Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Радикалы, входящие в состав цефалоспоринового ряда R 1 R 2 Антибиотик S C C C N O CO N N H 2 C CH 3 2-аминотиазол-4-ил- (метоксиимино)ацетил О-ацетил Цефотаксим S C C C N O CO N N H 2 C CH 3 2-аминотиазол-4-ил- (метоксиимино)ацетил O ONa C H 3 N N N C C C S 6-гидрокси-2-метил-5- оксо-2,5-дегидро-1,2,4- триазин-3-ил- тио…натриевая соль Цефтриаксон O CH 2 S C C C N N H 2 C N C CH 2 COONa C C C C C N + Цефтазидим 1 – Карбапенемы – это новое семейство β-лактамных антибиотиков, представляющих собой аналоги пенициллинов или клавамов, в которых сера у первых, и кислород у вторых замещены на углерод: К этому семейству относятся оливановые кислоты и тиенамицин Их продуцентами являются стрептомицеты. Эти антибиотики обладают широким антимикробным спектром и являются выраженными ингибиторами β-лактамаз. Нокардицины – новая группа β-лактамных антибиотиков, продуцируемых бактериями из рода Nocardia. Выделены нокардицины А, В, D, E, F, G. Монобактамы –это моноциклические монобактамные антибиотики, продуцируемые штаммами бактерий, например, Pseudomonas acidophila или Geuconobacter species. 53 Их ядром является 3-аминомонобактамовая кислота (3-АМК). Ее можно получить из природных монобактамов или из 6-АПК. Антибиотики – тетрациклины – это антибиотики с широким спектром антибактериального действия. Их продуцентами являются стрептомицеты. Некоторые тетрациклины относятся к ряду полусинтетических препаратов. Антибиотики - гликозиды. Среди этой группы антибиотиков выделяют группы, содержащие О-, S- и N- гликозидные связи. К числу первых относят аминогликозидные антибиотики и новобиоцин, ко вторым – клиндамицин и линкомицин, к третьим – некоторые нуклеозидные антибиотики. Антибиотики – О-гликозиды. Аминогликозиды –содержат аминосахара в своей структуре. Большинство из них (канамицин, гентамицин и др.) продуцируются актиномицетами. Все антибиотики-аминогликозиды обладают широким спектром действия на различные патогенные бактерии. Продуцентами гентамицинов является Mieromonospora. purpurea. Антибиотики – макролиды имеют О-гликозидные связи (эритромицин, олеандомицин, триацетилолеандомицин, спирамицин и др.). Они продуцируются стрептомицетами и проявляют активность против большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий и содержат в своей структуре макроциклическое лактонное кольцо, связанное с углеводными остатками, из которых аминосахар, если он имеется, всегда располагается ближе к макролактону, чем нейтральный углевод. Олеандомиццн, его эфир - триацетилолеандомицин и спирамицин сходны по спектру антибактериального действия с эритромицином, но несколько слабее его активности. Новобиоцин продуцируется культурой Streptomyces spheroides, активен против возбудителей пневмонии, некоторых кишечных и раневых инфекций, ангин и флегмон. По химической структуре – это О-гликозид (амидогликозид), агликон которого существенно массивнее углеводной части. Оливомицин – О-гликозидный антибиотик, в котором углеводная часть представлена триозой и биозой, между которыми как бы «вставлен» агликон- оливин (хромомицинон). Оливомицин является представителем большой группы антибиотиков – аналогов ауреоловой кислоты (митрамицина), активных против грамположительных бактерий и отдельных опухолей. Оливомицин продуцируется Streptomyces olivoreticuli. Дауномицин (рубомицин) –О-гликозидный антибиотик из группы антрациклинов, образуемый Streptomyces species. Антибиотик обладает противомикробным и противоопухолевым действием. Блеомицин – О-гликозидный антибиотик, обладающий иммуносупрессивным и противоопухолевым действием, синтезируемый стрептомицетами. 54 Ристомицин А (ристоцетин) –О-гликозидный антибиотик, в составе которого имеется циклизованная агликоновая часть (циклопентит) и углеводный компонент, включающий ристозамин, маннозу, арабинозу, глюкозу и рамнозу, активен против грамположительных бактерий. Антибиотики - S-гликозиды Из этой группы антибиотиков наиболее известны линкомицин и клиндамицин, гликоном которых является метил. Из них клиндамицин является производным линкомицина, у которого гидроксил в позиции 7 заменен на хлор. Клиндамицин лучше всасывается в кровь из кишечника. Оба антибиотика активны преимущественно против грамположительных кокков. Антибиотики - N-гликозиды Гужеротин – антибиотик широкого спектра антимикробного действия, продуцируется культурой Streptomycis gougerotii. Пуромицин –N-гликозидный антибиотик, применявшийся при изучении и расшифровке процесов элонгации, подобен 3'-концу аминоацил-тРНК, связывающейся с определенным участком рибосомы. Продуцентом пуромицина является Streptomyces alboniger. Антибиотик ингибирует, биосинтез белка многих микроорганизмов, включая трипаносомы, однако терапевтическое значение его невелико. Антибиотики -депсипептиды Они продуцируются бациллами и проявляют активнсть против грамположительных и/или грамотрицательных патогенных бактерий (бацитрацины, грамицидины, полимиксины и др). В таблице представлены продуценты данных антибиотиков. Табл. 3.1.2 Продуценты антибиотиков-диспепсидов продуцент антибиотик активность против Васillus lichenitormis Бацитрацины (10 форм) Грамположительных бактерий и грамотрицательных коков Bacillus brevis var.G.-B. Грамицидины (5 форм) Грамположительных бактерий и грамотрицательных коков Bacillus polymixa Полимиксины Грамотрицательных бактерий Bacillus.circula ns Колистины Циркулины (22 формы) Полимиксин B 1 , циркулин А и колистин различаются по единичным аминокислотным остаткам. 55 К циклопептидным антибиотикам относится также циклоспорин А, продуцируемый мицелиальными грибами Cephalosporium lucidum и Tolypoeladium inflatum-Bauveria nives. Отличительным свойством данного антибиотика является его иммуносупрессивное действие, его преимущественно используют трансплантологии. Также он проявляет антифунгицидную активность. Антибиотики – актиномицины составляют большую группу сходных веществ, синтезируемых стрептомицетами. По химическому строению их относят к хромопептидам, содержащим феноксазиновую хромофорную группу и два пентапептида в форме циклических лактонов. Некоторые из них обладают противоопухолевым и иммуносупрессивным действием. На практике хорошо известен актиношцин (дактиномицин), ингибирующий синтез мРНК. Антибиотики – полиены-это группа лекарственных препаратов, продуцентами которых являются стрептомицеты и некоторые мицелиальные грибы, образующие структуры с четырьмя-семью сопряженными двойными связями. В медицинской практике наибольшее распространение получили нистатин, фумагиллин, амфотерицин В и полусинтетический амфоглюкамин, обладающие противогрибковым действием (преимущественно – в отношении патогенных дрожжевых организмов и некоторых других видов грибов). Фумагиллин ингибирует стафилококки, дизентерийную амебу, бактериофаги. Нистатин – аналог амфотерицина В, но в его цепочке (в позиции 20-27) содержится 4 конъюгированных двойных связи. Антибиотики – анзамицины образуются актиномицетами и некоторыми растениями. В молекулах антибиотиков данной группы к ароматическому ядру присоединяется алифатическая анза-цепь. Наиболее известными из них являются рифоцин (рифампицин SV), рифампицин и рифамид. Анзамицины – широкоспектральные антибиотики, ингибирующие бактерии, отдельные вирусы и некоторые эукариотические клетки. Рифампицин – продуцент Streptomyces mediterranei, является одним из лучших химиотерапевтических средств при туберкулезе, проявляющим бактерицидное действие против Mycobacterium tuberculosis. Он проникает в спинномозговую жидкость и поэтому эффективен при туберкулезном менингите. Антибиотики-стероиды продуцируются мицелиальным грибом Fusarium coccineum, активны в отношении многих типов грамположительных бактерий (особенно – стафилококков). К ним относят фузидиевую кислоту, выпускаемую в виде натриевой соли. Прочие антибиотики Гризеофульвин – продуцируется нитчатым грибом Penicillium griseofulvum и другими, активен в отношении болезнетворных грибов – дерматофитов. 56 Трихотецин – антифунгицидный антибиотик, используемый прежде всего в ветеринарии и растениеводстве, продуцируется нитчатым грибом Trichothecium roseum и некоторыми другими несовершенными грибами. Более половины известных антибиотиков продуцируются актиномицетами. К этой группе антибиотиков относятся стрептомицин и другие антибиотики- гликозиды (неомицины, канамицины), тетрациклины, антибиотики-макролиды (эритромицин, олеандомицин) и анзамицины (римфампицин. Другим важным продуцентом являются плесневые грибы – различные виды Penicillium,Cephalosporium, осуществляющие биосинтез противоопухолевых, антибактериальных и противовирусных лекарственных препаратов. Бактерии рода Bacillus продуцируют большинство антибиотиков- полипептидов. Они, как правило, высокотоксичны, но некоторые изних (грамицидин, полимиксин и другие) применяются в медицине. Небольшая группа антибиотиков продуцируется лишайниками, водорослями и другими низшими растениями. По способу получения антибиотики можно подразделить на три основные группы. 1. К первой группе относят антибиотики, получаемые путем микробиоло- гического синтеза на основе плесневых грибов или актиномицетов. Этим способом получают антибиотики тетрациклинового ряда, природные пенициллины, антибиотики-гликозиды, макролиды и некоторые другие. 2. Ко второй группе относят антибиотики, получаемые за счет химиче- ского синтеза из простых органических веществ. Его используют для получения антибиотиков, имеющих несложную химическую структуру – левомицетин и его производные. 3. К третьей группе относят антибиотики, получаемые путем сочета- ния микробиологического и химического синтеза – полусинтетические анти- биотики. На основе трансформации молекул природных антибиотиков получают полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, тетрациклины и другие. Получение природных антибиотиков основано на их биосинтезе в клетках микроорганизмов-продуцентов и включает следующие основные этапы: поиск и селекция высокопроизводительных штаммов продуцентов; подбор оп- тимального состава питательных сред; разработка и аппаратурное оформление процесса ферментации; выделение и очистка целевого продукта. Особую значимость в производстве антибиотиков приобретает поиск и селекция высокопроизводительных штаммов-продуцентов. Отобранные наиболее перспективные образцы далее подвергаются индуцированному мутагенезу. Чаще всего для этого используют искусственную мутацию, воздействуя на природный продуцент различными физическими и химическими факторами – ультрафиолетовым, ионизирующей радиацией и химическими веществами. В результате таких воздействий получают штаммы, которые по 57 своей продуктивности целевого продукта – антибиотика в десятки и даже сотни раз превосходят по своей продуктивности исходные (природные) формы. Широкое применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства поставило задачу получения этих биологически активных веществ в массовых масштабах. Решение этой задачи стало возможным благодаря созданию мощной фармацевтической промышленности. В основе промышленного производства антибиотиков лежит ряд последовательных этапов: получение высокопродуктивных штаммов- продуцентов, разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки антибиотика, создание готовых препаратов и контроль их качества. Каждый из этих этапов должен обеспечиваться соответствующими специалистами (генетиками, микробиологами, технологами и др.). Производство антибиотиков представляет ныне мощную, хорошо развитую отрасль, входящую в фармацевтическую промышленность. Она занимает одно из ведущих мест в производстве лекарственных препаратов. Особенно широко она развита в США, Англии, Японии, Франции, Италии и других странах. Например, в США ежегодно выпускается антибиотиков и их про- изводных на сотни миллионов долларов. По общему производству антибиотиков наша страна занимает ведущее место в мире. Технологический процесс производства антибиотиков состоит из пяти стадий. На первой стади осуществляется подготовка питательной среды и посевного материала (инокулята). Для каждого продуцента антибиотика и вновь полученного штамма разрабатывается своя оптимальная среда, которая должна отвечать следующим основным требованиям: а) обеспечивать хороший рост продуцента и максимально возможное образование антибиотика; б) содержать доступные и дешевые компоненты; в) обладать хорошей фильтрующей способностью; г) обеспечивать применение наиболее экономичных и эффективных приемов выделения и очистки антибиотика. Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным. Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30 – 60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего среда охлаждается до 27—30°С. Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную 58 колонку, через которую сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, пропускается острый пар (давление пара около 5 атм.). Питательная среда в колонку поступает снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы. Далее нагретая в колонке среда поступает в специальный аппарат – выдерживатель, где она при температуре 125-130°С находится определенное время (5-10 мин). Затем она поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30 – 35°С (на выходе) и поступает в ферментер. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и другие факторы. При применении в качестве отдельных компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима. Стадия биосинтеза – основная биологическая стадия в процессе получения антибиотика, обеспечивающая для продуцента такие условия развития, которые бы способствовали максимальному уровню образования БАВ. Эффективность стадии биосинтеза определяется генетическими особенностями организма, составом питательной среды, режимом развития продуцента и зависит от времени максимального образования антибиотика, стоимости компонентов среды, пеногасителей, энергетических затрат, связанных с процессом развития организма-продуцента. В энергетические затраты включаются расходы энергии при стерилизации среды, ферментера и коммуникаций, а также систем перемешивания культуральной жидкости и продувания воздуха через нее. В производстве антибиотиков используют методы периодического, непрерывного культивирования, а также методы, занимающие промежуточное положение между периодическим и непрерывным культивированием – полунепрерывный отъемно-доливной метод. При непрерывном культивировании клетки продуцента размножаются со скоростью, зависящей от притока питательных веществ и некоторых других условий, при этом часть объема культуральной жидкости постоянно вытекает с той же скоростью, с какой подается питательная среда в аппарат. Метод непрерывного проточного культивирования может быть организован как процесс полного вытеснения и как процесс полного смешения. Применение процесса полного вытеснения возможно при культивировании анаэробных микроорганизмов в ферментере, представляющем собой трубу, в которую с одной стороны непрерывно подается питательная среда и посевной материал, а с другой стороны производится отбор культуральной жидкости. Процесс происходит без перемешивания и аэрации. Когда среда и посевной с материал попадают в ферментер, популяция продуцента находится в лаг-фазе, а на выходе из 59 ферментера культура может находиться в любой фазе в зависимости от скорости подачи среды. При этом воспроизводится кинетика роста продуцента, но не во времени, а в пространстве. В процессе полного смешения размножение культуры происходит в ферментере при интенсивном перемешивании и аэрации. Во всем объеме культуральной жидкости условия должны быть одинаковыми. Процесс полного смешения по типу системы «турбидостат» и «хемостат». В системе «турбидостат» в ферментере плотность популяции поддерживают постоянной. При быстром потоке среды в данной системе создаются условия, близкие к тем, которые соответствуют экспоненциальной фазе, а при медленном – приближаются к условиям, соответствующим стационарной фазе. В установившемся режиме удельная скорость потока среды равна удельной скорости размножения культуры. Повышение скорости протока или воздействие, замедляющее рост, приводит к тому, что скорость размножения оказывается меньше скорости протока, и клетки культуры будут «вымываться» из ферментера. В системе «хемостат» величину клеточной популяции контролируют с помощью отдельных компонентов питательной среды. Среду составляют так, чтобы один из компонентов, необходимый для роста биомассы клеток, был в недостаточном количестве или лимитировал рост, поддерживая тем самым культуру в нужном состоянии. Используя батарею ферментеров, можно в каждом аппарате постоянно поддерживать продуцент в определенной фазе размножения. Применение отъемно-доливного метода удается в 2 – 3 раза увеличить время пребывания продуцента в активной форме. Недостаток этого метода заключается в том, что доливы осуществляются питательной средой плотного состава. Сущность этого метода заключается в том, что в определенное время, начиная с экспоненциальной фазы, по специально отработанной программе, в культуральную жидкость добавляют отдельные компоненты питательной среды – раствор сахара, сульфат аммония, жир и т.д., поддерживая их концентрацию на постоянном оптимальном уровне – в начале для роста биомассы клеток, а затем – для синтеза целевого продукта. Периодически из ферментера отбирают определенные объемы культуральной жидкости, все возрастающей концентрацией целевого продукта. Ферментацию прекращают после того как активность продуцента достигнет максимума. Этим способом удается не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент, но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном итоге – продуктивность всего процесса, то есть увеличить выход конечного продукта в расчете на потребленный субстрат. Из всего разнообразия используемых в биотехнологии способов наиболее сложными являются регулируемые ферментации с соблюдением условий асептики. Асептические условия предполагают введение дополнительных стадий, обеспечивающих стерилизацию питательных среди подаваемого в ферментер воздуха. 60 Стерильную питательную среду в инокуляторе первой ступени засевают с соблюдением правил асептики через специальное устройство посевным материалом, который предварительно был выращен в колбах в лабораторных условиях. В аппарате поддерживаются необходимые режимы для размножения клеток продуцента – температуру, аэрацию, скорость перемешивания, а также контролируют и оценивают развитие культуры. При достижении требуемых стадий развития и количества биомассы посевной материал передавливают стерильным сжатым воздухом по посевному колектору перемещают в посевной аппарат большей вместимостью. На этой второй ступени выращивания посевного материала стремятся получить больше биомассы клеток, чтобы в ферментере можно было создать необходимую для данного штамма продуцента исходную плотность популяции. Если это требование может быть выполнено без второй ступени, то ферментационную среду засевают непосредственно из инокулятора. При получении пенициллина с помощью микробиологического синтеза используют питательную среду (она же пригодна для приготовления инокулята), включающую глюкозу – 1,5%, лактозу – 5%, сульфат аммония и фосфаты – 0,5 -1%, кукурузный экстракт – 2-3%, «предшественники антибиотика – фенокси- или фенилуксусная кислота – 0,3-0,6%, мел – 0,5-1%, пеногаситель – 0,5-1%. Температуру ферментации поддерживают на уровне 22 – 26°С при рН от 5,0 до 7,5 и постоянной аэрации (1 м 3 воздуха на 1 м 3 среды в 1 минуту), продолжительность процесса – 4 суток. В современных условиях развития фармацевтической промышленности наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов- продуцентов антибиотиков и других биологически активных соединений является метод глубинного культивирования, хотя используют и периодическое культивирование продуцентов. Для получения антибиотиков в промышленных масштабах применяются специальные герметически закрытые емкости или ферментеры, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов. Аэрирование культуры в ферментере происходит в результате подачи подогретого до необходимой температуры стерильного воздуха через специальные приспособления — барботеры, а также благодаря перемешиванию культуральной жидкости различного типа мешалками (пропеллерными, турбинными и др.). В последнее время при производстве антибиотиков применяют низкочастотное вибрационное перемешивание культуральной жидкости как наиболее экономичный способ. Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого- биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков, которые необходимы также для подачи пара в процессе стерилизации и для охлаждения. 61 Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой (КИП), позволяющей регулировать скорость перемешивания культуральной среды, поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости – от 500 л до 50, 100 м 3 и более. Стерилизацию производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций проводят перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем. Использование волокнистых фильтров (типа стеклянной ваты) – широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха (чем меньше диаметр волокна, тем лучше их фильтрующая способность). Проникновение в фильтр бактериальных клеток или спор, перемещающихся с воздушным потоком, зависит от скорости движения воздуха. Проникновение увеличивается с увеличением скорости воздуха. В зависимости от плотности упаковки фильтра скорость движения воздуха не должна превышать 1,5 м/с. Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении разработанного регламента условий развития организма-продуцента антибиотика. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учи- тывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источников углерода, азота, фосфора), внимательно контролируется образование антибиотика. Особенность второй стадии производства антиботиков является двухфазный характер стадии ферментации. В первой фазе развития культуры (тропофазы) идет интенсивное накопление биомассы, сопровождающееся усилением процессов биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, углеводов, ферментов. Причем на этом этапе антибиотик, как правило, не синтезируется. Во второй фазе (идиофаза) накопление биомассы замедляется, так как питательная среда уже обеднена рядом компонентов и обогащена продуктами жизнедеятельности продуцента. Максимум биосинтеза антибиотика наступает в стадии отмирания культуры. Особое внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру 62 микроорганизма часто происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента в ферментере. Основная причина появления большого количества пены наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир, а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобуталкарбомил и другие соединения). Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.) – пеногасители, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя снижает скорость растворения кислорода, что в свою очередь может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа) и аэродинамические методы. В процессе развития микроорганизмов-продуцентов антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в некоторых случаях лишь часть антибиотика выделяется в культуральную жидкость, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. В процессе образования антибиотика в культуральную жидкость, наряду с присутствием в ней различных неиспользованных компонентов среды, выделяются и разнообразные продукты обмена, она обогащается продуктами автолиза клеток. Удаление примесей – первая и весьма важная стадия химической очистки антибиотика. Стадия выделения и химической очистки включает ряд процессов: от обработки нативного раствора до сушки готового очищенного препарата. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и места основного накопления применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используют экстракцию, осаждение, сорбцию на ионообменных материалах, упаривание, сушку. В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, или осаждают в виде нерастворимого соединения, а также путем сорбции на ионообменных смолах. Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. Если антибиотик 63 содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Для этого антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, а затем антибиотик экстрагируют. Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. При этом применяют меры для обеспечения лучшей фильтруемости культуральной жидкости (кислотную или тепловую коагуляцию, обработку электролитами, внесение различных добавок и т. П.). Для процесса фильтрации применяют различные фильтрующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк- фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральной жидкости. Эти аппараты состоят из ряда чередующихся плит и рам и фильтрующих перегородок между ними. Процесс фильтрации осуществляется под давлением. Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Первый аппарат работает под вакуумом, второй – в условиях повышенного давления над фильтрующейся жидкостью. Для получения жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, широкое распространение нашел способ центрифугирования. Хорошие результаты достигаются при правильном выборе скорости подачи жидкости (лучший вариант – 15000 об/мин). Отделение мицелия или других взвешенных частиц может также происходить в сепараторах. При скорости вращения барабана сепаратора, равной 7000—7500 об/мин, благодаря центробежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированная жидкость стремится к центру барабана и переходит в специальную камеру. Одной из особенностей стадии выделения и химической очистки является то, что при выделении антибиотиков приходится иметь дело с весьма невысокими концентрациями выделяемого вещества (не превышающими одного процента). В конце стадии химической очистки кон- центрация антибиотика увеличивается и достигает 20-30%. Цель химической очистки – извлечение антибиотика из культуральной жидкости или из клеток продуцента, концентрирование его и освобождение от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высоко очищенного препарата, пригодного для соответствующего применения. Антибиотики под влиянием повышенной температуры, высокой кислотности или щелочности среды инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности. |