практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика

• Название: Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
• Анкор: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Дата: 23.11.2017
• Размер: 1.34 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Тип: Методическое пособие; #10387
• страница: 17 из 19

Практическая работа

9.6. Определение толерантности плазмы к гепарину.
Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знать характеристику противосвертывающей системы крови, виды и структурные компоненты, фибринолиз.

- Уметь проводить определение толерантности плазмы к гепарину.
Принцип: внесение в плазму определенной концентрации гепарина изменяет ее рекальцификацию в зависимости от коагуляционной и антикоагуляционной активности крови. Если после введения гепарина резко увеличивается время образования сгустка, значит, толерантность плазмы к гепарину резко понижена, и наоборот, если гепарин после его внесения в исследуемую плазму замедляет свертывание плазмы незначительно, толерантность плазмы к гепарину повышена.

Реактивы: 1. 0.025 М раствор хлорида кальция 2. раствор гепарина 5000 МЕ в 1 мл 3. гепарин-кальцевая смесь 4. цитратная плазма без следов гемолиза

Оборудование: Серологические пробирки. Секундомер. Термостат водяной. Дозаторы на 0,1 мл, 0,2 мл, 0,05 мл Колба на 250 мл

Ход определения:

• 
  Приготовление гепарин-кальциевой смеси – 0,05 мл раствора гепарина добавляют к 250 мл 0,025М хлорида кальция (устойчивость 14 дней, при – 4 ⁰С);
  
• 
  В агглютинационную пробирку помещают 0.2 мл исследуемой плазмы;
  
• 
  Пробирку помещают в водяную баню при 37 С, на 60 с;
  
• 
  Затем добавляют 0.2 мл гепарин-кальциевой смеси, одновременно включают секундомер.
  
• 
  По истечении 2 минут через каждые 30 секунд проверяют, произошло ли свертывание путем наклона пробирок на 50-60 градусов. В момент появления сгустка секундомер выключают и определяют время свертывания.
  

В норме толерантность плазмы к гепарину составляет 11-16 мин.
Клиническое значение:

Изменения показателей теста ценны для суждения о взаимодействии коагуляционного и антикоагуляционного механизмов свертывания крови.

Снижение толерантности плазмы к гепарину до 20 мин отмечается при:

• 
  любом дефиците факторов коагуляции
  
• 
  тромбоцитопении
  
• 
  повышении антикоагуляционной активности при введении гепарина
  

Повышение толерантности плазмы к гепарину до 1-9 мин отмечается при:

• 
  циркуляции в крови тканевого тромбопластина связывающего гепарин (вследсвии оперативных вмешательств, токсикозов беременных, патологических родах, гемолиза)
  
• 
  ДВС-синдроме;
  
• 
  Врожденном недостатке антитромбина III.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение толерантности плазмы к гепарину ;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Дать характеристику противосвертывающей системе.
   
2. 
   Какие виды противосвертывающей системы существуют?
   
3. 
   Что такое антикоагулянты, их значение в организме?
   
4. 
   Классификация антикоагулянтов, примеры.
   
5. 
   Фибринолиз – определение, структурные компоненты, механизм действия.
   

6^*. Дать подробную характеристику следующим веществам и укажите их значение в системе гемостаза: гепарин, антитромбин III, витамин К, Са²⁺.

7^*. Каковы механизмы антикоагуляционного действия: гепарина, антивитамина К.

Практическая работа

9.7. Определение АЧТВ плазмы крови.
Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения факторов гемостаза.

- Знатьпатологию сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, коагулопатии (причины, виды, лабораторная диагностика).

- Уметь определять АЧТВ предложенной плазмы крови.
Принцип: определяется время свертывания бедной тромбоцитами плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса свертывания в присутствии ионов кальция.

Реактивы: Кефалин. Каолин Буфер трис-НСI Хлорид кальция Дистиллированная вода. Плазма крови бедная тромбоцитами

Оборудование: Водяной термостат Секундомер Пипетки 0.1; 5.0 мл (дозатор 0,1 мл) Пробирки Цилиндр на 200 мл

Ход определения:

• 
  Приготовление реагентов к работе:
  

1. 
   Разведение кефалина.
   

Во флакон с кефалином внести 2,0 мл дистиллированной воды и растворить при энергичном покачивании, раствор кефалина можно использовать через 60 минут.

2. 
   Приготовление АПТВ-реагента.
   

Концентрированный буфер трис-НСI и каолин количественно переносят в мерный цилиндр и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл, для приготовления АПТВ-реагента смешивают в пробирке 0,1 мл кефалина и 3,0 мл рабочей взвеси каолина. Перед применением необходимо встряхивать.

3. 
   Приготовление рабочего раствора хлориа кальция.
   

Концентрированный раствор хлорида кальция развести дистиллированной водой в 20 раз.

• 
  Проведение анализа – определение АПТВ:
  

1. 
   В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,1 мл АПТВ-реагента.
   
2. 
   Пробирку встряхивают и помещают в водяной термостат при 37⁰С.
   
3. 
   Через 3 мин к смеси добавляют 0,1 мл хлорида кальция (имеющего температуру 37 С) и включают секундомер.
   
4. 
   Отметить время свертывания (образования фибрина) при периодическом покачивании пробирки.
   
5. 
   определение проводят 2-3 раза и берут средний результат
   

Нормальные величины: АПТВ в нормальной плазме составляет 27-35 с.

• 
  Определение каолинового времени свертывания плазмы:
  

1. 
   В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и прогревают в водяном термостате 1 мин.
   
2. 
   Добавляют 0,1 мл каолина, имеющего комнатную температуру.
   
3. 
   Инкубируют в термостате в течение 3 мин.
   
4. 
   Затем вносят 0,1 мл хлорида кальция, включают секундомер и определяют время свертывания.
   

Клинико-диагностическое значение:

Определение АПТВ используется для выявления гипер- и гипокоагуляционного сдвига, контроля за гепаринотерапией при тромбозах, тромоэмболиях и ДВС-синдромах различной этиологии, для диагностики гемофилии, болезни Вилленберга.

Удлинение АЧТВ наблюдается при:

• 
  дефиците факторов свертывания крови
  
• 
  избытке антикоагулянтов
  
• 
  гепаринотерапии
  

Укорочение АЧТВ отмечается при:

• 
  тромбофилических состояниях.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение АЧТВ в предложенной плазме;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Классификация нарушений гемостаза.
   
2. 
   Тромбоцитопатии: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
   
3. 
   Тромбоцитопении: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
   
4. 
   Наследственные коагулопатии: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
   
5. 
   Приобретенные коагулопатии: причины, клинические проявления, лабораторная диагностика.
   

6^*. Почему при гемофилии время кровотечения по Дуке будет в норме?

7^*. Какой тип гемостаза будет нарушен при заболеваниях гепатитом, почему?