Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
. Для дозирования и расфасовки сыпучих материалов предназначены пневматические дозаторы, автоматические дозировочные весы, весовыбойные аппараты, ленточные дозаторы, вибродозаторы. В значительной степени эффективность фармацевтического производства зависит от постановки микробиологического контроля. Контролируются музейная культура микроорганизма-продуцента, посевной материал, питательные среды, воздух, культуральная жидкость, а также готовая продукция. В зависимости от назначения микробиологической продукции предъявляются различные требования к ее обсемененности. Продукты, используемые в медицинской промышленности, должны быть практически свободными от микроорганизмов. Одна из главных задач фармацевтического производства является поддержание в активном состоянии производственного штамма. В процессе неоднократных пересевов микроорганизмов, а также длительного воздействия условий культивирования с течением времени могут возникнуть спонтанныемутации, которые приводят к снижению продуктивности производственной культуры. В связи с этим периодически (два раза в год, а в отдельных случаях и чаще) проводят пересевы производственного штамма и отбор вариантов с наиболее высокой продуктивностью. 44 Биохимический контроль количества и специфической активности продуктов микробиологического синтеза позволяет проследить за выходом промежуточного и конечного продуктов. Этот вид контроля обеспечивает выпуск фармацевтической продукции, отвечающей требованиям стандартов. По мере дальнейшего развития биотехнологии все более остро встает проблема контроля качества сырья, используемого для составления питатель- ных сред, и качества продуктов биосинтеза. В настоящее время сырье и пита- тельные субстраты для микробного промышленного биосинтеза оценивают по составу тех или иных компонентов, связанных с качеством. Исключительно важен контроль качества продуктов биосинтеза, используемых в медицине: антибиотиков, ферментов, других фармацевтических соединений. В соответствии с официальной методикой существует классификация показателей для оценки качества микробиологической продукции. Показатели назначения характеризуют свойства продукции, определяющие основные функции, для выполнения которых она предназначена, и обусловливают область ее применения. К группе показателей назначения относятся две важные подгруппы: показатели состава и показатели функциональной эффективности. Показателями состава являются: - содержание основного вещества; - содержание посторонних примесей; - показатели структуры и физико-химические характеристики. Классификация показателей, применяемых при оценке уровня качества продукции Признак классификации Группа показателей качества продукции Характеризуемые свойства Способ выражения Количество характеризуемых свойств Применение для оценки Стадия определения значений показателей Показатель назначения Показатель сохранности Качественные характеристики Технологические показатели Патентно-правовые Экологические показатели Показатели безопасности Показатели, выраженные в натуральных единицах Показатели, выраженные в стоимост- ных единицах Единичные показатели Комплексные показатели Базовые показатели Относительные показатели Прогнозируемые показатели Производственные показатели 45 Показатели потребления Показатели содержания основного вещества включают: • содержание (%) сырого протеина в дрожжах в пересчете на абсолютно сухое вещество (АСВ); • содержание (%) белка в пересчете на АСВ; • содержание (г) антибиотиков на 1 кг препарата; • содержание (мг) витамина на 1 кг препарата; • титр препарата; • активность ферментных препаратов; • коэффициент биологической активности; • другие показатели. Показатели содержания посторонних примесей: • содержание (%) углеводородов в белке; • содержание металломагнитных примесей в белке; • содержание в продукции веществ, отличных по составу от основного компонента и снижающих качество продукции; • содержание (%) золы в пересчете на АСВ и др. Показатели структуры и физико-химические характеристики: • крупность частиц; • влажность (%); • насыпная масса (г/л); • скорость растворения; • плотность (г/см 3 ) и др. Контроль качества биопрепарата по показателям назначения сводится к анализу его состава и физико-химических свойств. Качественные характеристики продукции (внешний вид, цвет,запах, вкус) рекомендуется определять органолептическим методом всравнении с базовым образцом. Также любой биотехнологический препарат (например, вакцина) подвергается стандартизации (контрольная проверка готового продукта) с помощью следующих тестов: 1) тест на стерильность; 2) тест на присутствие консерванта; 3) проверка на присутствие адъювантов (например, алюминиевые квасцы); 4) проверка на активность и идентичность. Проверке подлежат документация, образцы, маркировка и упаковка. Все вышеперечисленные тесты необходимы для того, чтобы готовый продукт обладал необходимыми свойствами: был безопасен, надѐжен и обладал необходимыми профилактическим или лечебным действием. Контроль качества, стандартизация биотехнологических препаратов проводится по соответствующим нормативным документам: фармкопейными статьями для каждого препарата. Международные рекомендации (рекомендации ВОЗ), касающиеся таких требований, облегчают обмен биологическими 46 препаратами между отдельными странами и служат руководством для работников, ответственных за изготовление этих препаратов, а также для тех, кто принимает решение по вопросам, касающимся методов их анализа и контроля. На современном этапе развития биотехнологического производства лекарственных, профилактических и диагностических средств высокое качествопродукции может быть достигнуто с учетом ряда общих требований к организации и контролю производства. Такие требования должны предупреждать возможные ошибки при проведении технологических процессов и вести к созданию экологическибезопасных предприятий. Их общее название - GMP расшифровывается как "Good Manufacturing Practice" и переводится как "Правила хорошего (или надлежащего) производ- ства". GMP следует понимать, как единую систему требований по организации производства и контролю качества любых лекарственных средств от начала переработкисырья до производства готовых продуктов, включая общие требования к помещениям, оборудованию и персоналу; они также полностью распространяются на все биотехнологические производства, занятые изготовлением лекарственных средств. Правила GMP содержат лишь минимальные практические указания, но являются общим руководством, регламентирующим, как должен быть организован производственный процесс и как следует организовать контрольные испытания. Существуют национальные GMP (у более чем 20 стран - США, Япония, Германия, Индия и др.), региональные GMP (ЕЭС), GMP ВОЗ. Правила, разработанные ВОЗ, составляют один из основных элементов "Системы удовлетворения качества фармацевтических препаратов в международной торговле, которая рекомендована всем странам-членам ВОЗ. Она является особым видом многостороннего соглашения с целью оказания помощи органам здравоохранения импортирующих (в том числе развивающихся) стран в оценке юридического статуса и технического уровня закупаемых ими лекарственных средств. Она дает определенную гарантию странам- импортерам. Следует отметить,что требования GMP относятся только к препаратам медицинского применения. Все национальные и другие правила GMP включены в сборник "International drug GMP", который периодически переиздается (в США). Правила GMP - национальные, региональные, международные, - содержат следующие основные главы: введение, терминология, персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производства и экологическая безопасность,лабораторный контроль, регистрация и отчетность. Не анализируя подробно всех частей соответствующего официального документа (документов), отметим отдельные требования по некоторым из разделов. 47 Требования к персоналу связаны с уровнем его квалификации, состоянием здоровья, личной гигиеной, порядком использования технологической одежды и обуви, материалами для их изготовления (например безворсовая ткань), переподготовкой и медицинскими осмотрами персонала. Требования к зданиям и помещениям уточняют их расположение, планировку с целью, например, предотвращения смешения различных видов и серий исходного сырья, полупродуктов и готовых лекарственных средств. Перечисляются специальные помещения для проведения конкретных технологических операций и т.д. Небезынтересно в этой связи отметить, что в ряде национальных руководств по GMP указывается, в частности, на технологические операции, связанные с производством, обработкой и упаковкой антибиотиков пенициллинов и цефалоспоринов, которые рекомендуется проводить в помещениях, изолированных от тех, где изготавливаются другие лекарственные средства. Это объясняется тем, что беталактамы могут проявлять аллергенное действие в крайне незначительных количествах, попадающих в другие лекарственные средства, для того, чтобы у сенсибилизированных больных возникли серьезные осложнения. Значительное внимание уделяется в GMP облицовочным материалам, сантехнике и вопросу поддержания чистоты в помещениях. Под особый контроль попадают помещения, где производятся стерильные лекарственные средства - в отношении их изолированности, осо- бенностей планировки, вентиляции, поддержания постоянной разности давлений между отдельными помещениями в 3-5 мм вод.ст., причем, в помещениях более высоких классов чистоты давление должно быть выше. Нестерильные лекарственные средства не должны производиться в тех помещениях, где изготовляется стерильная продукция. Многочисленны требования GMP к конструкции, размерам и расположению оборудования, особенно используемого при производстве стерильных лекарственных средств. В качестве одного из примеров можно отметить указание на то, что при производстве инъекционных препаратов следует избегать фильтров, отделяющих волокна. Если они вынужденно применяются (асбест и т.п.), после них следует использовать дополнительные мембранные фильтры с размером пор не более 0,45 мкм. Во всех GMP даются подробные указания, имеющие целью оптимальное проведение всех этапов процесса производства. Правила касаются: 1) отбора проб, контроля качества сырья; 2) осуществления контроля непосредственно за процессами производства, обработки, упаковки. Даются правила для переработки бракованных серий. Применительно к производству антибиотиков (стадия ферментации) непосредственно относится указание на карантин, которому должно подвергаться сырье (т.е. компоненты, входящие в комплексные среды), на необходимость статистических критериев вариабельности компонентов 48 сырья, на проверку определенных видов сырья на пирогенность. Нормируется содержание микроорганизмов в воде для очистки и промывки получаемых лекарственных средств. Контроль процесса производства лекарственных препаратов должен осуществляться в соответствии с технологической документацией. Следует отметить, что правила GMP разных стран не совпадают с предлагаемыми методами стерилизации готового продукта. В целом преимущество отдается термическим методам стерилизации. GMP некоторых стран допускают также радиационную стерилизацию и стерилизацию окисью этилена. Большое внимание в GMP уделяется обеспечению четкого выполнения производственных инструкций. Подробно регламентируется перечень документов, точек контроля, воз- можных отклонений от принятых норм. Регламентируются способы фиксации результатов. Набор требований по регистрации и отчетности, содержащийся в GMP, позволяет проследить за ходом выполнения производственного процесса и точно установить в случае необходимости всю последовательность действий персонала, приведшую к отклонению качества продукта от требуемого параметра. Само собой разумеется, что правила GMP предусматривают строгую регламентацию тех выбросов, которые могут поступать от фармацевтических и биотехнологических предприятий в окружающую среду. Правила рекомендуют практически полное предотвращение поступления штаммов- продуцентов рекомбинантных белков в стоки и газо - воздушные выбросы, исключение попадания аллергенноактивных продуктов микробиологического синтеза в атмосферу с помощью различных технических решений, предотвращение сброса со сточными водами биотехнологических полупродуктов, способных повлиять на активность и состав биоценозов, используемых на установках биологической очистки загрязненной воды. Имеющие силу закона в ряде стран правила GMP позволяют предприятиям выпускать конкурентоспособную продукцию. Как показал международный опыт внедрения в медицинскую практику новых лекарственных препаратов, производимых биотехнологическими способами, организация их предварительных испытаний также должна подчиняться определенным правилам. Официальные инстанции, дающие разрешение на промышленный выпуск нового препарата, требуют соблюдения этих правил и соответствующего оформления документации. Всем этим повышается достоверность и объективность экспериментальных результатов и результатов испытаний в клинике. Правила GLP расшифровываются как "Good Laboratory Practice", что означает правильную (надлежащую) организацию проведения лабораторной работы при исследовании препарата. Правила GLP охватывают всю систему 49 предклинических испытаний. В качестве лишь одного из примеров отметим, что правилами предъявляются определенные требования к планировке помещений вивария, где содержатся подопытные животные, к условиям содержанияживотных, их подбору и т.п. Организация предклинических лабораторных испытаний должна обеспечивать объективность при сопоставлении данных в контроле и опыте. Весьма существенное значение для разрешения на промышленный выпуск нового препарата имеют правила GCP "Good Clinical Practice", т.е. надлежащая организация работы при проведении клинических испытаний. Соблюдение правил GCP позволяет получать объективные результаты и дает определенные гарантии приближения к максимальной безопасности в случае впервые вводимых человеку препаратов. Вопросы для самоконтроля 1. Этапы подготовки культуральной жидкости к переработке. 2. Основные типы сепараторов, применяемые в биотехнологии. 3. Дезинтеграция. Основные способы дезинтеграции. 4. Методы разделения веществ, применяемые в биотехнологии. 5. Контроль качества продуктов биосинтеза. 6. Тесты, применяемые при стандартизации лекарственных средств. 7. GMP - как единая система требований по организации производства и контролю качества лекарственных средств. 5. АНТИБИОТИКИ. КЛАССИФИКАЦИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА АНТИБИОТИКОВ. Антибиотики – это химиотерапевтические вещества, вырабатываемые микроорганизмами или получаемые из других источников (водоросли), а также получаемые путем химического синтеза, обладающие способностью подавлять возбудителя в организме больного. Химиотерапевтические средства – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным (действующим на причину) действием. Чтобы выбрать антибиотик для лечения того или иного заболевания, необходимо иметь представление каким образом антибиотики могут воздействовать на микроорганизмы. Все антибиотики можно классифицировать: - по механизму действия: 1. Нарушающие синтез биомакромолекул; циклосерин; гликопептиды; ванкомицин; тейкоплакин). 50 2. Нарушающие функции цитоплазматической мембраны (циклические полипептиды, полиеновые антибиотики). 3.Нарушающие синтез белка в рибосомах (группа левомицетина, тетрациклина, макролиды, линкозамиды, аминогликозиды, фузидин, анзамицины). 4. Ингибиторы синтеза РНК и ингибиторы метаболизма фолиевой кислоты (рифампицины). 5. Ингибиторы синтеза мРНК (актиномицин). -по типу действия: 1. Антибиотики с бактерицидным действием приводят к гибели бактерий путем влияния на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану и приводящие к гибели бактерии. 2. Антибиотики с бактериостатическим действием влияют на синтез макромолекул и останавливают размножение бактерий. - по спектру действия: 1. Антибиотики с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамиды, биосинтетические пенициллины, фузидин, ванкомицин). 2. Антибиотики с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды). 3. Антибиотики широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, пинемы, анзамицины, цефалоспорины). - по химической структуре Широкое применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства поставило задачу получения этих биологически активных веществ в больших количествах. Решение этой задачи стало возможным благодаря созданию мощной фармацевтической промышленности. В основе промышленного производства антибиотиков лежит ряд последовательных этапов: получение высокопродуктивных штаммов- продуцентов, разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки антибиотика, создание готовых препаратов и контроль их качества. Каждый из этих этапов должен обеспечиваться соответствующими специалистами (генетиками, микробиологами, технологами и др.). Производство антибиотиков представляет ныне мощную, хорошо развитую отрасль, входящую в фармацевтическую промышленность. Она занимает одно из ведущих мест в производстве лекарственных препаратов. Особенно широко она развита в США, Англии, Японии, Франции, Италии и других странах. Например, в США ежегодно выпускается антибиотиков и их производных на сотни миллионов долларов. Среди антибиотиков выделяют β-лактамы 51 Пенициллины. Пенициллин впервые получен из культуральной жидкости в аморфном, а затем – в кристаллическом виде А. Флемингом, X. Флори и Е. Чейном в 1940 г. До сих пор антибиотики пенициллинового ряда составляют наиважнейшую группу химиотерапевтических препаратов. Ядром пенициллинов является 6- аминопенициллиновая кислота (6-АПК), которую используют для получения полусинтетических пенициллинов. Один водород в аминогруппе 6-АПК может быть заменен на какой-либо радикал (R), усиливающий и ( ИЛИ ) расширяющий (изменяющий) антимикробный спектр полусинтетического производного. Обычно 6-АПК получают из бензилпенициллина (пенициллина G). В настоящее время в различных странах многие антибиотики и их полусинтетические производные на их основе производят биосинтетически с помощью Penizillum notatum или Penizillum chrysogenum. Цефалоспорины – являются большой группой экстрацеллюлярных β-лактамных антибиотиков, в которых шестичленное дигидротиазиновое кольцо соединено с β -лактамным кольцом. Благодаря этому ядром цефалоспоринов является 7- аминоцефалоспорановая кислота – 7-АЦК (цефемовое ядро), впервые выделенная в ходе очистки цефалоспорина С – продуцент Cephalosporium acremonium. Известно около 20 цефалоспоринов, созданных методом полусинтеза из АЦК: цефалоридин (цепорин), цефуроксим, цефалотин, цефацетрил, цефалексин, цефокситин, цефазолин, цефаридин, цецефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим и др. Боковые цепочки, содержащие 2-аминотиазолил как R 1 в цефотаксиме, цефтриаксоне, цефтазидиме и некоторых других, усиливают активность цефалоспоринов против стрептококков и грамотрицательных бактерий. Иминометоксигруппа в той же позиции, например, в цефуроксиме, обеспечивает активность антибиотика против стафилококков и грамотрицательных бактерий. В таблице приведены радикалы R 1 и R 2 1 – Оксацефемы –сходны с цефалоспоринами, у которых атом серы в дигидротиазиновом (цефеконовом) кольце замещен на кислород. Представителем такой группы антибиотиков является широкоспектральный препарат латамоксеф (мексалактам), в котором 7-α-метоксигруппа стабилизирует молекулу и придает устойчивость большинству β-лактамаз. Клавамы – β-лактамные антибиотики, отличающиеся от пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера заменена на кислород (клавемовое оксазолидиновое кольцо) и в позиции 6 нет боковой цели. |