практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика

• Название: Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
• Анкор: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Дата: 23.11.2017
• Размер: 1.34 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Тип: Методическое пособие; #10387
• страница: 14 из 19

Практическая работа

3.8. Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать клинико-диагностическое значение определения аминотрансфераз в сыворотке крови;

- Уметь определять активность аминотрансфераз в сыворотке крови.
Принцип: в результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ, образуются щавеливоуксусная и пировиноградные кислоты. При добавлении раствора 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается, и возникают гидразоны пировиноградной кислоты. В щелочной среде они дают окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоте.

Реактивы: 1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый – 2 ммоль/л 2. 2,4 – динитрофенилгидразин – 1 ммоль/л 3. Гидрооксид натрия - 0,4 н. 4. Субстрат АсАТ/АлАТ. 5. Сыворотка 6.Физиологический раствор

Оборудование: 1. Термостат. 2. ФЭК, кюветы на 1 см. 3. 2 пробирки, 4. Штатив для пробирок 5. Пипетки на 1 и 5 мл 6. Дозатор на 0.05 мл

Ход определения.

Реактивы.		Опытная проба.	Контроль.
Субстрат		0.25 мл	0.25 мл
Физ. раствор		-	0.05 мл
Прогреть 5 минут в термостате при 37оС
Сыворотка		0.05 мл	-
Инкубировать в термостате на 30 минут при 37оС
Динитрофенилгидразин		0.25 мл	0.25 мл
Оставить стоять при комнатной температуре 20 минут
Гидрооксид натрия	2.5 мл		2.5 мл
Оставить стоять при комнатной температуре 5 минут

Оптическую плотность измеряем на ФЭКе при длине волны 500-530 нм(зеленый светофильтр), в кювете на 1 см и проводим расчеты по калибровочному графику.
Нормальные величины АлАТ и АсАТ:

0.1 – 0.68 мкмоль/мл, 0.1 – 0.75 мкмоль/мл
Клинико-диагностическое значение определения аминотрансфераз в крови.

Аминотрансферазы: аспартат- и аланинаминотрансферазы осуществляют весьма важную функцию – обратимый перенос аминогрупп с аминонокислот на кетокислоты. Содержатся во всех клетках человеческого организма (больше всего в ткани печени, мышцах сердца, скелетной мускулатуры, почках).

Активность АсАТ преобладает в мышечной ткани, а АлАТ – в печени.

Пределы колебаний активности ферментов в сыворотке крови у взрослых составляет: АсАТ – 0.1 – 0.45 мкмоль/л*ч,

АлАТ – 0.1 – 0.68 мкмоль/л*ч

Наиболее часто активность аминотрансфераз исследуют с целью дифференциальной диагностики патологии печени и миокарда. Увеличение активности аминотрансфераз наблюдается при:

• 
  Инфаркте миокарда активность АсАТ в 95% случаев повышается (активность КК, ЛДГ при этом повышена). Возрастание происходит на 4-6 ч. с момента приступа. Оно четко выражено спустя 24-36 ч. (увеличивается в 4-5 раз выше нормы) и лишь на 3-7 сутки снижается до нормы. Отношение показателей активностей КК/АсАТ имеет высокую значимость при дифференциальной диагностике инфаркта миокарда(отношение около 5) и поражениях скелетных мышц(около 27). Коэффициент де Ритиса АсАТ/АлАТ более 1.
  
• 
  Остром вирусном гепатите (АлАТ и АсАТ более чем в 100 раз). Коэффициент де Ритиса менее 1,33.
  

Быстрое снижение активности аминотрансфераз одновременно с возрастанием гипербилирубинемии свидетельствует об обширных некротических изменениях в ткани печени. В благоприятных ситуациях гепатита активность данных ферментов снижается медленно в течение нескольких недель и даже месяцев.

• 
  Хроническом гепатите;
  
• 
  Циррозе печени (активность повышается в 5-8 раз);
  
• 
  Механической желтухе (АлАТ повышается в 50 раз долго остается повышенной, сопровождаясь возрастанием активности ЩФ, ГГТП и содержанием билирубина);
  
• 
  Токсическом поражении печени;
  
• 
  Легочной эмболии (активность КК при этом не повышена);
  
• 
  Пораженияхмышц (мышечной дистрофии, дерматоитозит);
  

Снижение активности АсАТ и АлАТ наблюдаются при:

• 
  Снижении содержания в организме витамина В₆
  
• 
  Почечной недостаточности.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение активности аминотрансфераз в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   К какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?
   

2^*. Напишите уравнение реакции, которую катализирует АлАТ.

3. Назовите место локализации АлАТ и АсАТ.

4. Что такое коэффициент де Ритиса, как его рассчитывают, что он характеризует.

10. 
    Назовите основные заболевания, при которых изменяется активность аминотрансфераз. Объясните причину.
    

6^*.Назовите, какие еще ферменты изменяют свою активность при заболеваниях сердца; печени?

Практическая работа.

3.9. Определение активности кислой и щелочной фосфатаз в сыворотке крови.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать изоферменты, клинико-диагностическое значение определения фосфатаз в сыворотке крови;

- Уметь определять активность кислой щелочной фосфатазы в сыворотке крови;
Принцип метода: принцип определения активности фосфатаз основан на способности ферментов, отщеплять неорганический фосфат от нитрофенил-фосфата в щелочной среде.

Реактивы. Буфер, рН=10,4. 4-нитрофенилфосфат. NaOH 0.4 ммоль/л Сыворотка.

Оборудование. ФЭК, кювета на 10 мм. Термостат. Пробирки – 2 шт. Пипетки на 1 и 5 мл. Дозатор 0,02 мл.

Ход определения.

Реактив.	Опыт.	Контроль.
Рабочий реактив.	1,0	1,0
Сыворотка.	0,02	-
Перемешать, проинкубировать в течение 20 минут при 300С в термостате.
NaOH	5,0	5,0

Перемешать и измерить оптическую плотность опыта (Д) против контроля в кюветах на 10 мм, при длине волны 405 нм.

Расчет результатов:

ЩФ, МЕ/л = Д _* 812.
Нормальные величины: 30 –90 МЕ/л.
Диагностическое значение определения активности фосфатаз.
Фосфатазы – ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. Различают, кислую и щелочную фосфатазы.

ЩФ – ряд ферментов оптимум рН которых лежит в пределах 10. ЩФ представлена 11 изоферментами, встречается практически во всех органах и тканях, но наиболее богаты клетки костной ткани и печени.

Служит биохимическим маркером кальциево-фосфорного обмена костной ткани. Активность ЩФ в сыворотке крови детей в 2-3 раза выше активности взрослых (связано с усиленным ростом костей).

N составляет 0.5 – 1.3 ммоль/ч*л.

Увеличение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при:

• 
  механической желтуху
  
• 
  циррозе печени, холецистите, холестазе
  
• 
  рахите у детей
  
• 
  остеомаляции
  
• 
  болезни Педжета
  
• 
  миеломной болезни
  

Уменьшение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при:

• 
  гипотиреозе
  
• 
  старческий остеопороз
  
• 
  замедленном росте у детей
  
• 
  гиповитаминозе С
  
• 
  гипервитаминозе Д
  

КФ – представлена тремя разновидностями изоферментов:

1. простатический изофермент (локалзован в предстательной железе)

2. 
   печеночный изофермент
   
3. 
   эритроцитарный изофермент.
   

Наибольшее диагностическое значение имеет простатическая форма КФ.

N составляет 0.05-0.13 ммоль/ч*л.

Увеличение активности КФ в сыворотке крови наблюдается при:

• 
  простатите
  
• 
  раке предстательной железы
  
• 
  аденоме предстательной железы.
  
• 
  Метастазах
  
• 
  Множественной миеломе
  

Уменьшается активность сыворотке КФ при:

• 
  тромбоцитопениях
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение активности щелочной фосфатазы в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

6. 
   К какому классу ферментов относятся фосфатазы?
   
7. 
   Дайте определение понятию – изоферменты.
   
8. 
   Назовите сколько изоферментов существует у кислой фосфатазы, чем они отличаются друг от друга.
   
9. 
   Назовите основные заболевания, при которых изменяется активность кислой; щелочной фосфатаз. Почему?
   
10. 
    Какие еще ферменты изменяют свою активность при этих заболеваниях?
    

Раздел 6. Обмен липидов в норме и при патологии.
Значение изучаемой темы:

Липиды – это вещества, которые объединены в единый класс одним их свойством. Они не растворимы в воде. Роль липидов в организме весьма разнообразна. Одни из них служат формой депонирования (ТАГ) и транспорта (СЖК) веществ, при распаде которых высвобождается большое количество энергии, другие представляют собой важнейшие структурные компоненты клеточных мембран (Хс и ФЛ). Липиды участвуют в процессах терморегуляции, предохранении жизненно важных органов (почек) от механически воздействий (травм), потери белка, в создании эластичности кожных покровов, защите их от избыточного удаления влаги. Некоторые из липидов являются биологическими активными веществами, обладающими свойствами модуляторов гормонального влияния (простогландины) и витаминов (полиненасыщенные ЖК). Из холестерина образуются такие биологические вещества как стероидные гормоны, желчные кислоты, витамин Д. Именно с нарушением обмена холестерина связано такое распространенное заболевание как атеросклероз. Атеросклероз сопутствует ряду других патологий организма. Ожирение, желчно-каменная болезнь, липидозы являются заболеваниями, связанными с нарушением обмена липидов.

6.1. Методы исследования липидного обмена.
Методы определения холестерина и ТАГ, ЛП в сыворотке крови многочисленны; можно выделить химические, ферментативные и физико-химические методы.
Для оценки содержания ТАГ определяют глицерин, освободившийся после гидролиза ТАГ. Существуют два способа определения ТАГ в сыворотке крови – химический и ферментативный.

Химический метод – осуществляется в несколько этапов:

1. 
   экстракция ТАГ, с использованием органических растворителей (метанол, этанол, изопропанол);
   
2. 
   гидролиз ТАГ с образованием глицерина и жирных кислот, осуществляют с помощью этанольного раствора КОН;
   
3. 
   окисление глицерина в формальдегид;
   
4. 
   измерение образованного формальдегида.
   

Ферментативный метод – при этом не происходит освобождения глицерина из ФЛ и глюкозы, а только гидролиз ТАГ под действием специфических липаз. По сравнению с химическими ферментативный метод определения ТАГ обладает более высокой специфичностью и точностью, удобен для автоматизации.

Для определения ЛП обычно используют метод электрофореза, основанный на электрофоретической подвижности ЛП, он является наиболее достоверным. Электрофорез ЛП проводится на одной из поддерживающих сред: геле агарозы или бумаге. При электрофорезе ЛП сыворотки крови натощак, на электрофореграмме обнаруживают, как правило, три основных полосы с последовательно увеличивающейся подвижностью, соответствующие ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, если в сыворотке присутствовали хиломикроны они остаются на старте.

ЛП могут быть выделены путем метода ультрацентрифунирования в солевых растворах, который базируется на оценке плотности ЛП.

Для обнаружения ХМ и ЛПОНП существует метод наблюдения, основанный на том, что при 0⁰ С в течение 18-24 ч ХМ поднимаются на поверхность образуя сливкообразный слой, ЛПОНП остаются во взвешенном состояние, что делает пробу мутной во всем объеме плазмы.

Широко используется турбидиметрический метод определения ЛПНП, основанный на образовании гепаринлипопротеинового комплекса, способного осаждаться без денатурации в присутствии хлорида кальция.
6.2. Преаналитический этап исследований обмена липидов.
Для исследования содержания фракций липидов обычно используют сыворотку крови.

Подготовка пациента:

• 
  взятие материала для исследования липидов проводится натощак, не менее чем через 12-14 часов после приема пищи;
  
• 
  время взятия биологического материала с 7 до 9 ч утра, доставка в лабораторию не позднее 10 ч утра;
  
• 
  исключение алкоголя должно быть не менее, чем за 24 часа до взятия биоматериала, что особенно важно для таких показателей как ТАГ, Хс, ЛПВП;
  
• 
  за неделю до взятия крови из диеты следует исключить жиры, за две недели – препараты, снижающие уровень липидов;
  
• 
  сдавливание сосудов при наложении жгута должно быть минимальным и не превышать 1 мин;
  
• 
  физическая и мышечная нагрузка, тренировки должны быть исключены как минимум за 3 дня до взятия крови;
  
• 
  для исключения влияния положения тела, обследуемый должен находится в покое, сидеть или лежать не менее 5 мин, в связи с изменением концентрации ряда компонентов при переходе пациента из горизонтального положения в вертикальное;
  
• 
  в качестве антикоагулянта при получении плазмы рекомендуется использовать ЭДТА;
  
• 
  отделение полученной плазмы проводят не позднее чем через 2 ч;
  
• 
  сыворотку и плазму можно хранить в закрытом сосуде в холодильнике в течение 5 дней, при –20⁰С в течение 3 месяцев, повторное оттаивание и замораживание сыворотки не допускается.
  

Практическая работа

6.3. Определение ЛПНП в сыворотке крови

методом Бурштейна и Самая.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения содержания липидов и их фракций;

- Знать классификацию липопротеидов, диагностическое значение определения липопротеидов в сыворотке крови;

- Уметь определять содержание ЛПНП в предложенной сыворотке крови.

определения ферментов;
Принцип: раствор гепарина в присутствии ионов Са избирательно осаждает ЛПНП. Степень образования помутнения раствора, определяемая нефелометриески (ФЭКе), прямопропорциональна содержанию ЛПНП в сыворотке крови.

Реактивы: 0.02М раствор СаСI2. Раствор гепарина (1000 ед/мл). Сыворотка крови. Дистиллированная вода

Оборудование: Фотоколориметр. Пипетки на 2 мл, 0.2 мл. Дозаторы на 0.02 мл Кюветы на 5 мм. Стеклянная палочка. Фильтровальная бумага. Секундомер.

Ход определения:

1. 
   В кювету ФЭКа с длиной оптического пути 5 мм поместите 2 мл СаСI₂ и 0.2 мл сыворотки крови;
   
2. 
   Перемешайте стеклянной палочкой;
   
3. 
   Измерьте на ФЭКе, используя красный светофильтр, против дистиллированной воды, запишите показания ФЭКа - (Е₁);
   
4. 
   Затем в ту же кювету добавьте 0.04 мл раствора гепарина;
   
5. 
   Одновременно включите секундомер и тщательно перемешайте раствор стеклянной палочкой;
   
6. 
   Ровно через 4 минуты повторно проколориметрируйте - (Е₂).
   

Расчет:

Расчет проводят по формуле: Х = (Е₂ – Е₁) * 10, где

Х – содержание ЛПНП в г/л.
Нормальные величины: 3.0 – 4.5 г/л.
Диагностическое значение определения ЛПНП:

Увеличение показателей пробы отмечается при: атеросклерозе, ожирении, сахарном диабете, гипотиреозе, липоидном нефрозе.
Характеристика липопротеидов.
Липопротеиды – это транспортные формы липидов и других гидрофобных соединений. ЛП – это сферические частицы с гидрофильной оболочкой, образованной фосфолипидным монослоем, апобелками и свободным холестерином, гидрофобным ядром, состоящим из эфиров холестерина и ТАГ. В крови присутствует 4 основных класса ЛП: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности, липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности и множество промежуточных форм.

• 
  Хиломикроны – наиболее крупные липопротеиды. Содержат 98-99 % липидов и 1-2 % белка. Они образуются в клетках слизистой оболочки кишечника и обеспечивают транспорт липидов из кишечника в лимфу, а затем в кровь. Хиломикроны распадаются под действием фермента липопротеидлипазы. Кровь содержащая большое количество хиломикронов называется хилезной.
  
• 
  Липопротеиды очень низкой плотности ЛПОНП (бетта-липопротеины)– 7 - 10 % белка, 90-93 % липидов. Они синтезируются в печени и содержат 56 % ТАГ и 15 % холестерина от общего количества липидов. Основное назначение – транспорт ТАГ из печени в кровь.
  
• 
  Липопротеиды низкой плотности ЛПНП (бетта-липопротеины) – количество белка 9-20 %, липидов 91-80 %. Среди липидов преобладают холестерин и ТАГ (до 40 %). Образуются в кровотоке из ЛПОНП под действием липопротеидлипазы. Основное их назначение – транспорт холестерина в клетки органов и тканей. Разрушаются в лизосомах клетки.
  
• 
  Липопротеиды высокой плотности ЛПВП (альфа-липопротеины) – белка 35-50 %, липидов 65-50 %. Липиды представлены холестерином и фосфолипидами. Это самые мелкие из липопротеидов. Образуются в печени в «незрелом виде» и содержат только фосфолипиды, затем поступают в клетки тканей и «забирают» холестерин из клетки. В «зрелом» виде поступают в печень, где разрушаются. Основное назначение – удаление избытка холестерина с поверхности клеток.
  

Изменение содержания липидов в крови называется дислипидемией. Эти изменения чаще всего выражаются в увеличении количества липопротеидов – гиперлипопротеидемия. Существует классификация гипрелипопротеинемий, согласно которой различают 5 классов ГЛП:

I тип – гиперхиломикронемия (ХМ)

II_а тип - гипер –в- липопротеинемия (ЛПНП)

II_б тип – гипер-в и гиперпре-в-липопротеинемия (ЛПНП) и (ЛПОНП)

III тип – дис-в-липопротеинемия (измененных ЛПНП)

IV тип – гипер-пре-в-липопротеинемия (ЛПОНП)

V тип - гипер-пре-в-липопротеинемия и гиперхиломикронемия - (ЛПОНП), (ХМ). Наиболее атерогенными являются II и III типы, так как приводят к накоплению в плазме крови холестеринсодержащих ЛП.
Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение содержания липопротеидов в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Какая основная функция липопротеидов?
   

2^* Каким методом можно разделить липопротеиды на фракции и по какому принципу? Приведите их классификацию.

2. 
   Что такое хиломикроны? Где и как они образуются?
   
3. 
   Что обозначает термин «хилезная» кровь?
   
4. 
   Какие липопротеиды крови являются атерогенными (антиатерогенными)? Почему?
   

6^*. Назовите биохимические причины и факторы риска для развития атеросклероза.

Практическая работа

6.4. Определение содержания ТАГ в сыворотке крови ферментативным методом.

Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения содержания липидов и их фракций;

- Знать строение, синтез и распад ТАГ, диагностическое значение определения ТАГ в сыворотке крови;

- Уметь проводить определение ТАГ в предложенной сыворотке крови.
Принцип: триацилглицериды при воздействии ряда ферментов дают образование хинонимина. Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации ТАГ в пробе.

Реактивы: Буферный раствор рН=7.5 Лиофилизат. Стандартный раствор-2.85ммоль/л Вода дистиллированная. Сыворотка или плазма

Оборудование: Пробирки – 3 шт. Фотоколориметр. Кюветы на 5 мм. Пипетки на 2 мл, Дозаторы на 0.02 мл.

Подготовка реактивов:

Растворите содержимое флакона 2 (лиофилизат) в 50 мл раствора 1 (буфер), выдержите при комнатной температуре 20-30 минут. Полученный реагент стабилен 30 дней при 2 - 4^оС. реагент 3 готов к работе. Плотно закрывать флаконы сразу же после использования!
Ход определения:

Реактивы.	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль. Мл
Сыворотка	0.02	-	-
Вода дист.	-	-	0.02
Рабочий реагент	2.0	2.0	2.0
Стандартный раствор	-	0.02	-

Реакционную смесь тщательно перемешивайте и инкубируйте при комнатной температуре не менее 5 минут. Измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против контрольной в кюветах с длиной оптического пути 5 мм при длине волны 505 нм. Окраска стабильна не менее 1 часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет:

С = (Е_о/Е_ст* 2.85) – 0.11 ммоль/л

Нормальные величины: 0.55 – 1.65 ммоль/л
Диагностическое значение определения ТАГ.
Триацилглицериды – сложные эфиры глицерина и высших жирных кислот. Нейтральный жир, поступающий с пищей, гидролизуются в просвете тонкого кишечника; продукты распада (глицерин и ВЖК) используются в клетках слизистой оболочки тонкого кишечника для ресинтеза ТАГ, которые включаются в состав хиломикронов.

Образующиеся в процессе липолиза жировой ткани свободные жирные кислоты используются в печени для биосинтеза триацилглицеридов, которые секретируются в кровяное русло в составе ЛПОНП. Если содержание ТАГ оказывается больше 5.6 ммоль/л, сыворотка становится мутной.

Для исследования используется сыворотка крови. Определение ТАГ в плазме крови необходимо проводить немедленно натощак (желательно не принимать пищу не менее 16 часов). Однако если сыворотку отделить от сгустка и заморозить, то исследование можно отсрочить.

Показатели нормы содержания ТАГ в плазме - 0.55 –1.65 ммоль/л. следует стремиться к тому, чтобы концентрация ТАГ в плазме крови была меньше 2.3 ммоль/л. Слабо выраженная гипертриглицеридемия отмечается при содержании ТАГ в крови 2.3 –5.6 ммоль/л, выраженная – при уровне ТАГ больше 5.6 ммоль/л.

Увеличение концентрации ТАГ отмечается при:

• 
  Хронической ишемической болезни сердца (вызванной атеросклеротическими изменениями в организме).
  
• 
  Вирусном гепатите.
  
• 
  Заболеваниях связанных с застоем желчи в печени, обтурацией желчных ходов и общего желчного протока.
  
• 
  Панкреатите.
  
• 
  Хронической почечной недостаточности, нефротическом
  
• 
  синдроме.
  
• 
  Подагре.
  
• 
  Снижении функции щитовидной железы.
  
• 
  Хроническом алкоголизме.
  
• 
  Лечении кортикостероидами, мочегонными, бета-блокаторами.
  

Снижение концентрации ТАГ отмечается при:

• 
  Гипертиреозе.
  
• 
  Синдроме мальабсорбции.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение содержания ТАГ в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   ТАГ - строение, свойства, функции, локализация в организме.
   
2. 
   Каковы особенности синтеза ТАГ в печени, мышцах, жировой ткани.
   
3. 
   Каким образом ТАГ используется организмом человека.
   
4. 
   Методы исследования ТАГ в организме человека.
   
5. 
   Охарактеризуйте все этапы переваривания липидов в ЖКТ.
   
6. 
   Дайте характеристику преаналитической стадии подготовки биоматериала для исследования липидов.
   

Практическая работа

6.5. Определение общего холестерина в сыворотке крови.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения содержания липидов и их фракций;

- Знать строение, свойства, синтез, распад холестерина; клинико-диагностическое значение определения общего холестерина;

- Уметь определять содержание общего холестерина в предложенной сыворотке крови.
Принцип: при гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Реактивы: Буферный раствор. Лиофилизат. Стандартный раствор холестерина – 5. 17 ммоль/л. Сыворотка или плазма. Дистиллированная вода.

Оборудование: Фотоколориметр. Кюветы с длиной оптического пути 5 мм. Пробирки – 3 шт. Пипетки на 2,0 мл Дозатор на 0,02 мл

Подготовка реагентов:

Содержимое флакона 2, аккуратно перемешайте, растворите во флаконе 1. Выдержите рабочий реагент при комнатной температуре 20 минут. Реагент стабилен не менее 6 месяцев при 2 – 4^оС.
Ход определения:

Реагенты.	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0.02	-	-
Вода дист.	-	-	0.02
Реактив для определения холестерина	2.0	2.0	2.0
Раствор холестерина.	-	0.02	-

Реакционную смесь тщательно перемешайте и инкубируйте не менее 5 минут при комнатной температуре и измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контроля в кюветах с длиной оптического пути 5 мм при длине волны 500нм.

Расчет концентрации холестерина проводят по формуле:

С = Е_о/Е_ст * 5.17 ммоль/л.

Нормальные величины:

идеальное содержание менее 5.2 ммоль/л.

допустимое 5.2 – 6.5 ммоль/л.

патологическое содержание более 6.5 ммоль/л.

Диагностическое значение определения общего холестерина.
Холестерин - это вторичный одноатомный ароматический спирт. Он обнаруживается во всех тканях и жидкостях человеческого организма, как в свободном состоянии, так и в виде сложных эфиров. У практически здоровых людей 2/3 холестерина плазмы содержится в составе атерогенных , 1/3 – антиатерогенных липопротеидов. Не менее 10% населения страдает гиперхолестеринемией. Это может привести к серьезным патологическим изменениям сосудистой стенки. Уровни содержания Хс и ТАГ в крови являются наиболее важными показателями липидного обмена. Существует прямая зависимость между увеличением концентрации Хс в плазме и появлением риска атеросклеротического поражения коронарных сосудов.

В норме уровень общего Хс колеблется в широких пределах – 3.6 – 6.7 ммоль/л, рекомендуемые значения – меньше 5.2 ммоль/л, повышенные – более 6.5 ммоль/л. Материалом для исследования является служит сыворотка или плазма.

Увеличение концентрации Хс в сыворотке отмечается при:

• 
  Первичных гиперлипопротеинемий (наследственно обусловленных нарушениях метаболизма)
  
• 
  Вторичных гиперлипопротеинемий – ишемическая болезнь, заболевания печени, поражения почек, снижение функции щитовидной железы, заболевания поджелудочной железы, сахарный диабетбеременность, алкоголизм, прием лекарств.
  

Уменьшение концентрации Хс в сыворотке отмечается при:

• 
  Голодании.
  
• 
  Злокачественных новообразований.
  
• 
  Болезнях печени (цирроз в позней стадии заболевания, острая дистрофия, инфекции).
  
• 
  Повышенной функции щитовидной железы.
  
• 
  Анемии
  

Использование теста целесообразно для исследования пациентов с ранними факторами риска атеросклероза, с заболеваниями сосудов и сердца, ксантомами, гиперурекемией, ожирением, людей, злоупотребляющих курением.
Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение содержания общего холестерина в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Холестерин - строение, свойства, формы нахождения в организме.
   
2. 
   Перечислите основные функции холестерина.
   
3. 
   Напишите схему синтеза Хс в организме человека, укажите локализацию и ферменты процесса.
   
4. 
   Роль Хс в развитии атеросклероза, ИБС.
   
5. 
   Перечислите методы исследования Хс.
   
6. 
   Диагностическое значение определения Хс в сыворотке крови
   

Практическая работа

6.6. Определение фракций холестерина в сыворотке крови.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения содержания липидов и их фракций;

- Знать фракции холестерина их клинико-диагностическое значение, роль холестерина в развитии атеросклероза;

- Уметь определять содержание фракций холестерина в сыворотке крови.
Принцип: хиломикроны, ЛПОНП и ЛПНП осаждаются при добавлении к образцу фосфорно-вольфрамовой кислоты и ионов магния. После центрифугирования в супернатанте остаются только ЛПВП, концентрация которых определяется так же, как концентрация общего холестерина.

Реактивы: Осаждающий реагент. Сыворотка или плазма. Дистиллированная вода. Реагент для определения общего холестерина.

Оборудование: Фотоколориметр. Кюветы на 5 мм. Центрифуга. Пробирки – 6 шт. 5. Пипетки на 1 и 0.2 мл

Подготовка реактивов:

Реактивы готовы к работе. Если набор для определения концентрации общего холестерина используется для определения только ЛПВП-холестерина стандарт, входящий в состав набора лучше развести 0.9% хлоридом натрия в 4 раза. Концентрация холестерина в полученном растворе будет равна – 1.29 ммоль/л.
Ход определения:

1. 
   Преципитация:
   

Реагенты	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0.15	-	-
Вода дист.	-	-	0.15
Осаждающий реагент	0.3	0.3	0.3
Раствор холестерина	-	0.15	-

Хорошо перемешайте и оставьте на 10 минут при комнатной температуре. Опытную пробу центрифугируйте 10 минут при 4000 об/мин. Прозрачный супернатант используйте для определения концентрации ЛПВП. Определите концентрацию холестерина во всех пробах в течение 1 часа.

2. 
   Определение концентрации ЛПВП-холестерина:
   

Реагенты	Опыт, мл	Калибровка, мл	Контроль, мл
Супернатант	0.2	-	-
Вода+реагент 1	-	-	0.2
Рабочий реагент для определения холестерина	2.0	2.0	2.0
Раствор холестерина + реагент 1	-	0.2	-

Реакционную смесь перемешайте и инкубируйте 15 минут при комнатной температуре или 10 мин при 37^о С и измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной в кюветах на 5 мм при длине волны 500 нм.
Расчет концентрации ЛПВП:

С = Е_о/Е_ст * 1.29, при разведении стандартного раствора, или

С = Е_о/Е_ст * 5.17, при использовании исходного стандарта.
Нормальные величины:

Мужчины более 1.42 ммоль/л, женщины более 1.68 ммоль/л.

Расчет концентрации ЛПНП

С = (Общий холестерин)- (ЛПВП-холестерин)- (ТАГ/2.2)ммоль/л

Нормальные величины:

Менее 3.9 ммоль/л, патология более 4.9 ммоль/л.
Диагностическое значение определения фракций холестерина.
Хс – ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности, или альфа – холестерин. В организме осуществляет защитную, антиатерогенную функцию. Является критерием, отражающим состояние липидного обмена.

Уровень Хс-ЛПВП определяется как содержание холестерина сыворотки, оставшееся в сыворотке после осаждения из нее ЛПНП и ЛПОНП. Особенностью функционирования ЛПВП является то, что они осуществляют транспорт Хс от клеток сосудистой стенки, периферических органов в печень, где Хс превращается в желчные кислоты и выводится из организма.

Показатели нормы содержания Хс-ЛПВП в плазме крови составляют 0.9 –1.9 ммоль/л. Снижение концентрации Хс-ЛПВП до уровня 0.9 ммоль/л вызывает повышенный риск атеросклероза (уменьшение концентрации Хс-ЛПВП с 0.91 до 0.78 ммоль/л – сопровождается трехкратным повышением риска развития ИБС). Увеличение концентрации Хс-ЛПВП плазмы сопровождается усилением антиатерогенного влияния ЛПВП.

Повышение концентрации Хс-ЛПВП в плазме отмечается при:

• 
  большой регулярной физической активности;
  
• 
  влиянии некоторых лекарств, понижающих содержание общих липидов;
  
• 
  циррозе печени;
  
• 
  алкоголизме;
  
• 
  раке кишечника;
  

Снижение концентрации Хс-ЛПВП отмечается при:

• 
  атеросклерозе;
  
• 
  инфаркте миокарда;
  
• 
  сахарном диабете;
  
• 
  туберкулезе легких;
  
• 
  нефротическом синдроме;
  

Снижение уровня Хс-ЛПВП сопровождает факторы риска ИБС, к числу которых относят:

• 
  курение;
  
• 
  ожирение;
  
• 
  малоподвижный образ жизни;
  
• 
  гипертензию.
  

Хс-ЛПНП – холестерин липопротеинов низкой плотности или бета-холестерин. ЛПНП – основная транспортная форма Хс, переносящая его главным образом в виде эфиров Хс из печени в клетки органов и тканей.

В норме содержание Хс-ЛПНП в плазме ниже 3.5 ммоль/л, повышенные – 3.5 –4.0 ммоль/л, высокие - более 4.0 ммоль/л.

Увеличение концентрации Хс-ЛПНП в плазме отмечается при:

• 
  Ппрвичных гиперлипопротеинемий (наследственно обусловленных нарушениях метаболизма);
  

• 
  ожирении;
  
• 
  ишемической болезни сердца;
  
• 
  заболеваниях печени;
  
• 
  нефротическом синдроме
  
• 
  сахарном диабете;
  
• 
  гипотиреозе.
  

Уменьшение концентрации Хс-ЛПНП в сыворотке отмечается при:

• 
  голодании;
  
• 
  злокачественных новообразованиях;
  
• 
  гипертиреозе;
  
• 
  поражении ЦНС;
  
• 
  лихорадочных состояниях;
  
• 
  анемии;
  
• 
  заболевания легких;
  
• 
  обширных ожогах.
  

Для оценки фракций холестерина используют формулу Фривальда:
Хс-ЛПНП = общий Хс – (Хс-ЛПВП = ТАГ/2.2)
Для оценки соотношения атерогенных и антиатерогенных ЛП используют холестериновый коэффициент атерогенности (индекс атерогенности, ИА), рассчитываемый на основании формулы:
ИА = (Общий Хс – Хс-ЛПВП) / (Хс-ЛПВП)
Индекс атерогенности является идеальным у младенцев (не более 1), достигает примерно 2.5 у здоровых мужчин и 2.2 у здоровых женщин. У мужчин 40-60 лет без клинических проявлений атеросклероза этот коэффициент составляет 3-3.5, у лиц с ИБС – более 4, достигая нередко 5-6 единиц.
Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение содержания фракций холестерина в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  

Ответьте на дополнительные вопросы.

Ответьте на вопросы:

1. 
   Хс- ЛПНП: строение, место образования, функции в организме.
   
2. 
   Хс-ЛПВП: строение, место образования, функции в организме.
   
3. 
   Метод определения Хс-ЛПВП.
   

4^*Рассчитайте содержание Хс-ЛПНП и индекс атерогенности для исследуемого образца.

5. Перечислите клинические признаки гиперлипопротеидемии.