Микробная биотехнология Химическая энзимология

• Название: Микробная биотехнология Химическая энзимология
• Дата: 30.06.2019
• Размер: 0.8 Mb.
• Имя файла: biotech.pdf
• Тип: Учебное пособие; #83406
• страница: 8 из 9

Вопросы для самоконтроля

72 1. История инженерной энзимологии как науки.
2. Структура и функции ферментов.
3. Способы получения ферментов.
4. Основные представления о ферментативном катализе.
5. Методы выделения и очистки ферментов.
6. Основные физико-химические свойства иммобилизованных ферментов.
7. Отличия иммобилизованных ферментов от нативных препаратов.
8. Химические методы иммобилизации ферментов.
9. Физические методы иммобилизации ферментов.
10. Носители, применяемые для иммобилизации ферментов.
11. Иммобилизация ферментов путем включения в гели.
12. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран).
13. Методы иммобилизации клеток.
14. Применение иммобилизованных клеток.
15. Получение аминокислот с использованием иммобилизованных клеток.
16. Получение антибиотиков с помощью иммобилизованных клеток.
17. Основные промышленные технологии с использованием гетерогенных биокатализаторов.
18. Применение иммобилизованных ферментов.
19. Типы связей ферментов с поверхностью носителя.
20. Отличие химических методов иммобилизации ферментов от физических методов.
7. ПРИМЕНЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ В
ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ
Одним из ярких примеров применения биокатализатора является его использование в тонком органическом синтезе.
Уникальная специфичность и стереоспецифичность действия ферментов, возможность проведения процессов в «мягких» условиях, протекание реакции с высокой скоростью при использовании незначительных количеств катализатора, практическое отсутствие побочных реакций – все это делает биокаталитические процессы чрезвычайно привлекательными при получении лекарственных субстанций. Поэтому в настоящее время биотехнология может успешно конкурировать с тонкими химическими технологиями на отдельных этапах приготовления лекарственного препарата.
Ферментативная модификация β-лактамных антибиотиков
Получение новых, более эффективных аналогов пенициллина, связано с изменением его боковой цепи при сохранении целостности остальной части, так называемого ядра антибиотика – 6-аминопенициллановой кислоты (б-АПК).

73
Поскольку масштабный химический синтез таких соединений невозможен, самым простым путем проведения необходимого превращения является отщепление боковой цепи биосинтетического пенициллина, выделение 6-АНК и последующее ацилирование ее аминогруппы с получе- нием «полусинтетического» аналога.
Подобное превращение может быть проведено в одну стадию и самых обычных условиях при 10-40°С в водной среде с использованием специфического фермента – пенициллинамидазы.
С использованием иммобилизованной пенициллинамидазы связан еще один процесс инженерной энзимологии
– получение
7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты, ключевого соединения для синтеза новых цефалоспоринов.
Ферментативное превращение рацематов в энантиомеры
Примером практического использования биокатализа служит ферментативное превращение рацематов в энантиомеры аминокислот. При помощи ацилаз можно разделить рацемические смеси большинства аминокислот. Ацилазы аминокислот – широко распространенные ферменты, содержащиеся в тканях животных (ацилаза из почек свиньи хорошо изучена и широко используется), в растениях и микроорганизмах.
Разделять рацемические смеси аминокислот можно, используя не только ацилазы, но также и ряд протеолитических ферментов, обладающих высокой стереоспецифичностью в реакции гидролиза сложных эфиров аминокислот.
К перспективному способу получения оптически чистых аминокислот относится энантиоселективное ферментативное превращение и аминокислоты ряда циклических производных, химический синтез рацематов которых представляет собой более легкую задачу, чем получение рацемата самой аминокислоты
Подобно тому, как аминоацилазы и некоторые протеазы используются для получения энантиомеров аминокислот, многие другие гидролитические ферменты могут применяться для получения различных оптических изо- меров сложных органических соединений.
Биокатсиштическое получение простаноидов
Простагландины являются гидроксилированными продуктами превращения в организме полиненасыщенных жирных кислот. Они состоят из 20 атомов углерода и включают циклопентановое кольцо. В зависимости от структуры пятичленного кольца все простагландины делят на четыре группы: А,В,Е и F, а в зависимости от числа двойных связей в метильной и карбоксильной боковых цепях в каждой из групп различают индивидуальные простагландины, обозначаемые буквой, выражающей принадлежность к группе, и цифрой, показывающей число двойных связей в боковых цепях (Al,
A2 и т.д.).
В организме простагландины синтезируются из полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) посредством специальной ферментной, системы
(простагландинсинтетаза), фиксированной в

74 микросомальных мембранах. Источниками субстрата для биосинтеза простагландинов в организме являются фосфолипиды клеточных мембран, триглицериды, этирифицированный холестерин, высвобождающие свободные полиненасыщенные жирные кислоты активированной ферментной системой (ацилгидролазы) в ответ на нейрогуморальную стимуляцию.
Наиболее распространѐнным субстратом простагландинсинтетазы является арахидоновая кислота, содержащаяся в фосфолипидной фракции клеточных мембран практически всех клеток животных организмов.
Переход арахидоновой (5, 8, 11, 14-эйкозатетраеновой) кислоты в простагландины, тромбоксаны и простациклин осуществляют сложные полиферментные системы. Ключевым ферментом синтеза следует считать общий для всех этих соединений первый фермент цепи
– простагландинэндопероксидсинтетазу.
Этот фермент катализирует образование простагландина Н
2
– общего промежуточного соединения при получении всех простагландинов, тромбоксанов и простациклина.
Простагландины и их основные предшественники
ПНЖК
(арахидоновая, зйкозатетраеновая, эйкозатриеновая) содержатся во всех тканях млекопитающих в очень малых количествах. Наибольшим содержанием характеризуется семенная жидкость млекопитающих и человека, предстательная железа, а также эндометрий матки и яичников. ПГ найдены в мозговой ткани различных животных и человека, слизистой оболочке желудка и кишечника, селезѐнке, почках, печени, поджелудочной железе, мышечной ткани, радужной оболочке.
Простагландинэндопероксидсинтетаза – гемсодержащий фермент, катализирующий трехсубстратную реакцию, в ходе которой происходит сопряженное окисление кислородом арахидоновой кислоты и какого-либо донора электронов. Донорами электронов могут служить слабые органи- ческие и неорганические восстановители, например ферроцианид, адреналин, триптофан, НАДН
2
Лейкотриены представляют собой соединения, играющие важную роль при протекании воспалительных процессов, бронхиальной астмы, регуляции адгезии и агрегации нейтрофилов, полиморфноядерных лейкоцитов и т.д.
Арахидоновая кислота может быть получена из подходящих масс биокаталитическим путем с использованием специфических фосфолипаз.
Конверсия ПНЖК в организме под влиянием специфической простагландинсинтетазы осуществляется через образование эндоперекисей простаглаидинов с включением двух молекул кислорода. Образующиеся короткоживущие промежуточные соединения
(эндоперекиси) под воздействием других ферментных систем могут образовывать не только соответствующие простагландины, но и другие биологически активные вещества специфического спектра действия для ряда тканей. Так, при специфической энзиматической циклизации арахидоновой кислоты обра- зуются эндоперекиси (простагландииы G
2
и Н
2
, ПГТ
2
и ПГН
2
), которые

75 далее трансформируются в простагландины Е
2
, Д
2
, F
2α
. В случае каталитического воздействия на эндоперекиси фермента тромбоксансинтетазы, локализованной в мембранах микросом тромбоцитов, образуются тромбоксаны (А
2
,В
2
) – вещества с исключительно выраженными адгезионными свойствами. При воздействии на эти же вещества ферментной системы микросомальной фракции артериальных сосудов биосинтез идет в направлении образования простациклина (ПГИ
2
и ПГХ) – веществах, характеризующихся мощным антиадгезионным и деагрегирующим эффектом, в десятки раз превосходящим антитромбическую активность ПГЕ
1
и ПГД
2
Простагландины синтезируются практически всеми тканями жи- вотного организма. Их можно рассматривать как производные
«простаноевой кислоты», не существующей в природе, но полученной синтетически.
ПНЖК, непосредственно являющиеся предшественниками биосинтеза простагландинов — арахидоновая и γ – линоленовая кислоты, содержатся в продуктах питания в крайне малых количествах и чаще всего отсутствуют.
Эти вещества синтезируются в организме из поступающих с пищей эссенциальных жирных кислот: (γ – линоленовой и линолевой). При этом происходит ферментативное удлинение углеродного скелета ЭЖК на два метиленовых звена за счѐт «пристраивания» ацетатного фрагмента с обра- зованием цепочки из 20 углеродных атомов. Все продукты, являющиеся метаболитами ПНЖК с сохранением длины углеродного скелета, обоб- щѐнно называются эйкозаноидами по наименованию соответствующего греческого числительного. Нужно отметить, что арахидоновая кислота превалирует в составе ПНЖК, тогда как концентрации γ – линоленовой на порядок, а тиленодоновой (или эйкозапентаеновой)- на два порядка ниже.
Вновь синтезированная арахидоновая кислота немедленно связывается в мембранные фосфолипиды, которые и являются депо предшественников простагландиновв организме.
Одним из сложных аспектов изучения простагландинов является выявление их роли в образовании и функциях циклического 3',5'- адено- зинмонофосфата (цАМФ), который занимает центральное место во внутриклеточных регуляторных механизмах.
Простагландины в зависимости от вида ткани и разновидности аленилатциклазы могут как стимулировать (наблюдается чаще всего), так и ингибнровать синтез цАМФ. Так, например, именно угнетением аденилатциклазы, катализирующей синтез цАМФ спонтанно или индуцированно норадреналином, глюкагоном и активацией симпатической нервной системы и объясняется антимиоматический эффект ПГЕ
1
. Имеются данные., указывающие на ингибирующее влияние ПГЕ
1
на образование цАМФ под воздействием вазопрессина через систему аденилатциклазы.
Простагландины достоверно снижают содержание цАМФ в слизистой оболочке желудка, жировых клетках, тканях собирательных канальцев

76 почек и в некоторых структурах центральной нервной системы. В большинстве тканей простагландины активируют синтез цАМФ. ПГЕ
1
оказывает стимулирующее влияние на синтез гормона роста, вазопрессина, тиреотропина. Простагландины Е
1
, Е
2
и E
2α стимулируют биосинтез стероидов; простагландины Е
2
и E
2α способствуют высвобождению окситоцина и увеличивают содержание в крови пролактина. Таким образом они оказывают влияние на важнейшие эндокринные железы животных и человека: гипофиз, кору надпочечников, щитовидную железу, яичники.
Существующие в настоящее время способы получения простагландинов можно подразделить на три группы: 1 )выделение, 2)биосинтез и 3)синтез.
Выделение из животного сырья было единственным способом получения ПГ в незначительных количествах. Первые экстракты, выделенные в 1906 и 1913 гг. из предстательных желез собаки и человека, представляли собой неочищенные фракции. В основе этих способов выделения лежала обработка сырья водно-спиртовым раствором метанола, этанола, изопропанола с последующим переводом извлеченных веществ в неводный растворитель (хлороформ, метиленхлорид, эфир, этилацетат, бензол). В последующем стали применять более полное разделение вытяжек путѐм распределения между несмешивающимися растворителями, используя неводные растворители и буферные растворы.
Получение кристаллических простагландинов осуществляют путѐм экстракции, концентрирования, фракционирования и других необходимых операций, проводимых в мягких условиях при определенных значениях рН и температуры. Полученные экстракты упаривают в вакууме до сухого состояния и подвергают распределительной хроматографии и кристаллизации.
Биосинтез. С целью получения простагландинов в промышленных масштабах в настоящее время применяется синтез in vitro. Биосинтез in vitro представляет по существу имитацию в замкнутой системе условий его осуществления in vivo. В зависимости от условий проведения биосинтеза и количества вводимых ингредиентов можно получить простагландины массой от нанограммов до сотен граммов.
Основными компонентами осуществления биосинтеза с целью их производства являются: предшественники, ферменты, рН среды и тип буфера, концентрация кислорода, наличие кофакторов и ингибиторов.
Синтез. Первые шаги в направлении осуществления полного химического синтеза простагландинов были разработаны 2 различных способа синтеза ненасыщенного кетона, являющегося продуктом гидрогенизации ПГЕ
1
(1963 г). Этот путь получения вещества, имеющего скелет простаноевой кислоты, предшествовал последующим работам и области химического синтеза ПГЕ
1
В настоящее время синтетическим путѐм получают большое количество производных простагландинов – их аналогов и гомологов, в том числе соединения с укороченными алкильными цепями, соединения, этерифицированные в положениях С
11
и

77
C
15
, соединения, содержащие вместо циклопентанового ядра циклогексановое.
Известно, что некоторые микроорганизмы могут трансформировать арахидоновую кислоту в простагландины. Трансформацию арахидоновой кислоты отечественным штаммом Fussarium sambucinum (штамм BKMF-
842) проводили на питательной среде, содержащей дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, пептон в стерильных условиях при 26ºС на качалке
240 об/мин в течение 36-48 ч. Выделение целевого продукта проводили жидкостной адсорбционно-распределительной хроматографией. При добавлении арахидоновой кислоты в питательную среду мицелия гриба
Fussarium sambucinum происходит трансформация АК в ПГЕ
2
и F
2α
, общий выход которой составляет 18%.
Вопросы для самоконтроля
1. Применение ферментов в качестве реагентов для обнаружения различных веществ. Приеимущества биокатализаторов.
2. Ограничения использования природных биокатализаторов.
3. Преимущества использования иммобилизованных ферментов.
4. Биосенсоры, основные типы и их применение.
5. Ферментные электроды, их использование.
6. Вещества, используемые в качестве ферментов в ферментных электродах.
7. «Бактериальные» электроды.
8. Кинетические аспекты катализа иммобилизованными ферментами.
9. Ферментативное превращение рацематов в эпантиомеры.
10. Ферментативная модификация b-лактамных антибиотиков.
11. Биокаталитическое получение простаноидов.
12. Причины и механизмы изменения каталитических и физико- химических свойств иммобилизованных ферментов.
13. Методы определения глюкозы в биоматериале.
14. использование биодатчиков для определения мочевины.
15. использование биодатчиков для определения пенициллина.
16. Использование биодатчиков для определения L-тирозина в биоматериале.
17. Использование биодатчиков для определения нитритов с применением нитритредуктазы.
18. Получение безлактозного молока с помощью иммобилизованной лактазы.
19. Разделение рацематов аминокислот с помощью иммобилизованной аминоацилазы.
Тестовые задания

78 1. Антибиотики синтезируются микроорганизмами во время: а) лаг-фазы; б) экспоненциальной фазы; в) фазы замедленного роста; г) стационарной фазы; д) фазы отмирания.
2. Основными стадиями биотехнологического производства являются: а) подготовка сырья и биологического объекта; б) стерилизация питательной среды; в) накопление биомассы и образование цельного продукта; г) выделение и очистка целевого продукта; д) поддержание чистой культуры продуцента; е) получение товарной формы продукта.
3. При непрерывных биотехнологических процессах объект постоянно поддерживается в: а) лаг-фазе; б) экспоненциальной фазе; в) стационарной фазе; г) фазе ускорения роста.
4. Назовите основные разделы биотехнологии: а) генетическая инженерия; б) клеточная инженерия; в) микробная биотехнология; г) молекулярная генетика;
5. Время генерации культуры продуцента: а) время, необходимое для удвоения биомассы; б) промежуток времени от лаг-фазы до начала фазы замедления роста; в) промежуток времени, за который определенный объем питательной среды поступает в ферментер:
6. При производстве лекарственных веществ используют: а) периодическое культивирование; б) глубинное культивирование; в) метод «ткани-няньки»; г) периодическое культивирование с диализом.
7. Витамин В
2
синтезируется дрожжами в: а) лаг-фазу; б) профазу; в) экспоненциальную фазу; г) стационарную фазу.
8. Для процессов глубинного культивирования продуцентов ферментов характерны особенности: а) высокая степень асепнтики; б) рыхлые среды с небольшой высотой слоя;

79 в) неинтенсивный характер процесса культивирования; г) Высокая степень перемешивания содержимого ферментера.
9. Непрерывное (проточное) культивирование используется для получения: а) аминокислот; б) антибиотиков; в) белка одноклеточных; г) ферментных препаратов.
10. Для культивирования животных клеток используют: а) реакторы с механическим перемешиванием; б) реакторы с циркуляционным перемешиванием; в) реакторы с пневматическим перемешиванием. г) Реакторы для поверхностного культивирования.
11. Назовите методы регулирования непрерывного культивирования, применяемые при производстве биологически-активных веществ: а) диализ; б) микроскопический контроль; в) турбидостатный режим; г) криоконсервация;
12. Для получения белков путем микробиологического синтеза используют: а) поверхностное культивирование; б) адсорбционный метод; в) включение в гели; г) метод обратной транскрипции.
13. В биотехнологии имеют место отклонения от идеальной кривой развития культуры продуцента, называемые: а) диауксия; б) стерохимическое соотношение; в) индукция; г) отмирание.
14. К методам хранения посевного материала на биотехнологических предприятиях относят: а) криосохранение инокулята; б) хранение под вакуумом; в) хранение под минеральным маслом; г) приодические пересевы .
15. Сущность любого биотехнологического процесса определяется: а) спецификой клетки-продуцента; б) спецификой питательной ср еды для клетки-продуцента; в) особенностями конструкции биореактора; г) особенностями выделения и очистки целевого продукта
16. Антибиотики с самопромотированным проникновением в клетку патогена

80 а) бета-лактамы б) аминогликозиды в) макр олиды г) гликопептиды
17. Появление множественной резистентности опухолей к противоопухолевым агентам обусловлено: а) непроницаемостью мембраны б) ферментативной инактивацией в) уменьшением сродства внутриклеточных мишеней г) активным выбросом
18. Практическое значение полусинтетического аминогликозида амикацина обусловлено: а) активностью противанаэробных патогенов б) отсутствием нефротоксичности в) устойчивостью к защитным ферментам у бактерий, инактивирующим г) активностью противопатогенных грибов
19. Защита продуцентов аминогликозидов от собственного антибиотика а) низкое сродство рибосом б) активный выброс в) временная ферментативная инактивация г) компартментация
20. Выделение и очистка продуктов биосинтеза и оргсинтеза имеет принципиальные отличия на стадиях процесса а) всех б) конечных в) первых г) принципиальных различий нет
21. Связывание молекулы фермента на поверхности носителя при адсорбции осуществляется за счет: а) ковалентных связей; б) электростатических взаимодействий; в) водородных связей; г) гидрофобных взаимодействий; д) гликозидных связей; е) фосфодиэфирных связей.
21. История иммобилизации ферментов началась в : а) конце 90-х годов 19 века; б) конце 60-х годов 20века; в) конце 40-х годов 20 века; г) в начале 70-х годов 20 века.
23. Недостаток метода включения ферментов в гели заключается в том, что: а) фермент непрочно связан с носителем;

81 б) возникают стерические затруднения для проникновения субстрата в полимерную матрицу геля; в) невозможны ферментативные превращения высокомолекулярных субстратов; г) низкая стабильность образовавшегося комплекса фермент- носитель.
24. Химические методы иммобилизации отличаются от физических тем, что: а) фермент связан с носителем ковалентно; б) фермент связан с носителем нековалентно; в) недостаточно высокая прочность связывания фермента с носителем; г) возможна иммобилизация фермента без носителя.
25. В качестве носителей для иммобилизации используют: а) нуклеиновые кислоты ; б) иониты ; в) воду; г) солому;
26. Для химической иммобилизации ферментов используют: а) витамины; б) глутаровый альдегид; в) ауксины; г) микроэлементы .
27. К физическим методам иммобилизации относят: а) глутаральдегидны й метод; б) включение в микрокапсулы ; в) метод электроосаждения; г) включение в волокна
28. Иммобилизованные ферменты используются для получения: а) пенициллина; б) медицинских препаратов; в) аминокислот; г) белков.
29. Активирование нерастворимого носителя в случае иммобилизации фермента необходимо а) для усиления включения фермента в гель; б) для повышения сорбции фермента; в) для повышения активности фермента; г) для образования ковалентной связи.
30. Иммобилизация индивидуальных ферментов ограничивается таким обстоятельством, как а) высокая лабильность фермента; б) наличие у фермента кофермента; в) наличие у фермента субъединиц;

82 г) принадлежность фермента к гидролазам.
31. Целями иммобилизации ферментов в биотехнологическом производстве являются а) повышение удельной активности; б) повышение стабильности; в) расширение субстратного спектра; г) многократное использование.
32. Регулируемая ферментация в процессе биосинтеза достигается при способе: а) периодическом; б) непрерывном; в) отъемно-доливном; г) полупериодическом.
33. Термин «мультиферментный комплекс» означает а) комплекс ферментных белков, выделяемый из клетки путем экстракции и осаждения; б) комплекс ферментов клеточной мембраны; в) комплекс ферментов, катализирующих синтез первичного или вторичного метаболита; г) комплекс экзо- и эндопротеаз.
34. Предшественник пенициллина, резко повысивший его выход при добавлении в среду а) бета-диметилцистеин; б) валин; в) фенилуксусная кислота; г) альфа-аминоадипиновая кислота.
35.Предшественник при биосинтезе пенициллина добавляют а) в начале ферментации; б) на вторые-третьи сутки после начала ферментации; в) каждые сутки в течение 5-суточного процесса; г) экспоненциальной фазы развития культуры.
36. Иммобилизация клеток продуцентов целесообразна в случае, если целевой продукт а) растворим в воде; б) нерастворим в воде; в) локализован внутри клетки; г) им является биомасса клеток.
37. Целями иммобилизации ферментов в биотехнологическом производстве являются а) повышение удельной активности; б) повышение стабильности; в) расширение субстратного спектра; г) многократное использование.

83 38. Целевой белковый продукт локализован внутри иммобилизованной клетки. Добиться его выделения, не нарушая системы, можно а) усилив системы активного выброса; б) ослабив барьерные функции мембраны; в) присоединив к белку лидерную последовательность от внешнего белка; г) повысив скорость синтеза белка.
39. Колоночный биореактор для иммобилизации целы х клеток должен отличаться от реактора для иммобилизации ферментов а) большим диаметром колонки; б) отводом газов; в) более быстрым движением растворителя; г) формой частиц нерастворимого носителя.
40. Технология, основанная на иммобилизации биообъекта, уменьшает наличие в лекарственном препарате следующих примесей: а) следы тяжелы х металлов; б) белки; в) механические частицы; г) следы органических растворителей.