|
практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
2.5. Практическая работа «Качественные реакции на углеводы».
Цели практической работы:
закрепить знания о стороении, свойствах и классификации углеводов;
научиться проводить качественные реакции на углеводы.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Реактивы:
1 % раствор глюкозы.
1 % раствор мальтозы.
1 % раствор сахарозы.
1 % раствор крахмала.
10 % раствор NaOH.
5 % раствор CuSО4.
1 % раствор I2.
Раствор слюны (набрать в рот немного воды, через 2 минуты полученную воду со слюной отфильтровать).
|
Оборудование:
Пробирки – 7 шт.
Пипетки - 4 шт.
Спиртовка.
Воронка.
Фильтровальная бумага.
|
Опыт 1. Обнаружение крахмала.
Принцип:
Крахмал состоит из двух видов полимерных цепей линейной (амилоза) и разветвленной (амилопектин), которые обладают специфическими свойствами. Амилоза хорошо растворима в горячей воде, с раствором йода дает синее окрашивание. Амилопектин в горячей воде образует коллоидный раствор и с раствором йода не дает синее окрашивание. Крахмал расщепляется амилазой слюны и амилазой кишечника.
Ход работы:
В первую пробирку налейте 10 капель 1 % раствора крахмала и 1 каплю 1 % раствора йода. Что наблюдаете?
Во вторую пробирку налейте 10 капель 1 % раствора крахмала, 5 капель раствора слюны и оставьте стоять 10-15 минут.
Смесь из второй пробирки разделите на 2 части.
В первую часть добавьте 1 каплю 1 % раствора йода, а вторую часть сохраните для второго опыта. Что наблюдаете? Объясните наблюдаемые явления.
Опыт 2. Восстановительные свойства углеводов (реакция Троммера).
Принцип:
Моно- и дисахариды, имеющие свободную альдегидную группу, обладают способностью восстанавливать в щелочной среде металлы из их окислов в закисные формы.
Ход работы:
Возьмите 4 пробирки и пронумеруйте их.
Добавьте по 10 капель растворов: в первую пробирку - глюкозы, во вторую - мальтозы, в третью - сахарозы, в четвертую - крахмала.
Пробирку из опыта 1 обозначьте № 5.
Затем во все пять пробирок добавьте по 10 капель 10 % раствора NаОН и 2 капли 5 % раствора CuSО4. Смеси перемешайте. Что наблюдаете?
Все смеси нагрейте на спиртовке. Что наблюдаете? Объясните полученные результаты. Напишите уравнения реакции окисления глюкозы до глюконовой кислоты.
Ответьте на вопросы:
Где на практике применяют качественные реакции крахмала и глюкозы?
Почему реакция Троммера не является специфичной для глюкозы?
Амилаза расщепляет крахмал в ЖКТ. Будет ли этот фермент расщеплять гликоген и клетчатку? Почему?
*Как вы думаете, можно ли применять реакцию Троммера для определения глюкозы в крови? Почему?
*Напишите реакцию окисления глюкозы до глюкуроновой кислоты.
*Напишите уравнения реакций образования глюкозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат из глюкозы и фосфорной кислоты.
*Крахмал, гликоген и клетчатка являются полимерами глюкозы. Будет ли синее окрашивание с йодом у гликогена и клетчатки? Почему?
2.6. Практическая работа «Качественные реакции на липиды».
Цели практической работы:
закрепить знания о строении, свойствах и классификации липидов;
научиться проводить качественные реакции на липиды.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
Физические и химические свойства липидов определяются их строением. Они не растворимы в воде и полярных растворителях, т.к. не способны образовывать водородные связи в растворах, но с рядом веществ способны образовывать эмульсии.
Реактивы:
Растительное масло.
Бензин.
Хлороформ.
Эфир.
Этиловый спирт.
1 % раствор яичного белка.
10 % раствор NaOH.
10 % раствор соды NaHCO3.
Мыльный раствор.
Желчь.
Дистиллированная вода.
Бромная вода.
Сливочное масло.
35 % гидроксид натрия.
Моча.
Порошок серы.
|
Оборудование:
Пробирки – 11 шт.
Пипетки - 2 шт.
Лопаточка.
|
Опыт 1. Растворение жиров.
В 4 пробирки внесите по 3 капли растительного масла.
Добавьте по 10 капель: в первую пробирку бензина, во вторую - хлороформа, в третью - эфира, в четвертую - этилового спирта.
Смеси встряхните. Что наблюдаете? Объясните полученные результаты.
Опыт 2. Эмульгирование жиров.
В 5 пробирок внесите по 2 капли растительного масла и по 3 капля дистиллированной воды.
Смеси энергично встряхните. Что наблюдается?
Добавьте по 4 капели: в первую пробирку раствора белка, во вторую - 10 % раствора NaOH, в третью - 10 % раствора соды NaHCO3, в четвертую - мыльного раствора и в пятую - желчь.
Смеси энергично встряхните. Что наблюдается? Объясните полученные результаты.
Опыт 3. Определение непредельности высших жирных кислот.
В 2 пробирки поместите 8-10 капель бромной воды.
В первую пробирку добавьте 2-3 капли растительного масла, во вторую – небольшой кусочек сливочного масла.
Содержимое обеих пробирок взболтайте. Что наблюдается? Объясните наблюдаемые явления.
Опыт 4. Омыление жиров.
В фарфоровую чашечку поместите 0,5 мл растительного масла и 4 капли 35 % раствора гидроксида натрия.
Стеклянной палочкой хорошенько размешайте щелочь с маслом до получения однородной эмульсии.
Поставьте чашечку на электрическую печь и при незначительном подогревании продолжайте помешивать, пока не получиться однородная, прозрачная, слегка желтоватая жидкость.
Добавьте 2 мл воды и вновь нагрейте, тщательно помешивая до полного упаривания воды.
Снимите чашечку с электрической печи. Получиться кусочек твердого белого мыла. Где применяется данное свойство жиров?
Опыт 5. Обнаружение желчных кислот в моче (проба Гея).
Принцип:
Желчные кислоты являются поверхностно-активными веществами (ПВА), снижающими поверхностное натяжение мочи, поэтому порошок серы, помещенный на поверхность мочи, тонет.
Ход работы:
В первую пробирку налейте 3-5 мл мочи, во вторую 3-5 мл желчи.
В обе пробирки добавьте 1 лопаточку порошка серы. Не взбалтывать! В присутствии желчных кислот в моче порошок серы тонет.
Ответьте на вопросы:
Почему жиры не растворимы в воде и растворимы в неполярных органических растворителях?
На чем основано эмульгирование жиров? Какими свойствами должны обладать эмульгаторы?
Как в организме используется способность жиров образовывать эмульсии и мицеллы?
Какие эмульгаторы существуют в организме? Их функции.
На каких свойствах желчных кислот основано их обнаружение в моче?
Почему непредельные жирные кислоты должны поступать в организм с пищей?
*На чем основано омыление жиров? Напишите уравнения химической реакции омыления ТАГ образованного 1 стеариновой и 2 линоленовыми кислотами.
*Чем отличается гидролиз и омыление жиров? Напишите уравнения химической реакции гидролиза и гидрирования ТАГ образованного 1 пальмитиновой и 1 линоленовой и 1 арахидоной кислотами.
*Почему липаза может переваривать только эмульгированные жиры?
2.7. Практическая работа
«Качественные реакции на нуклеиновые кислоты».
Цели практической работы:
закрепить знания о строении и функциях нуклеиновых кислот;
научиться проводить качественные реакции на нуклеиновые кислоты.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
При непродолжительном гидролизе дрожжевой массы или выделенных из нее нуклеопротеинов последние распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу и фосфорную кислоту. Продукты могут быть обнаружены в гидролизате специфическими для каждого вещества реакциями.
Реактивы:
Дрожжи.
Эфир.
Дистиллированная вода.
Стеклянный песок.
0,4 % раствор гидрооксида натрия.
Уксусная кислота.
10 % раствор серной кислоты.
10 % раствор гидрооксида натрия.
1 % раствор сульфата меди.
Раствор аммиака.
Аммиачный раствор оксида серебра.
Молибденовый реактив.
|
Оборудование:
Пробирки – 6 шт.
Центрифужная пробирка.
Весы и разновесы.
Фарфоровая ступка и пестик.
Химический стакан на 100 мл.
Центрифуга.
Пипетки.
Пробка с обратным холодильником.
Водяная баня.
Воронка.
Фильтровальная бумага.
Лакмусовая бумага.
Спиртовка.
|
Опыт 1. Извлечение нуклеопротеидов из дрожжей.
В фарфоровую ступку поместите 1 г дрожжей, добавьте 1 каплю эфира, 2 капли дистиллированной воды, около 0,1 г стеклянного песка.
Дрожжевую массу расзотрите пестиком 1-2 минуты для разрушения клеток.
В ступку добавьте 4 мл 0,4 % раствора гидроксида натрия и растирайте еще 5 минут.
Содержимое ступки пипеткой перенесите в центрифужную пробирку и центрифугируйте 10 минут при 2000 об/мин.
Надосадочную жидкость перенесите пипеткой в стакан с 80-90 мл воды, подкисленной до рН=4,5 уксусной кислотой.
Выпавший осадок РНК-протеина отделите центрифугированием 10 минут при 2000 об/мин..
Опыт 2. Изучение химического состава рибонуклеинов дрожжей.
200 мг дрожжей поместите в широкую пробирку и добавьте 5 мл 10 % раствора серной кислоты и 5 мл дистиллированной воды.
Смесь перемешайте и закройте пробкой с обратным холодильником.
Пробирку поместите на кипящую водяную баню и кипятите при слабом нагревании 1 час.
Пробирку охладите.
Отфильтруйте содержимое пробирки.
Фильтрат (гидролизат) используйте в опытах 3 – 6.
Опыт 3. Биуретовая реакция на белок.
К 5-6 каплям гидролизата прибавьте 10 капель 10 % раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1 % раствора сульфата меди. При наличии белка жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.
Опыт 4. Серебреная проба на пуриновые основания.
К 0,5 мл гидролизата добавьте раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус и 0,5 мл аммиачного раствора оксида серебра.
Через 5 минут при стоянии выпадает небольшой хлопьевидный осадок серебряных соединений пуриновых оснований.
Опыт 5. Реакция на пентозы.
К 0,5 мл гидролизата добавьте 0,5 мл 10 % раствора гидроксида натрия и по каплям раствор сульфата меди до образования осадка.
Смесь нагрейте до кипения. В случае присутствия моносахаридов (петноз) образуется красный осадок закиси меди.
Опыт 6. Молибденовая проба на фосфорную кислоту.
К 0,5 мл гидролизата прибавьте равный объем молибденового реактива и кипятите несколько минут. Жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет.
Смесь охладите. При охлаждении образуется желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.
Опыт 7. Качественная реакция на рибозу.
К 0,5 мл 0,1 % раствора РНК добавьте равный объем орцинового реактива (1г орцина в 500 мл 30 % раствора НCI + 5 мл 10 % раствора хлорида железа(III).
Кипятите 10 минут на кипящей водяной бане. В присутствии рибозы развивается зеленое окрашивание (под влиянием концентрированной соляной кислоты от рибозы отщепляется 3 молекулы воды и образуется метилфурфурол, который с орцином дает зеленое окрашивание).
Ответьте на вопросы:
Какие ферменты расщепляют нуклеиновые кислоты в ЖКТ?
Напишите параллельную цепь ДНК для участка: ААТЦЦГТТАТГГ. Укажите триплеты.
Перечислите основные этапы биосинтеза белка.
*Напишите последовательность цепи РНК для участка ДНК: ЦЦТГАТАЦЦТГА.
*Напишите уравнение реакции гидролиза мононуклеотида, образованного рибозой, аденином и остатком фосфорной кислоты.
2.8. Практическая работа
«Качественные реакции на витамины».
Цели практической работы:
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Реактивы:
Витамины или сироп «Пиковита».
Сульфаниловая кислота.
Раствор нитрита натрия.
20 % бикарбонат натрия.
Соляная кислота конц.
Серная кислота конц.
Цинк мет.
10 % уксусная кислота.
Ледяная уксусная кислота.
5 % ацетат меди.
5 % хлорид железа (3).
20 % соляная кислота.
20 % гидроксид натрия.
Реактив Фелинга.
Анилиновый реактив.
|
Оборудование:
Пробирки - 4 шт.
Глазные пипетки – 2 шт.
Спиртовка.
Пробиркодержатель.
|
Опыт1. Реакция с диазореактивом на тиамин (витамин В1).
Принцип: В основе реакции лежит способность витамина B1 в щелочной среде с диазореактивом (смесь солянокислого или сернокислого раствора сульфаниловой кислоты с раствором нитрита натрия) образовывать сложное комплексное соединение оранжевого или красного цвета.
Ход работы:
В пробирку налейте 1 мл раствора сульфаниловой кислоты и 1 мл раствора нитрита натрия. Образуется диазореактив.
Внесите небольшое количество (на кончике шпателя) порошка или 0,5 мл раствора тиамина и по стенке пробирки осторожно добавьте 1 мл 20 % раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета или красного цвета.
Опыт 2. Реакция восстановления рибофлавина (витамина В2).
Принцип: Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин (промежуточное соединение) красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин.
Ход работы:
В пробирку прилейте 1 мл раствора витамина В2, О,5 мл концентрированной соляной кислоты и опустите кусочек металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается.
Смесь сзболтайте. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.
Опыт 3. Реакция на витамин РР (антипеллагрический, В5).
Принцип: При нагревании витамина РР с раствором ацетата меди образуется плохо растворимый синий осадок медной соли витамина РР.
Ход работы:
В пробирку поместите 5—10 мг витамина РР и 1—2 мл 10 % раствора уксусной кислоты.
Смесь нагрейте.
К нагретому до кипения раствору прибавьте 1-2 мл 5 % раствора ацетата меди. Жидкость становится мутной.
Опыт 4. Реакция на пиридоксин (витамин В6).
Принцип: При взаимодействии пиридоксина с раствором хлорида железа жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования комплексной соли типа фенолята железа.
Ход работы:
В пробирке смешайте 1 мл водного раствора пиридоксина и 2 капли 5 % раствора хлорида железа (III) FeCI3.
Смесь встряхните. Наблюдается окрашивание жидкости в красный цвет.
Опыт 5. Реакция на витамин Р (витамин проницаемости, цитрин, рутин).
Принцип:
Хлорид железа (III) FeCI3 образует с рутином комплексные соединения, окрашенные в изумрудно-зеленый цвет.
Концентрированная серная кислота образует в флавонами и флавонолами флавилиевые соли, растворы которых имеют ярко-желтую окраску.
При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула рутинозы. Она затем распадается на глюкозу и рамнозу, которые обладают восстановительными свойствами.
Ход работы:
К 2 мл насыщенного водного раствора рутина прибавьте несколько капель 5 % раствора FeCI3 . Наблюдается появление зеленого окрашивания.
К 2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке пробирки 1 мл прибавьте концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо.
К 0,5 г рутина прибавьте 5 мл 20 % раствора соляной кислоты. Смесь кипятите в течении 1 мин, затем отфильтруйте. К фильтрату долейте 3 мл 20 % раствора гидроксида натрия и 3 мл свежеприготовленного реактива Фелинга. Смесь снова нагрейте до кипения. Наблюдают образование красного осадка закиси меди.
Опыт 6.Качественная реакция на никотиновую кислоту.
Принцип:
Никотиновая кислота при нагревании с раствором ацетата меди образует синий осадок медной соли витамина, который плохо растворим в воде.
Ход работы:
20 капель 3 % раствора никотиновой кислоты нагрейте до кипения, при этом мутный раствор витамина становится прозрачным.
Прибавьте 20 капель 5 % раствора ацетата меди, нагрейте до кипения и сразу охладите под струей холодной воды. Содержимое пробирки окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Опыт 7.Качественная реакция на витамин Е (токоферол).
Принцип:
Спиртовой раствор токоферола окисляется хлоридом железа (III) FeCI3 в токоферрилхинон красного цвета.
Ход работы:
В пробирку налейте 4-5 капель 1 % раствора токоферола.
Добавьте 0,5 мл 1 % раствора хлорида железа (III) FeCI3.
Тщательно перемешайте. Содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.
Опыт 8. Качественная реакция на витамин А (ретинол).
Принцип:
При взаимодействии раствора витамина А или рыбьего жира в хлороформе с ледяной уксусной кислотой, насыщенным раствором сульфата железа и концентрированной серной кислотой появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Каротины при этой реакции дают зеленое окрашивание.
Ход работы:
К 1-2 капли рыбьего жира добавьте 5-10 капель ледяной уксусной кислоты насыщенной сульфатом железа и 1-2 капли концентрированной серной кислоты.
Разотрите мякоть шиповника с песком и прибавьте с содержимому пробирки несколько капель хлороформа. Каротин при этом переходит в хлороформ. Слейте этот раствор в другую пробирку и прибавьте несколько капель концентрированной серной кислоты, нагрейте. Верхний слой хлороформа окрашивается в зеленый цвет, затем в синий.
Опыт 9.Качественная реакция на витамин Д (холекальцеферол).
Ход работы:
Ответьте на вопросы:
1. Чем отличаются авитаминоз и гиповитаминоз?
На чем основано качественное определение витаминов?
*Почему витамины нужно принимать только в определенных дозах? Ответ поясните.
В чем заключается биологическое значение витаминов?
*Приведите примеры участия витаминов в качестве составных частей в биологически активных веществах. Приведите примеры этих веществ.
Как происходит всасывание витаминов в ЖКТ?
Почему тертую морковь рекомендуют кушать с растительным маслом?
*Почему витамин В12 вводят внутримышечно, а не назначают в виде таблеток?
*Приведите примеры, когда минеральные вещества и витамины несовместимы.
2.9. Практическая работа
«Количественное определение витамина С
в моче и пищевых продуктах».
Цели практической работы:
закрепить знания о строении, свойствах и функциях витамина С;
закрепить умение титровать;
научиться проводить количественное определение витамина С.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Сделайте необходимые расчеты.
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Работа № 1. Определение витамина С в моче.
Принцип метода:
Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать краситель 2,6 – дихлорфенолиндофенол. Окисленная форма красителя обладает окраской (в кислой среде - розовой), восстановленная форма – бесцветная. Количество витамина С определяют, титруя исследуемый подкисленный раствор дихлорфенолиндофенолом до появления розовой окраски. Пока в растворе есть аскорбиновая кислота, краситель обесцвечивается, когда вся аскорбиновая кислота будет окислена, титруемый раствор приобретает розовую окраску.
Реактивы:
Уксусная кислота – 3%.
Дихлорфенолиндлфенол– 0,001н.
Дистиллированная вода.
Моча.
|
Оборудование:
Колба на 50 или 100 мл.
Пипетки на 1 мл и 5 мл.
Бюретка.
|
Ход определения:
В колбу наливают 1 мл мочи, 7 мл дистиллированной воды, 3 мл уксусной кислоты.
Смесь титруют дихлорфенолиндлфенолом до появления розовой окраски, устойчивой 30 с.
Для расчета содержания витамина С в суточной моче используют формулу:
А * 0.088 * 1500 = витамин С. мг,
Где:
1500 – суточный диурез;
0,088 – количество мг аскорбиновой кислоты, соответствующей 1 мл 0,001 н раствора дихлорфенолиндлфенола;
А – количество мл дихлорфенолиндлфенола, пошедшего на титрование исследуемого раствора.
Норма: с мочой за сутки выделяется от 20 до 40 мг витамина С.
Диагностическое значение: определение содержания витамина С в моче дает представление о запасах этого витамина в организме.
Работа № 2. Определение витамина С в продуктах питания.
Принцип:
Аскорбиновая кислота является сильным восстановителем и может быть определена йодометрическим методом при определенном значении рН раствора (например рН = 7). При титровании йодом аскорбиновая кислота окисляется, образуя дегидроаскорбиновую кислоту.
Реактивы:
Картофель, капуста.
Песок.
2 % соляная кислота.
0,5 % крахмал.
0,003 н. раствор йода.
|
Оборудование:
Ступка.
Химический стакан.
Воронка.
Вата.
Колба на 100 мл.
Титровальная колонка.
|
Ход работы:
1. Подготовка экстракта из пищевых продуктов для определения витамина С.
2 г капусты или картофеля натрите на терке в чашке Петри или мелко порежте и разотрите в ступке с небольшим количеством толченого стекла или песка.
Соберите массу из чашки Петри, если измельчали на терке, в стаканчик.
Добавьте 10 мл 2 %-го раствора НС1.
Если измельчали в ступке - добавьте прямо в ступку 10 мл 2 %-го раствора НС1.
Хорошо перемешанную массу отфильтруйте через стеклянную воронку с ватой в коническую колбу на 50 — 100 мл.
Массу на фильтре промойте несколькими каплями воды.
2. Определение количества витамина С.
В фильтрат прилейте 1 мл 0,5% раствора крахмала и оттитруйте его рабочим раствором 0,003 н. йода до появления синего окрашивания.
3. Расчет:
При расчете содержания витамина С в продукте использовать формулу определения массы при помощи титра по определяемому веществу:
М = Н * Э * V / 1000 (г)
Где:
Н - молярная концентрация эквивалента йода;
Э — молярная масса эквивалента аскорбиновой кислоты в г, равная в данном случае 88 г;
V — объем пошедшего на титрование йода, в мл.
Для пересчета на содержание витамина С в 100 г продукта использовать формулу:
Х = М * 1000 / 2 (г)
Норма:
Содержание витамина С в капусте 0,45 мг%, в картофеле — 20 мг%.
Для перевода мг% из грамм результат умножают на 100.
Ответьте на вопросы:
Напишите структурную формулу витамина С.
К какому классу органических соединений можно отнести витамин С?
Какие функции витамин С играет в организме?
На каких свойствах витамина С основано его колическтвенное определение?
В каких продуктах питания содержание витамина С наибольшее?
*От каких факторов зависит содержание витаминов в продуктах питания?
2.10. Практическая работа
«Качественные реакции на гормоны».
Цели практической работы:
закрепить знания о функциях гормонов в организме;
научиться проводить качественные реакции на гормоны.
Задания для самостоятельной работы:
Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Реактивы:
Растворы горомнов: инсулина, адреналина, кортизола (спиртовой).
10 % гидроксид натрия.
30 % гидроксид натрия.
1 % сульфат меди.
20 % сульфасалициловая кислота.
5 % ацетат свинца.
1 % сульфаниловая кислота.
Азотная кислота конц.
3 % хлорид железа (3).
5 % нитрит натрия.
10 % карбонат натрия.
2 % м-динитробензол (спиртовой).
Раствор гидроксида тетраметиламмония.
Раствор синего тетразолия.
Моча.
|
Оборудование:
Пипетки глазные – 2 шт.
Пробирки – 4 шт.
Спиртовка.
Пробиркодержатель.
|
Опыт 1. Качественные реакции на инсулин.
Принцип:
Инсулин является гормоном белковой природы, поэтому для него будут характерны все качественные реакции на белки.
1. Обнаружение инсулина биуретовой реакцией.
В пробирку к 5 каплям раствора инсулина прибавьте 5 капель 10% раствора едкого натра и 1 каплю 1 % раствора сернокислой меди.
Смесь перемешайте. Наблюдается появление фиолетового окрашивания. Объяснить механизм реакции.
2. Обнаружение инсулина реакцией с сульфосалициловой кислотой.
В пробирку внесите 1 мл раствора инсулина, добавьте 5 капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Наблюдается выпадение осадка белого цвета. Объясните механизм реакции.
3. Обнаружение инсулина реакцией Фоля.
В термостойкую пробирку внесите 5 капель раствора инсулина, 5 капель 30% раствора едкого натра и 1—2 капли 5% раствора уксуснокислого свинца.
Смесь нагрейте. При длительном нагревании жидкость в пробирке буреет и выпадает черный осадок сернистого свинца. Объяснить механизм реакции.
4. Реакция Геллера на инсулин.
К 10 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки прилейте равный объем (10 капель) раствора инсулина.
Пробирку наклоните под углом 45° так, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется белый аморфный осадок в виде небольшого кольца.
Опыт 2. Качественные реакции обнаружения адреналина.
Принцип:
Адреналин (метиламиноэтанолпирокатехин) – гормон мозгового вещества надпочечников – дает реакции, характерные для пирокатехинов. Адреналин с ионами железа (III) образует соединение изумрудно-зеленого цвета, легко окисляется диазореактивом с образованием адренохрома красного цвета.
1. Реакция с хлоридом железа (III).
В пробирку внесите 1 мл адреналина (1:1000), прибавьте 1 каплю 3% раствора хлорида железа (III) и перемешайте. Появляется изумрудно-зеленое окрашивание.
К смеси добавьте 1 каплю 10% раствора едкого натра — возникает вишнево-красное окрашивание.
2. Реакция с диазореактивом.
К 1 мл 1% сульфаниловой кислоты прибавьте 1 мл 5% раствора нитрита натрия (получается диазореактив).
К диазореактиву добавьте 1,5 мл раствора адреналина (1:1000) и 1мл 10% раствора карбоната натрия.
Смесь перемешайте. Раствор окрашивается в красный цвет.
Опыт 3. Качественное обнаружение 17-кетостероидов в моче с помощью m-динитробензола.
Принцип:
К «17-кетостероидам» относят стероиды, которые имеют карбонильную группу у 17 углеродного атома. Это метаболиты горомнов коры надпочечников и половых желез. 17-кетокортикостероиды с м-динитробензолом в присутствии щелочи образуют окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству стероидов в пробе.
В пробирку поместите 5 капель мочи, 5 капель 30% раствора едкого натра и 5 капель 2% спиртового раствора (в этаноле) m-динитробензола.
Смесь перемешайте. Через 2-3 минуты, при наличии 17-кортикостероидов, появляется красное окрашивание за счет образования продуктов конденсации циклопентанопергидрофенантрена с т-динитробензолом.
Опыт 4. Качественная реакция на кортизол.
Принцип:
Кортизол относится к стероидным гормонам. Реакция используется в колориметрическом методе для количественного определения содержания кортикостероидов в биологических жидкостях и основана на восстановлении синего тетразолия за счет оксикетонной группы у 17-го углеродного атома циклопентанпергидрофенантренового ядра.
К 1 мл спиртового раствора кортизола добавьте 0,25 мл раствора гидроксида тетраметиламмония и 0,25 мл раствора синего тетразолия.
Содержимое пробирки встряхните и оставьте в темноте на 25 мин. Жидкость окрашивается в розовый цвет.
Ответьте на вопросы:
На клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия:
а) с инсулином;
б) с глюкагоном;
в) адреналином;
г) йодтиронинами.
Каково влияние инсулина на процессы гликолиза и биосинтеза и распада гликогена?
Каковы пути катаболизма инсулина и адреналина?
В клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия с глюкокортикоидами?
Каков механизм действия глюкокортикоидов на клетки-мишени?
В чем заключается бологическое значение кортизола и 17-кетостероидов?
*Каково влияние глюкагона на процессы обмена углеводов, белков и липидов?
*Каково влияние адреналина на активность процессов в гликолиза, гликонеогенеза, биосинтеза и распада гликогена?
*Каково влияние йодтиронинов на метаболизм в организме человека?
*Каково влияние глюкокортикоидов на обмен углеводов в печени и скелетных мышцах.
2.11. Практическая работа
«Определение окислительных ферментов в биологическом материале».
Цели практической работы:
закрепить знания о механизме образования энергии в организме и её связи с обменом веществ;
научиться определять окислительные ферменты в биологическом материале.
Задания для самостоятельной работы:
1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
Оборудуйте рабочее место для практической работы.
Выполните практическую работу.
Оформите результаты работы оформить в виде таблицы:
№ п/п
|
Ход работы. Рисунки.
|
Наблюдения
|
Выводы
|
|
|
|
|
Сделайте вывод по работе.
Ответьте на дополнительные вопросы.
Реактивы:
Раствор формальдегида 0,4 %.
Метиленовая синь.
Растительное масло.
Молоко.
Слюна.
Кровь.
Физиологический раствор.
Раствор Н2SО4 10 %.
Раствор Н2О2 1,5 %.
Раствор КМnО4 0,1н.
|
Оборудование:
Глазные пипетки – 2 шт.
Пипетка на 1 мл.
Штатив с пробирками.
Термостат.
Коническая мерная колба.
|
Опыт № 1. Обнаружение альдегидоксидазы в молоке.
Принцип.
Альдегидоксидаза молока является флавопротеидом, способным окислять альдегиды. При добавлении к некипяченому молоку формальдегида и метиленовой сини фермент окисляет альдегид в муравьиную кислоту, а освободившийся при этом водород передается на метиленовую синь, восстанавливая её в бесцветное состояние. Реакцию используют, чтобы отличить кипяченое молоко от некипяченого.
Ход работы:
В две пробирки наливают по 15 капель молока.
Одну пробирку кипятят в пламени спиртовки, а затем охлаждают в струе воды.
В обе пробирки вносят по 1-2 капли 0,4 % раствора формальдегида и по 1 капле раствора метиленовой сини.
Содержимое пробирок перемешивают и добавляют 3 капли масла для создания анаэробных условий.
Пробирки помещяют в термостат при 37С и отмечают постепенное обесцвечивание.
Опыт № 2. Обнаружение каталазы в слюне и крови.
Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много её в строме эритроцитов и печени. В процессе окисления некоторых веществ образуется пероксид водорода, ядовитый для организма. Каталаза расщепляет пероксид водорода на молекулярный кислород и водород.
Ход работы:
В две пробирки внести 10-15 капель раствора перекиси водорода.
В первую пробирку добавить 3 капли слюны, во вторую – 3 капли крови. Что наблюдаете? Почему выделяется газ?
Внести в пробирку тлеющую лучинку. Лучинка вспыхивает. Почему?
Опыт № 3. Определение активности каталазы в слюне.
Принцип.
Метод основан на титриметрическом определении количества перекиси водорода, оставшегося в пробе после действия фермента. Перекись водорода оттитровывают 0,1 н. раствором перманганата калия.
Ход работы:
В две конические колбы (контрольная и опытная) вносят по 1 мл физраствора, 0,3 мл раствора перекиси водорода и 0,5 мл неразведенной слюны.
Опытную пробу оставляют стоять на 15 минут при комнатной температуре.
В контрольную пробу сразу же после добавления слюны приливают 3 мл раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек.
В опытную пробу через 15 минут инкубации добавляют 3 мл раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек.
Расчет проводят по формуле:
А = (К – О) * 0,3 (мг/ мл*мин)
Где:
А – активность каталазы.
К – количество перманганата калия, пошедшее на титрование контроля.
О – количество перманганата калия, пошедшее на титрование опыта.
0,3 – коэффициент, учитывающий титр перекиси водорода, количество
слюны в пробе и время инкубации.
Ответьте на вопросы:
С помощью какой химической реакции можно доказать, что молоко не кипяченое?
Где в организме встречается каталаза?
Какую функцию выполняют альдегидоксидаза и каталаза?
Что вы понимаете под активностью каталазы?
Дайте определение понятиям: цикл Кребса, ферменты, дыхательная цепь.
*Нарисуйте схематично процессы, происходящие в цикле Кребса и ЦПЭ.
*Как связаны в организме процессы обмена веществ и образования энергии?
Раздел 3. Ферменты.
Значение изучаемой темы:
В организме практически нет реакций, которые не катализировались бы ферментами. Ферменты обеспечивают существование таких важнейших процессов жизнедеятельности, как реализация наследственной информации, биоэнергетика, синтез и распад биологических молекул. Наука о питании основана на точных знаниях о расщеплении веществ под влиянием ферментов пищеварительного тракта. Действие многих лекарственных препаратов основано главным образом на взаимодействии с ферментами. Многие проблемы наследственной патологии человека тесно связаны с дефектами или полным отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста и развития, дифференцировки, физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транспорт веществ, процессы возбуждения и торможения) определяются в большей степени работой ферментов. Все вышеперечисленное позволяет считать данную тему основой для изучения всех последующих тем.
3.1. Преаналитический этап ферментативных исследований.
Основным биологическим материалом для исследования активности ферментов является свежая негемолизированная сыворотка крови или плазма, иногда свежая капиллярная или венозная кровь.
Забор крови проводится с 7 до 9 ч утра, натощак;
Перед анализом обследуемый должен исключить прием алкоголя, курение, физические нагрузки, прием лекарств;
Сдавливание сосудов при наложении жгута должно быть минимальным и не превышать 30 с;
В качестве антикоагулянта используют гепарин и его соли;
Исследование активности ферментов в сыворотке или плазме проводят в день взятия биоматериала, гепаринизированную кровь исследуют в течение 1 часа, свежую кровь – в течение 3 минут;
Следует помнить, что на активность ферментов влияет температура, наличие активаторов и ингибиторов, рН среды, поэтому все исследования проводят в сухих чистых пробирках, при 370С, строго соблюдая оптимальную рН исследуемого фермента;
Повторное оттаивание и замораживание сыворотки крови не допустимо.
3.2. Использование ферментов в медицине.
Использование ферментов в медицине возможно по трем направлениям:
1. Энзимопатология – изучает нарушения активности ферментов в развитии заболевания.
Энзимопатии – заболевания, характеризующиеся нарушением содержания того или иного фермента в организме. Они классифицируются:
Наследственные, связанные с полным нарушением биосинтеза какого-либо фермента;
Токсические, связанные с избирательным угнетением активности отдельных ферментов;
Алиментарные, вызванные дефицитом витаминов, белка, микроэлементов;
2. Энзимодиагностика – измерение активности или изоферментов в крови и моче для диагностики заболеваний, сопровождающихся разрушением клеток. Либо это применение ферментов для определения различных веществ в биологических жидкостях – ферментативный метод является наиболее специфичным и точным.
Требования к ферментам, используемым в клинико-биохимических исследованиях:
Органоспецифичность;
Низкая активность в крови в норме;
Выход в кровь только при повреждении соответствующего органа;
Высокая стабильность в крови;
Доступная методика определения активности фермента.
3. Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарственных средств.
Использование пищеварительных ферментов (фестал, мезим) при лечении нарушений пищеварения.
Фибринолизин применяют при лечении незаживающих ран, пролежней, для рассасывания тромбов.
Лидаза используется после операций для предотвращения образования грубых рубцов.
Трасилол, будучи ингибитором протеолитических ферментов, эффективен при лечении острых панкреатитов.
|
|
|
Скачать 1.34 Mb.