете?
Опыт 3. Осаждение белков органическими кислотами.
В 2 пробирки налейте по 5 капель 1 % раствора яичного белка.
В пробирку № 1 добавьте 2 капли 10 % раствора сульфосалициловой кислоты, а в пробирку № 2 - 2 капли 10 % ТХУ. Что наблюдается? Почему?
Опыт 4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
В 2 пробирки внесите по 5 капель 1 % раствора яичного белка.
В пробирку № 1 добавьте 1 каплю 10 % раствора сульфата меди СuSO4, в пробирку № 2 – 1 каплю 5 % раствора ацетата свинца Pb(CH3COO)2. Что наблюдается? Почему?
Опыт 5. Определение изоэлектрической точки ИЭТ желатина.
Опыт 5.1.
В три пробирки внесите по 0,2 г порошка желатина и добавьте по 1 мл буферных растворов с рН = 1,0; 4,7; 9,0.
Осторожно встряхните и оставьте стоять на 1 час.
Определите высоту геля в пробирках.
Зарисуйте рузультаты и сделайте выводы о значении ИЭТ по минимуму набухания.
Опыт 5.2.
В три пробирки налейте по 0,5 мл буферных растворов с рН = 3,7; 4,7; 5,7 и по 0,5 мл 0,5% раствора желатина. Что наблюдаете?
Затем во все пробирки добавьте по 1 мл этилового спирта. Что наблюдаете? Почему?
Ответьте на вопросы:
Какие факторы устойчивости белка вы знаете?
Какие факторы устойчивости белка удаляется в каждом опыте данной работы?
Что такое изоэлектрическая точка? Объясните результаты опыта 5.
Как изменяется растворимость белков в изоэлектрической точке?
Сделайте общий вывод по работе, ответив на вопрос: под действием каких факторов происходит денатурация белка?
*Что такое кислый, основной и нейтральный белок? Приведите примеры аминокислот определяющих эти свойства белков.
*Напишите уравнение диссоциации ГЛИ, АСП, ЛИЗ, ФЕН.
*Белок куриного яйца содержит в своем составе в основном моноаминодикарбоновые аминокислоты. Какой заряд имеет молекула такого белка? Каковы реакция среды в растворе яичного белка? При каких условиях этот белок достигает изоэлектрической точки?
*Напишите уравнения химических реакций, которые протекают в пробирках № 2, № 3, № 4 в опыте «Осаждение белков при кипячении», на примере глутаминовой аминокислоты (Глу) или аспарагиновой аминокислоты (Асп).
*Приведите примеры использования явления денатурации в лабораторной практике.
2.4. Практическая работа
«Качественные реакции на составные части молока».
Цели практической работы:
закрепить знания о свойствах белков и аминокислот;
закрепить умение проводить необратимое осаждение белков.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
В состав коровьего молока входят 3,3 % общего белка; 2,7 % казеиногена; 0,6 % альбуминов и глобулинов; 4,8 % лактозы; 3,7 % липидов; 0,7 % солей. Все эти составные части молока можно определить с помощью качественных реакций.
Реактивы:
Молоко.
Дистиллированная вода.
3 % раствор уксусной кислоты CH3COOH.
10 % раствор гидрооксида натрия NаОН.
1 % раствор гидрооксида натрия NаОН.
Сухой сульфат аммония.
Насыщенный раствор сульфата аммония.
0,2 % щавелевокислый аммоний.
5 % раствор сульфата меди СuSO4.
5 % раствор ацетата свинца Pb(CH3COO)2.
10 % хлорид кальция.
Пепсин.
|
Оборудование:
Пробирки – 5 шт.
Глазные пипетки – 2 шт.
Пипетка на 1 мл.
Спиртовка.
Штатив под пробирки.
Стеклограф.
Химический стаканчик.
Воронка.
Фильтр.
Термостат.
|
Опыт 1. Осаждение казеиногена.
Принцип:
Белок молока – казеиноген – относится к сложным белкам – фосфопротеидам, его простетическая группа содержит большое количество ортофосфорной кислоты, соединенной с аминокислотами серином и треонином. Казеиноген не свертывается при нагревании, растворим в растворах слабых щелочей. В молоке он находится в виде растворимых в воде кальциевых солей. В изоэлектрической точке рН=4,7 казеиноген переходит в изоэлектрическое состояние, теряет свою устойчивость и выпадает в осадок.
Ход работы:
В стаканчик налейте 2,5 мл молока и 5 мл дистиллированной воды.
Содержимое стаканчика хорошо перемешайте и добавьте по каплям 0,5 мл 3 % раствора уксусной кислоты.
Затем снова хорошо перемешайте и оставьте стоять 5-10 минут.
Осадок белка отфильтруйте.
Фильтрат разлейте в 3 пробирки и используйте в следующих работах.
Осадок белка промойте водой 1-2 раза.
Растворите осадок на фильтре 1 мл 1 % раствора гидроксида натрия.
С полученной жидкостью проведите биуретовую реакцию: прибавьте 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 5 % раствора сульфата меди. Что наблюдается? Объясните полученные явления.
Опыт 2. Осаждение молочного альбумина и глобулина.
Принцип:
Молочный альбумин и глобулин обладают всеми свойствами белков соответствующих групп (альбуминов и глобулинов): они свертываются при кипячении и высаливаются в насыщенном (альбумины) и полунасыщенном (глобулины) растворе сернокислого аммония.
Ход работы:
В первую пробирку с фильтратом из опыта 1 добавьте равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония. Что наблюдаете?
Раствор отфильтруйте.
В фильтрат добавьте порошок сернокислого аммония до насыщения. Что наблюдаете? Объясните наблюдаемые явления.
Опыт 3 . Открытие молочного сахара.
Принцип:
Молочный сахар — лактоза, состоит из остатков бетта-галактозы и альфа-глюкозы, соединенных между собой 1,4-гликозидной связью, вследствие чего обладает восстановительной способностью.
Ход работы:
С фильтратом во второй пробирке из опыта 1 проведите реакцию Троммера, для чего налейте 5—6 капель 10% раствора едкого натрия и по каплям 5 % раствор сернокислой меди до образования легкой неисчезающей мути.
Пробирку осторожно нагрейте. Сначала появляется желтое окрашивание, а затем образуется желтый или красно-коричневый осадок.
Опыт 4. Открытие солей кальция.
К фильтрату в третьей пробирке из опыта 1 прибавьте 2—4 капли 0,2 % раствора щавелевокислого аммония. Что наблюдаете? Выпадает осадок не растворимого в воде щавелевокислого кальция.
Опыт 5. Створаживание молока.
Принцип:
Под влиянием фермента пепсина происходит створаживание молока, так как пепсин обладает способностью превращать казеиноген в казеин, кальциевые соли которого нерастворимы в воде.
Ход работы:
В химическом стаканчике разведите 1 мл молока в 20 раз дистиллированной водой.
В четыре пробирки отмерьте по 3 мл разведенного молока.
В первую пробирку добавьте 5—6 капель раствора пепсина.
Во вторую добавьте 5—6 капель прокипяченного раствора пепсина.
В третью и четвертую пробирки добавьте 5— 6 капель 0,2 % раствора щавелевокислого аммония и встряхните. Затем в каждую налейте по 5—6 капель раствора пепсина.
Все пробирки поместите на 10—15 мин в термостат при температуре 37—42° С.
По истечении указанного времени отметьте, в каких пробирках произошло створаживание молока. Объясните наблюдаемые явления.
В четвертую пробирку добавьте 5—6 капель 10% раствора хлористого кальция. В пробирке выпал осадок казеиногена. Объясните причину наблюдаемого явления.
Опыт 6. Осаждение белков молока солями тяжелых металлов
В три пробирки налейте по 1 мл молока и прибавьте в первую — 2—3 капли 5 % раствора сернокислой меди, во вторую — 2—3 капли 5 % раствора уксуснокислого свинца. Что наблюдаете? Почему?
Ответьте на вопросы:
Как объяснить, что белок молока казеин при кипячении сворачивается (выпадает в осадок), если молоко кислое.
*Каплю раствора, содержащего смесь аминокислот ГЛИ, АЛА, ГЛУ, ЛИЗ, ГИС нанесли на середину элерктрофоретической бумаги, смочили буфером рН 6,0 и приложили электрическое напряжение. Укажите, в каком направлении (к катоду, аноду или остануться на старте) будут двигаться отдельные аминокислоты.
*Трипептид, выделенный из токсина змей, состоит из трех незаменимых аминокислот – серосодержащей, гетероциклической и гидроксилсодержащей. Напишите этот трипептид и определите область рН в которой будет находиться его изоэлектрическая точка.
|
|
|
Скачать 1.34 Mb.