практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика

• Название: Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
• Анкор: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Дата: 23.11.2017
• Размер: 1.34 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Тип: Методическое пособие; #10387
• страница: 16 из 19

Раздел 8. Кислотно-основное состояние организма.
Значение изучаемой темы:

Среди физико-химических показателей организма важнейшее место принадлежит кислотно-основному равновесию крови. От соотношения концентрации ионов водорода и ионов ОН^- крови зависит активность ферментов. Интенсивность окислительно-восстановительных реакций, процессы расщепления и синтеза белка, окисления углеводов и липидов, чувствительность клеточных рецепторов к медиаторам и гормонам, проницаемость клеточных мембран, физико-химические свойства коллоидных систем клеток и межклеточных структур.

Пределы изменения рН крови являются жизненно важными и наиболее жесткими из всех известных гомеостатических показателей. Даже небольшие их отклонение влекут за собой нарушения жизненно важных физиологических процессов.

1. 
   Методы исследования КОС.
   

Исследования кислотно-основного равновесия крови проводят на специальных газоанализаторах, которые прямым методом измеряют рН (потенциометрия) и рСО₂ (полярография), а также температуру и барометрическое давление. Затем автоматически проводятся расчет остальных показателей КОР.

Для оценки и правильной диагностики нарушений КОР крови существуют специальные номограммы. В номограммах указана область нормальных значений КОР крови, острых или хронических метаболических и респираторных нарушений. При нанесении полученного анализа на такую номограмму можно четко определить, какое нарушение КОР имеется у больного и правильно выбрать метод его коррекции.
8.2. Преаналитический этап исследований КОС.
Для исследования КОР идеальным материалом является артериальная кровь, которую обычно берут из лучевой, локтевой, бедренной артерий стеклянным или пластиковым шприцом.

• 
  Время взятия крови с 7 до 9 ч, натощак, исключая физическую активность за 3 дня до исследования;
  
• 
  За 5 минут до взятия крови обследуемый находится в покое, взятие проводят в одном положении – сидя или лежа;
  
• 
  Время наложения жгута не превышает 1 мин;
  
• 
  Основное требование к получению материала – взятие в анаэробных условиях, отсутствие пузырьков воздуха в шприце, выбор адекватного антикоагулянта без его избытка (гепарин);
  
• 
  Исследование крови после забора должно быть выполнено не позднее чем через 5-10 мин, если исследование не может быть выполнено в указанные сроки, закупоренный шприц помещают в воду с кусочками льда, не более чем на 1 час;
  
• 
  Перед исследованием шприц с кровью извлекают из ледяной бани и выдерживают при комнатной температуре не менее 10 мин;
  
• 
  Перед измерением кровь перемешивают путем вращения шприца между ладонями и переворачиванием его вверх и вниз;
  
• 
  У пациентов в критическом состоянии анализ выполняют немедленно.
  

Практическая работа

8.4. Определение буферной емкости сыворотки крови.
Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения кислотно-основного состояния крови;

- Знать буферные системы: определение, типы, механизм действия, значение для организма;

- Уметь определять буферную емкость предложенной сыворотки крови.

Реактивы: вода дистиллированная; физиологический раствор; фосфатный буфер рН-7,4; гидрооксид натрия рН=9; сыворотка.

Оборудование: бюретка для титрования; колбы –2 шт; воронка; химический стакан.

Ход работы.

• 
  Возьмите две колбы, в одну налейте 2 мл сыворотки крови, разведенной в 10 раз, во вторую – 2 мл фосфатного буфера рН=7,4, разведенного в 10 раз водой;
  
• 
  Добавьте в обе колбы по 2 капли индикатора фенолофталеина;
  
• 
  Оттитруйте содержимое обеих колб 0,1н NaOH до появления малиновой окраски (рН-9,0).
  

Расчет проводят по формуле:
Буферная емкость = А_*10_*н / (рН₁ – рН₀)_*2, где
А – мл щелочи, пошедшей на титрование;

10 – разведение сыворотки;

н – молярная масса эквивалента щелочи;

рН₀ – водородный показатель до начала титрования (рН=7.4)

рН₁ – водородный показатель после окончании титрования (рН₁=9);

2 – объем взятой сыворотки.

• 
  Сравните буферную емкость сыворотки крови с буферной емкостью фосфатного буфера и сделайте соответствующие выводы.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение буферной емкости предложенной сыворотки;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Заполните бланки анализа;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  
• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Что называют «буферными системами»? их биологическое значение. Примеры.
   
2. 
   Какие буферные системы находятся в крови человека? Напишите их формулы.
   
3. 
   Какие показатели характеризуют кислотно-основное состояние в организме человека?
   
4. 
   Что называют: а) метаболическим ацидозом? б) респираторным ацидозом? в) метаболическим алкалозом? г) респираторным алкалозом? Приведите примеры заболеваний с нарушением КОС.
   

Раздел 9. Гемостаз.
Значение изучаемой темы:

Данный раздел является актуальным и клинически значимым, так как нарушения свертывания крови наблюдаются довольно часто: при острых лейкозах, некоторых видах анемий, циррозе печени, гемофилиях, недостаточности витамина К и при многих других состояниях и заболеваниях, отягощая их течение. Знание этой темы важно и для лаборантов клинических и биохимических лабораторий, так как именно они проводят основные исследования показателей гемостаза.

9.1. Методы исследования гемостаза.
Методы исследования коагуляционного гемостаза значительно различаются по принципу исследования и возможностям визуальной и автоматизированной оценки результатов. Современная аппаратура для исследования свертывания крови основана, как правило, на 4 основных методах.

1. Турбидиметрический метод.

Образование фибрина под действием тромбина проявляется повышением мутности исследуемого образца, что детектируется фотометром.

2. Кинетический метод.

Конечный результат определяется по скорости изменения оптической плотности. Исследуемая плазма инкубируется с ферментом, и остаточная ферментативная активность определяется в реакции с хромогенными субстратами. Концентрация исследуемого вещества прямо или косвенно пропорциональна скорости гидролиза субстрата и выражается средним изменением плотности в минуту.

3. Метод конечной точки.

В этом методе гидролиз хромогенного субстрата останавливается уксусной кислотой. В момент такой остановки оптическая плотность пропорциональна концентрации исследуемого вещества и выражается в единицах экстинции.

4. Метод фиксированной оптической плотности.

Тромбин, участвуя в реакции гидролиза субстрата, обуславливает изменение цвета исследуемого образца. Результатом является время между началом исследования и моментом, когда оптическая плотность образца достигает 0,1 единицы оптической плотности.
9.2. Преаналитический этап исследований гемостаза.
Для исследования системы гемостаза в биохимических исследованиях используют плазму, получаемую из венозной крови.

Подготовка обследуемых:

• 
  Забор крови делают утром с 8 до 10 часов и натощак.
  
• 
  Исключить физическое перенапряжение и эмоциональное возбуждение (дать обследуемому 15 минут отдохнуть).
  
• 
  Исключить курение и прием алкоголя непосредственно перед обследованием.
  
• 
  Первые 5-6 капель выпускают на ватный тампон, т.к. они могут содержать тканевой тромбопластин.
  
• 
  До центрифугирования пробирки ставят в ледяную баню (кроме исследования функции тромбоцитов).
  
• 
  Интервал времени между забором крови и исследованием существенно сказывается на многих параметрах коагулограммы (1-3 часа), поэтому в результатах анализа указываю время забора крови и начала исследования.
  
• 
  Пробирки лучше использовать стеклянные силиконированные (для уменьшения контактной активации гемостаза) или пластиковые.
  
• 
  Если гематокритный показатель близок к нормальному (40 - 45 %), то соотношение крови и антикоагулянта должно составлять 9 : 1. Если гематокрит не в норме, то соотношение расчитываю по формуле:
  

Р_X = Р (100 – Н) : (595 – Н), мл.

Р – нужное количество крови.

Н – гематокритный показатель в %.

• 
  Взятие крови целесообразно проводить не в одну пробирку, а дробно – в несколько пробирок с соответствующей расфосовкой антикоагулянта – стабилизатора.
  
• 
  В качестве антикоагулянта используют 3,8 % раствор цитрата натрия или тринатрийцитрата, т.к. в цитратной крови (плазме) лучше сохраняются лабильные факторы свертывания крови и тромбоциты.
  
• 
  Ацетилсалициловая кислота, нестероидные противовоспалительные средства, пенициллин, стрептокиназа, урокиназа увеличивают время кровотечения.
  

Получение биологического материала для гематологических исследований.
Получение стабилизированной крови.

В пробирку набирают антикоагулянт и кровь в рассчитанном соотношении. Немедленно перемешивают, не допуская образования воздушных пузырей. Ставят пробирку до центрифугирования в ледяную баню.
Получение плазмы крови богатой тромбоцитами (тромбоцитарная).

Стабилизированную кровь центрифугируют при 1000 – 1500 об/мин в течении 5-7 минут и собирают супернатант.
Получение плазмы крови бедной тромбоцитами (бестромбоцитарной).

Стабилизированную кровь или тромбоцитарную плазму центрифугируют при 300 – 4000 об/мин в течении 15-20 минут и собирают супернатант.
Тромбоцитарную и бестромбоцитарную плазму отсасывают стеклянными силиконированными или пластиковыми пипетками в стеклянные силиконированные или пластиковые пробирки. До исследования плазму хранят в ледяной бане. Исследования должны быть проведены в течении 1-3 часов после взятия крови. Для исследования функциональной активности тромбоцитов их хранят при комнатной температуре.
Практическая работа

9.3. Определение активности факторов протромбинового комплекса.
Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать определение гемостаза, виды и структурные компоненты гемостаза.

- Уметь определить активность факторов протромбинового комплекса (протромбиновое время и протромбиновый индекс) в исследуемой плазме.
Принцип: определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы в присутствии оптимального количества кальция и избытка тромбопластина.

Это вариант определения времени рекальцификации плазмы с добавлением тканевого тромбопластина. В комплексе с фактором VII и Са он непосредственно активирует фактор X, так что результаты теста зависят от активности фактора VII и факторов включающихся в процесс свертывания крови на этапах тромбино- и фибринообразования (факторов II, V, VII).
Реактивы: Оборудование:

1. 
   Раствор тромбопластина - 1%. 1. Термостат на 37 ⁰С;
   
2. 
   Раствор хлорида кальция – 0,025М; 2. Пробирки;
   
3. 
   Хлорид натрия – 0,85%; 3. Дозаторы на 0,1 и 0,2 мл;
   
4. 
   Плазма крови бедная тромбоцитами. 4. Секундомер.
   

Ход определения:

• 
  Приготовить свежий раствор тромбопластина, для этого 50 мг тромбопластина помещают в центрифужную пробирку тщательно растирают с 5 мл воды до получения однородной суспензии, которую прогревают 30 мин на водяной бане, периодически перемешивая, затем центрифугируют 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой в сухую пробирку и используют для реакции. Суспензию тромбопластина готовят каждый раз перед реакцией;
  
• 
  Плазму разводят 0,85 % хлорида натрия в соотношении 1:1;
  
• 
  В пробирку приливают 0.2 мл CaCI₂ и 0.1 мл суспензии тромбопластина;
  
• 
  Помещают пробирку в термостат при 37⁰С на 30 секунд;
  
• 
  Затем добавляют 0.1 мл разведенной плазмы, немедленно включают секундомер;
  
• 
  Через каждые 15 секунд наклоняют пробирку на 45 градусов и отмечают появление нитей или сгустка фибрина.
  

Протромбиновая активность может выражаться в процентах по отношению к здоровому человеку-донору, тогда называется – протромбиновым индексом.
Протромбиновый индекс = (протромбиновое время здорового человека / протромбиновое время обследуемого) _* 100%
В норме протромбиновое время 12-20 с;

протромбиновый индекс - 80-100%.
Клиническое значение:

Протромбиновое время характеризует механизм образования тромбокиназы (II фазу свертывания).

Удлинениепротромбинового времени (снижение протромбинового индекса) наблюдается при врожденной или приобретенной недостаточности факторов, отражающих функционирование внешнего механизма образования протромбокиназы, ее действие на протромбин и посдующее образование фибрина (I, II, V, VII, X). Обычно оно отмечается у больных принимающих антикоагулянты, при тяжелых поражениях паренхимы печени и недостатке витамина К(механическая желтуха, нарушения всасывания в кишечнике, кишечный дисбактериоз).
Задание для самостоятельной работы:

• 
  Перепишите методику и клинико-диагностическое значение определения активности факторов протромбинового комплекса.
  
• 
  Выполните практическую работу.
  
• 
  Заполните бланк анализа.
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  
• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Кто является основоположником теории гемостаза?
   
2. 
   Дать определение термину – гемостаз.
   
3. 
   Назовите структурные компоненты системы гемостаза.
   
4. 
   Дать характеристику первичному гемостазу.
   
5. 
   Дать характеристику вторичному гемостазу.
   

6^*. При участии, какого типа гемостаза происходит остановка кровотечения после прокола пальца скарификатором?

7. Сравните первичный и вторичный гемостаз, найдите основные отличия, оформите их в виде таблицы.

8. Опишите преаналитический этап исследования системы гемостаза.


Практическая работа

9.4. Определение содержание фибриногена гравиметрическим методом.
Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать характеристику коагуляционного гемостаза, классификацию и характеристика факторов свертывания, фазы свертывания крови.

- Уметь определять содержание фибриногена в исследуемой плазме.
Принцип: количество образовавшегося фибрина эквивалентно содержанию фибриногена в плазме.

Реактивы: 1. Раствор хлорида кальция – 5 % 2. Раствор тромбопластина – 1% 3. Плазма крови.

Оборудование: Серологические пробирки. Стеклянная палочка. Секундомер. Пипетки на 1 мл. Дозатор на 0,1 мл. Фильтры. Весы торсионные.

Ход определения:

• 
  1 мл плазмы без признаков гемолиза помещают в серологическую пробирку,
  
• 
  Прибавляют 0.1 мл хлорида кальция и 0,1 мл тромбопластина.
  
• 
  Содержимое перемешивают стеклянной палочкой, которую оставляют в плазме, включают секундомер и регистрируют время свертывания крови. В норме оно составляет 7-15 минут.
  
• 
  Образовавшийся фибрин наматывают на стеклянную палочку при помощи фильтра. Фибрин снимают со стеклянной палочки и отжимают сыворотку, перемещая сгусток по фильтру при помощи стеклянной палочки. Так делают до тех пор, пока в проходящем свете на бумаге не исчезнут следы влаги.
  
• 
  Высушенный фибрин немедленно взвешивают на торсионных весах.
  

В норме вес сгустка 9 - 15 мг или 2-4 г/л.

Для пересчета фибриногена в г/л вес сгустка умножают на 0.25

Клиническое значение:

Увеличение содержания фибриногена наблюдается при

• 
  воспалительных процессах;
  
• 
  злокачественных новообразованиях;
  
• 
  туберкулезе.
  

Уменьшение содержания фибриногена наблюдается при

• 
  паренхиматозных состояниях печени;
  
• 
  после оперативного вмешательства;
  
• 
  при ДВС-синдроме.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Перепишите методику и клинико-диагностическое значение определения фибриногена в плазме крови.
  
• 
  Выполните практическую работу.
  

• 
  Заполните бланк анализа.
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  
• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Назовите основные структурные компоненты вторичного гемостаза.
   
2. 
   Что такое факторы свертывания крови, их классификация?
   
3. 
   Дайте характеристику плазменным факторам свертывания крови.
   
4. 
   Дайте характеристику клеточным факторам свертывания крови.
   
5. 
   Дайте характеристику тканевым факторам свертывания крови.
   
6. 
   Дайте подробную характеристику Ф.I, II, IV, X, XII, XIII, Ф. 3, 8.
   

4^*. Поэтапно опишите образование фибрина из фибриногена.

Практическая работа №

9.5. Определение времени рекальцификации плазмы крови.
Цели занятия

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знатьвнутренний и внешний механизмы свертывания крови, фазы свертывания крови.

- Уметьопределять время рекальцификации плазмы крови.
Принцип: определяют время свертывания плазмы при добавлении к ней оптимального количества хлорида кальция.

Реактивы: 0.025М раствор хлорида кальция 0.85% раствор хлорида натрия Плазма крови тромбоцитарная.

Оборудование: Серологические пробирки. Секундомер. Термостат водяной на 37 0С. Дозаторы на 0,1 мл и 0,2 мл

Ход определения:

• 
  В чистую пробирку вносят 0.2 мл хлорида кальция и 0.1 мл хлорида натрия;
  
• 
  Пробирку помещают в термостат при 37 градусах на 60 секунд;
  
• 
  Затем добавляют 0.1 мл плазмы, одновременно включая секундомер;
  
• 
  Определяют время свертывания плазмы.
  
• 
  Определение проводят 3 раза.
  

В норме свертывание плазмы происходит на 60-120 с.
Клиническое значение:

Удлииение времени рекальцификации указывает на гипокоагуляцию, наблюдается при

• 
  тромбоцитопении.
  
• 
  Тромбоцитопатия с недостаточностью ф.3
  
• 
  Наличии в крови ингибиторов свертывания крови
  
• 
  ДВС-синдроме (III фаза)
  
• 
  Врожденной недостаточностью плазменных факторов свертывания
  

Укорочение времени рекальцификации плазмы указывает на гиперкоагуляцию.
Задание для самостоятельной работы:

• 
  Перепишите методику и клинико-диагностическое значение определения времени рекальцификации плазмы крови.
  
• 
  Выполните практическую работу.
  

• 
  Заполните бланк анализа.
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  
• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. Дайте характеристику внутреннему механизму свертывания крови (с чего начинается, длительность и конечные продукты каждой фазы, для каких повреждений характерно).

2. Дайте характеристику внешнему механизму свертывания крови (с чего начинается, длительность и конечные продукты каждой фазы, для каких повреждений характерно).

3. Сравните сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, внешний и внутренний механизм свертывания крови, найдите основные отличия, оформите их в виде таблицы.

4. Дайте определение следующим понятиям: гемостаз, адгезия, агрегация, факторы свертывания крови, гемокоагуляция, фибриноген, ретракция, фибриназа, прокоагулянты, тромбин.