практикум по биохимии Перфильева,Черемнова. Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика

• Название: Методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для студентов специальности 0407 Лабораторная диагностика
• Анкор: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Дата: 23.11.2017
• Размер: 1.34 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии Перфильева,Черемнова.doc
• Тип: Методическое пособие; #10387
• страница: 13 из 19

Практическая работа

3.3. Обнаружение действия и специфичности ферментов.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значение определения ферментов;

- Знать о биологической роли ферментов, строении, основных свойствах, внутриклеточной локализации, особенности ферментативного катализа, механизме действия ферментов.

- Уметь обнаруживать действие и специфичность амилазы слюны.
Принцип: фермент слюны амилаза при определенных условиях производит гидролиз крахмала до мальтозы.

_{амилаза амилаза мальтаза}

(С₆Н₁₀О₅)_у-----------(С₆Н₁₀О₅)_х-------------уС₁₂Н₂₂О₁₁-----------nС₆Н₁₂О₆

^{крахмал декстрины мальтоза глюкоза}

Реактивы: 1% раствор крахмала; 2% раствор сахарозы; 1% раствор йода; 5% раствор сульфата меди; 10% раствор гидрооксида натрия; амилаза слюны; дистиллированная вода.

Оборудование: штатив с пробирками (7 шт); пипетки глазные; воронка; стаканчик; термостат; спиртовка; фильтры.

Ход работы (обнаружение действия ферментов):

• 
  Получите ферментативный препарат амилазы слюны (ополоскать рот водой, затем набирать 10-20 мл дистиллированной воды, выдержать во рту 2-3 мин и полученный раствор амилазы слить в стакан);
  
• 
  В две пробирки налейте по 10 капель раствора крахмала, подпишите пробирки контроль и опыт;
  
• 
  В контрольную пробирку налейте 5 капель воды, в опытную – 5 капель амилазы слюны;
  
• 
  Перемешайте и поставьте в термостат при 37⁰С на 15 мин;
  
• 
  Затем опытную пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку;
  
• 
  В одну пробирку добавьте 1 каплю йода, в другую добавьте 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидрооксида меди и нагрейте до кипения (реакция Троммера);
  
• 
  Аналогичные реакции проведите с контрольной пробиркой;
  
• 
  Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.
  

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера
1
2

Ход работы (специфичность действия):

• 
  В две пробирки налейте по 10 капель раствора слюны, в первую добавьте 10 капель раствора крахмала, во вторую – 10 капель сахарозы;
  
• 
  Пробы перемешайте и поместите в термостат при 37⁰С на 15 мин;
  

• 
  Затем первую пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку, и проделайте две реакции: пробу Троммера и реакцию с йодом;
  

• 
  Со второй пробиркой проделайте реакцию Троммера;
  

• 
  Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.
  

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера
1
2

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение действия и специфичности амилазы слюны;
  

• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки;
  
• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Напишите реакцию, которую катализирует амилаза слюны.
   
2. 
   Назовите субстраты амилазы.
   
3. 
   Для чего необходима инкубация фермента с субстратом?
   
4. 
   Какой специфичностью обладает амилаза слюны?
   
5. 
   Как можно измерить активность амилазы?
   
6. 
   Дайте определения следующим понятиям: фермент, активный центр, аллостерический центр, простые ферменты, сложные ферменты, апофермент, кофермент, холофермент, обратимость действия, термолабильность, специфичность.
   

Практическая работа

3.4. Зависимость активности ферментов от рН среды.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

-Знать свойства ферментов, кинетику ферментативных реакций, классификацию ферментов по слож­ности строения;

- Уметь определять зависимость активности амилазы слюны от рН среды.
Принцип: для амилазы слюны оптимальное значение рН лежит в пределах слабощелочной среды, в кислой и сильно щелочной среде активность фермента снижается, и расщепление крахмала происходит не полностью, до стадии декстринов, которые с йодом дают красно-фиолетовое или красно-бурое окрашивание.

Реактивы: 1% раствор крахмала; 1% раствор йода; фосфатно-цитратный буфер с рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0; амилаза слюны.

Оборудование: штатив с пробирками (5 шт) пипетки на 1 мл, глазные пипетки; термостат

Ход работы:

• 
  В 5 пронумерованных пробирок налейте по 1 мл фосфатно-цитратного буфера со значением рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0;
  
• 
  Во все пробирки добавьте по 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл раствора амилазы;
  
• 
  Затем во все пробирки добавьте по 3 капли раствора йода, тщательно перемешайте;
  
• 
  Все пробирки поместите в термостат при 37⁰С на 15 мин;
  
• 
  Затем пробирки охладите под холодной водой и сравнит окраску во всех 5 пробирках;
  
• 
  Сделайте вывод о зависимости активности амилазы от рН среды.
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от рН среды.
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

5. 
   Приведите примеры простых ферментов.
   
6. 
   Приведите примеры сложных ферментов.
   
7. 
   Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
   
8. 
   Назовите оптимальную рН для следующих ферментов: пепсин, химозин, гастриксин, амилаза слюны, трипсин, липаза, химотрипсин.
   

Практическая работа

3. 5. Зависимость активности ферментов от температуры.
Цели занятия:

- Усвоить представлениео диагностическом значении определения ферментов;

- Знать кинетику ферментативной реакции.

- Уметь определять зависимость активности амилазы слюны от температуры.
Принцип: все ферменты являются термолабильными веществами и проявляют свою максимальную активность при 37⁰С. При снижении или повышении температуры активность ферментов падает, что приводит к образованию промежуточных продуктов или к полной остановке реакции. Так, нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, а декстрины (промежуточные продукты распада крахмала) в зависимости от величины своих частиц дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску. Таким образом, по окраске раствора йодом можно судить о степени гидролиза крахмала.

Реактивы: 1% раствор крахмала 1% раствор йода раствор амилазы дистиллированная вода.

Оборудование: штатив с пробирками (4 шт); пипетки на 1 и 2 мл, глазные пипетки; термостат; водяная баня; ледяная баня; спиртовка.

Ход работы:

• 
  В четыре пронумерованной пробирки налейте по 0,5 мл раствора амилазы;
  
• 
  Пробирку №1 поставьте в лед, №2 – оставьте при комнатной температуре, №3 – в термостат, №4 – в кипящую водяную баню;
  
• 
  Через 5 мин, когда содержимое пробирок примет нужную температуру, в пробирку №1 добавьте 2 мл крахмала, охлажденного до температуры тающего льда.
  
• 
  Во 2-ю,3-ю и 4-ю пробирки добавьте по 2 мл раствора крахмала комнатной температуры;
  
• 
  Во все пробирки добавьте по 2 капли йода;
  
• 
  Перемешайте содержимое и поместите пробирки в те же самые условия на 15 мин;
  
• 
  Затем пробирки достаньте, охладите, и оцените активность амилазы по интенсивности и цвету окраски;
  
• 
  Результаты занесите в таблицу:
  

№	Субстрат	Фермент	t	Реакция с йодом
1.
2.
3.
4.

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от температуры;
  
• 
  Сделайте выводы по работе, по полученным результатам построить график зависимости активности амилазы от температуры;
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

5. 
   Перечислите основные свойства ферментов.
   
6. 
   Как влияет температура на активность ферментов?
   
7. 
   К какому классу ферментов относится амилаза слюны?
   
8. 
   Перечислите классы ферментов с примерами.
   

5^*. Нарисуйте графики зависимости активности ферментов от температуры, рН, концентрации S и Р.
Практическая работа

3.6. Зависимость активности ферментов от влияния активаторов и ингибиторов.
Цели занятия:

- Усвоить представления о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать кинетику ферментативной реакции, активаторы и ингибиторы, виды ингибирования, классификацию ферментов по типу катализируемой реакции.

- Уметь определять зависимость активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.
Принцип: активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его активации или ингибированию.

Реактивы: 1% раствор крахмала; 1% раствор йода; 1% раствор сульфата меди; 1% раствор хлорида натрия; амилаза слюны; дистиллированная вода.

Оборудование: штатив с пробирками (3); пипетки глазные; стаканчики; воронка.

Ход работы:

• 
  В 3 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель раствора амилазы;
  
• 
  Затем по одной капле добавьте в 1-ю – хлорид натрия, во 2-ю – сульфат меди, в 3-ю – воды (контроль);
  
• 
  Перемешайте, внесите в каждую пробирку по 5 капель раствора крахмала и оставьте стоять на 3 мин при комнатной температуре;
  
• 
  Затем добавьте по 1 капле йода, перемешайте, наблюдайте за окраской растворов и определите, в какой пробирке действовал активатор или ингибитор;
  
• 
  Результаты оформите в виде таблицы:
  

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом в присутствии
			СuSO4	NaCI	H2O

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

1. 
   Дайте определения и характеристику изоферментам на примере ЛДГ и КК.
   
2. 
   Дайте определение следующим терминам: активаторы, ингибиторы, денатурация, ингибирование.
   
3. 
   Перечислите основные виды ингибирования.
   
4. 
   Объясните принцип конкурентного ингибирования.
   

5^*. Ингибитор снижает активность фермента до 30% от исходного уровня. Повышение концентрации субстрата катализируемой реакции восстанавливает 80% активности фермента. К какому типу относится данный ингибитор?
Практическая работа

3.7. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови.
Цели занятия:

- Усвоить представление о диагностическом значении определения ферментов;

- Знать клинико-диагностическое значение определения амилазы в сыворотке крови и моче.

- Уметь определять активность панкреатической альфа-амилазы в сыворотке крови.
Принцип: альфа-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Реактивы: крахмал-субстрат; фосфатный буфер рН=7; раствор йода 0,01н; вода дистиллированная; сыворотка крови.

Оборудование: штатив с пробирками (2 шт); пипетки на 1 мл, 5 мл; дозатор на 0,01 мл и на 0,5 мл; термостат; ФЭК.

Ход работы:

Реактивы	Опытная проба, мл	Холостая проба, мл
Рабочий реактив	0.5	0.5
Выдержать в термостате при 370С в течение 5 мин.
Сыворотка крови	0.01	-
Вода дистиллированная	-	0.01
Выдержать в термостате при 37 С в течение 7,5 мин. Время инкубации строго отсчитывать по секундомеру от момента внесения образца и затем сразу добавить:
Раствор йода	0.5	0.5
Объем проб довести дистиллированной водой до 5 мл, перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (А1) и холостой пробы (А2) против дистиллированной воды, при 630-690 нм в кювете на 10 мм.

Расчет: активность амилазы в мг крахмала, гидролизованного 1л биологической жидкости за 1с при 37 С. расчет проводим по формуле:
Активность амилазы = (А₂ – А₁)_* 44.4/А₂, мг/_с*л
Нормальные величины: сыворотка крови – 3.3 –8.9 мг/с*л

моча - до 44 мг/с*л
Клинико-диагностическое значение определения активности амилазы
Амилаза - фермент, осуществляющий расщеплении крахмала и гликогена. наиболее богаты им поджелудочная и слюнные железы. Содержание амилазы в сыворотке крови связано с приемом пищи: днем активность выше, чем ночью. В норме активность амилазы в сыворотке крови-16-30 г/ч*л, в моче –20 –160 г/ч*л.

Активность амилазы в сыворотке крови повышается (гиперамилаземия) при:

• 
  остром панкреатите (в 10-30 раз, приходя к норме на 6-7 сутки, если активность сохраняется увеличенной более 5 суток, это говорит о развитии хронического процесса);
  
• 
  Обострении хронического панкреатита;
  
• 
  Паротите (воспалении слюнных желез);
  
• 
  Почечной недостаточности;
  
• 
  Может быть вызвана приемом алкоголя, адреналина, наркотических веществ.
  

Снижение активности амилазы в сыворотке крови (гипоамилаземия) наблюдается при:

• 
  Заболеваниях печени (гепатитах, механической желтухе, циррозе);
  
• 
  Сахарном диабете;
  
• 
  Гипотереозе;
  

Повышение активности в моче (гиперамилазурия) наблюдается при:

• 
  Остром панкреатите (имеет большее диагностическое значение, чем определение в сыворотке, так как держится более 7 суток);
  
• 
  Паротите;
  

Снижение активности фермента в моче (гипоамилазурия) наблюдается при:

• 
  почечной недостаточности .
  

Задание для самостоятельной работы:

• 
  Законспектируйте методику;
  
• 
  Подготовьте рабочее место для исследования;
  
• 
  Проведите определение активности амилазы в предложенной сыворотке;
  
• 
  Оцените полученные результаты;
  
• 
  Сделайте выводы по работе и рисунки.
  

• 
  Ответьте на дополнительные вопросы.
  

Ответьте на вопросы:

6. 
   Назовите место локализации, оптимальное рН и биологическое значение амилазы.
   
7. 
   Напишите реакцию, которую катализирует амилаза.
   
8. 
   Назовите основные заболевания, характеризующиеся повышением активности амилазы. Объясните причину.
   
9. 
   К какому классу ферментов относится амилаза?