Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Важнейшие продуценты лекарственной продукции царства животных № п/п Продуцент Использование в биотехнологическом производстве Вид Лекарственное средство Орган 1. Человек Эритроцитарная масса для гемотрансфузии, лейкоцитарная масса Кровь 2. Лошадь, осел, мул Антистафилококковая плазма, гетерологические антитоксические сыворотки, противодифтерийная, противостлбнячная, сыворотки Кровь 3. Марал (изюбр, пятнистый олень) Пантокрин Панты 4. Корова, як Инсулин Панкреотин Паратиреоидин Тиреотропин Гиалуронидаза Румалон Ткань поджелудочн ой железы, паращитовид ной железы, гипофиза, семенников, хрящей 5. Баран Нормальные эритроциты для постановки ИФА Кровь 6. Коза Гетерологичная антисыворотка к вирусу клещевого энцефалита Кровь 7. Свинья Пепсин Инсулин Слизистая желудка 27 8. Кролик Новорожденн ый крольчонок Диагностические сыворотки Вакцина против бешенства Кровь Среда для размножения вируса 9. Курица Лизоцим Лецитин Белковая фракция, желтка яиц 10. Змеи Антитоксические сыворотки (анти- эфа, анти-гюрза) Антигены для иммунизаци и 11. Пчелы Пчелиный яд Ткань брюшных желез 12. Скорпионы Антитоксическая сыворотка яд Большинство используемых в биотехнологии продуцентов по отношению к температуре являются мезофилами: их рост и развитие происходит при температуре 25-37ºС. Психрофильные микроорганизмы растут при температуре 0-15ºС, и термофилы – при температуре 60-80ºС. Все перечисленные группы имеют промежуточные формы. Для биосинтетических процессов в промышленном производстве желательно использовать термофильные микроорганизмы. Отдельные термофилы растут при 110ºС, а в подводных выбросах сверхгорячих источников больших океанических глубин найдены микроорганизмы, развивающиеся при t 300ºС и под давлением. Среди термофилов обнаружены ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Скорость роста и метаболическая активность у них выше, чем у мезофиллов. Ферменты, синтезируемые термофилами (протеазы), имеют высокую устойчивость к нагреванию, действию окислителей, детергентов и других неблагоприятным условиям. Применение термофилов в микробной биотехнологии (продуценты протеаз Thermus aquaticus и Termus caldophilus) позволяет снизить затраты на стерилизацию промышленного оборудования и на системы охлаждения биореакторов. Это позволит применять ферментеры без громоздких теплообменных устройств и упростить их конструкцию. В микробиологическом синтезе для каждой культуры микроорганизмов есть оптимум, минимум и максимум pH. Большинство микроорганизмов лучше всего развивается при pH 7,0 (нейтральная среда). Ацидофильным микроорганизмам (некоторые дрожжи, плесени) необходимо иметь водородный показатель среды 1,5-4,5, базофильным – pH 8,5-9,5. Ацидофильные формы не растут при pH выше 5,0-5,5, Thiobacillus ferrooxidans встречается в шахтных водах месторождений сульфидных 28 минералов (pH иногда меньше 1,0). Алкалофильные бактерии растут при pH более 10 (некоторые бактерии рода Bacillus), разлагающие мочевину до аммиака. В промышленности предпочтительнее применять ацидофильные штаммы, так как посторонняя микрофлора в таких субстратах погибает и уменьшаются средства, применяемые для стерилизации. Одним из факторов, ограничивающих рост микроорганизмов, является высокое осмотическое давление среды. К осмофильным видам относятся некоторые дрожжи (Xeromyces bisporus) и мицелиальные грибы, они могут расти на субстратах, содержащих 20% сахара и более. В настоящее время особую значимость для производства фармацевтической продукции приобретают исследования процессов перестройки генетических программ клеток продуцентов в направлении увеличения скорости биосинтеза целевых продуктов и конверсии питательной среды методами современной генетики. Вопросы для самоконтроля 1. Преимущества использования бактерий в качестве продуцентов белка и витаминов при производстве фармацевтической продукции. 2. Биологические объекты, используемые в биотехнологии в качестве продуцентов. 3. Требования, предъявляемые к штамма микроорганизмов, используемых в промышленности. 4. Факторы, влияющие на рост микроорганизмов-продуцентов. 5. Важнейшие продуценты лекарственных веществ. 3. СЛАГАЕМЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК Если представить любой из вариантов использования современных биотехнологий в производстве как иерархическую структуру, то биообъекты (мутанты и генно-инженерные клетки прокариот, дифференцированные клетки тканей высших растений и животных, иммобилизованные ферменты) в совокупности с управляемыми реакторами, сепараторами, системами смешивания газожидкостных потоков, флотаторами, экстракторами, абсорберами и другим оборудованием составят компоненты первой ступени этого построения. Объединение нескольких взаимосвязанных технологических процессов и аппаратов в функциональную единую технологическую цепочку представляет собой цех фармацевтического предприятия, т.е. элемент второй ступени иерархии. Например, цех выращивания клеток меристемы женьшеня, участок отделения культурального фильтрата от биомассы 29 коринобактерий при производстве лизина. Именно на второй ступени иерархии закладываются технологические основы создания безотходности биотехнологического производства фармацевтической продукции и оптимизации как отдельных аппаратов, так и типовых модулей. Третья ступень иерархии: опытно-промышленная установка или же предприятие законченного цикла, где наряду с основными подсистемами присутствуют вспомогательные, а точнее общеинженерные подсистемы. Сопоставляя структуры биотехнологического производства лекарственной продукции, можно заключить, что набор элементов на разной ступени иерархии практически одинаков. При любой поставленной цели типовой процесс предусматривает использование биообъектов, биореакторов, систем асептики, подачи пластического и энергетического материалов и разделение продуктов ферментации. Основные различия начинают выявляться со второй ступени иерархии и особенно наглядны на уровне организации вспомогательных подсистем. Например, при производстве витамина В 12 , где все операции направлены на обеспечение синтетической функции биообъекта, такие подсистемы, как подача предшественника в биореактор, мембранная фильтрация для извлечения цианокобаламина из культуральной жидкости, функционально необходимы. При выращивании каллусных культур родиолы никакой необходимости в подобного рода подсистемах нет. Среди элементной базы первой иерархической ступени есть множество как типовых, так и специфических решений, связанных с использованием разнообразных биообъектов и различиями в их потребностях к факторам пластического и энергетического обеспечения. Эффективность производства фармацевтической продукции биотехнологическими методами зависит от всех слагаемых и общего материального и энергетического баланса. При этом следует помнить, что в биотехнологии есть два активных представителя средств производства и между ними существует взаимовлияние. Действительно, чем выше темп функционирования биообъекта, тем более высокие требования предъявляются к аппаратурному оформлению процессов с его использованием. Необходима оптимизация как биообъекта, так и процессов и аппаратов биотехнологических производств. Общая технологическая схема производства включает: 1. подготовку посевного материала или инокулята, куда входит ряд этапов, начиная от засева пробирок и качалок колб до проведения выращивания в засевном ферментере. Все операции осуществляют в специальном цехе и при соблюдении правил микробиологических работ, в том числе и при систематической стерилизации воздуха в помещениях. Инокулят получают путем масштабирования чистой культуры продуцента. 2. подготовку питательной среды для производственного ферментера, которая включает выбор и реализацию рецептуры среды. Стерилизация должна гарантировать сохранность всех пластических и энергетических 30 компонентов в исходном количестве и качестве. Для получения питательной среды применяют различное оборудование,причем в специальном цехе проводят и водоподготовку,включающую очистку воды. 3. подготовку ферментационного оборудования, гарантирующего сохранность от попадания в процесс контаминационной флоры.На этом этапе проводят стерилизацию всех узлов ферментеров, а также примыкающих к ним трубопроводов. 4. стадию биосинтеза, где в максимальной степени используются возможности биообъекта для получения лекарственного начала, которое накапливается внутри клетки или же секретируется в культуральную среду.При этом все производственные операции осуществляют в стерильных условиях, при определенной температуре и значении рН среды,а также в течение характерного для каждого продуцента периода времени. 5. стадию концентрирования, одновременно предназначенную и для удаления балласта; 6. стадию очистки, реализуемую за счет повтора ряда однотипных операций или же за счет набора различных препаративных приемов повышения удельной специфической активности лекарственного начала (ультрафильтрация, экстракция, сорбция, кристаллизация); 7. стадию получения конечной субстанции или готовой лекарственной формы с последующими операциями расфасовки и упаковки; Центральный этап фармацевтического производства – ферментация. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процесса роста или биосинтеза биологически активных веществ. В основе процесса ферментации лежит культивирование продуцентов, т.е. выращивание культуры микроорганизмов, клеток высших растений или плесневых грибов. Культура микроорганизмов – это популяция микроорганизмов, выращиваемая в питательной среде и находящаяся в стадии размножения или закончившая его. При производстве лекарств и БАД применяются следующие методы культивирования. Твердофазная поверхностная ферментация осуществляется на увлажненной, сыпучей или пастообразной среде. Рост продуцента происходит на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных водой или воздухом. Типичным примером является приготовление силоса или компоста в кучах. Управляемый процесс твердофазной ферментации имеет место при производстве ферментов с помощью микромицетов. 31 Методы культивирования Для поверхностного культивирования на твердых средах применяют свекловичный или виноградный жом, зерновую шелуху, пшеничные или рисовые отруби, к которым добавляются различные питательные вещества. Оптимальная влажность субстрата 40-70%. Стерилизация осуществляется путем прямого введения пара в среду при перемешивании. Если увлажнение проводят подкисленными растворами, то стерилизация происходит 15-20 мин при 95 ºС. Обеспечение кислородом затрудняется с увеличением слоя субстрата, поэтому для каждого штамма или производства своеобразная толщина слоя питательной среды. При выращивании мицелиальных грибов перемешивание не допускается. При твердофазной поверхностной ферментации очень большая проблема - поддержание постоянной температуры во всем объеме питательной среды. Например, температура компостов увеличивается от поверхности к глубинным слоям. Кинетика роста популяции на поверхности (пленке) отличается от глубинных условий. При твердофазном культивировании в начале роста культуры, когда в среде отсутствует градиент концентрации субстрата, все клетки в колонии могут расти с максимальной для данной среды удельной скоростью роста, т.е. по экспоненциальному закону. В центральной части субстрата рост клеток лимитирован диффузией и, таким образом, биомасса растет с максимальной удельной скоростью лишь на поверхности питательной среды. Управляемый процесс твердофазного поверхностного культивирования применяется при производстве энзиматических лекарственных препаратов. Поверхностное Глубинное На жидких питательных средах Твердофазное (2-3 см толщина слоя) Непрерывное Периодическое Полунепрерыв- ное С подпиткой Отъемно- доливочное С диализом 32 Рассмотрим производство амилолитических ферментов. В качестве питательной среды используют пшеничные отруби. Стерилизованную питательную среду после засева соответствующего штамма микромицета распределяют по кюветам и транспортируют в растильные камеры, где поддерживается определенная температура и влажность воздуха, а также обеспечивается вентиляция вдоль поверхности субстрата с целью аэрации. Для Aspergillus awamori как продуцента амилаз различают 3 стадии выращивания культуры: 1. Рост до начала прорастания конидий (t - 32º - 38ºС, 100% влажность воздуха); 2. Стадия интенсивного прироста биомассы при t 27ºС; 3. На третьей стадии прекращают подачу в камеру кондиционированного воздуха. Общая продолжительность процесса 42 часа. Существенным недостатком этого метода является наличие больших производственных площадей, трудность автоматизации технологического процесса. В настоящее время разработаны типы механизированных растительных установок, которые в той или иной мере устраняют указанные недостатки кюветного способа. Применяют выращивание биомассы микромицетов на специальных лотках, установленных на движущемся транспортере, причем каждый лоток имеет специальный воздуховод и ворошитель. При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В условиях лаборатории в колбы,( 50-250мл) наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру (из ампул ), затем ее помещают на сутки в термостат с определенной температурой, где она растет и размножается. Аэробные продуценты выращивают в специальных колбах на качалках в термокамере. Вот этот пример является периодическим глубинным культивированием, т.е. рост продуцента осуществляется в закрытой системе (обмен газами, теплом), но питательная среда и посевной материал не вводятся в процессе роста продуцента. При периодическом культивировании выделяют несколько фаз в развитии культуры. Управляемый процесс твердофазного поверхностного культивирования применяется при производстве энзиматических лекарственных препаратов. Рассмотрим производство амилолитических ферментов. В качестве питательной среды используют пшеничные отруби. Стерилизованную питательную среду после засева соответствующего штамма микромицета распределяют по кюветам и транспортируют в растильные камеры, где поддерживается определенная температура и влажность воздуха, а также обеспечивается вентиляция вдоль поверхности субстрата с целью аэрации. Для Aspergillus awamori как продуцента амилаз различают 3 стадии выращивания культуры: 1. Рост до начала прорастания конидий (t - 32º - 38ºС, 100% влажность воздуха); 2. Стадия интенсивного прироста биомассы при t 27ºС; 3. На третьей стадии прекращают подачу в камеру кондиционированного воздуха. Общая продолжительность процесса 42 часа. 33 Существенным недостатком этого метода является наличие больших производственных площадей, трудность автоматизации технологического процесса. В настоящее время разработаны типы механизированных растительных установок, которые в той или иной мере устраняют указанные недостатки кюветного способа. Применяют выращивание биомассы микромицетов на специальных лотках, установленных на движущемся транспортере, причем каждый лоток имеет специальный воздуховод и ворошитель. При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В условиях лаборатории в колбы,( 50-250мл) наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру (из ампул ), затем ее помещают на сутки в термостат с определенной температурой, где она растет и размножается. Аэробные продуценты выращивают в специальных колбах на качалках в термокамере. Вот этот пример является периодическим глубинным культивированием, т.е. рост продуцента осуществляется в закрытой системе (обмен газами, теплом), но питательная среда и посевной материал не вводятся в процессе роста продуцента. При периодическом культивировании выделяют несколько фаз в развитии культуры. 1. Латентная фаза. Культура микроорганизмов осваивает питательную среду, заметного увеличения числа клеток не происходит. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, необходимые для использования новых субстратов, активируется биосинтез белка.2.Фаза ускорения роста культуры отличается тем,что митотическая активность клеток продуцента возрастает и плотность клеток в реакторе возрастает. 3. Фаза экспоненциального роста характеризуется быстрым накоплением биомассы и продуктов метаболизма. При этом запас питательных веществ в среде в оптимальной концентрации, увеличение числа клеток пропорционально времени, т.е. линейный рост культуры. 4. Фаза замедления роста – это непродолжительный период, в течение которого скорость роста культуры снижается, что связано с накоплением токсических продуктов метаболизма и расходованием питательных веществ среды. 5. Стационарная фаза – это скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток. 6. Фаза отмирания культуры – характеризуется полным истощением субстрата, накоплением веществ, ингибирующих рост, скорость прироста биомассы равно нулю. При производстве лекарственных препаратов важную роль играет любая фаза. Так, при производстве первичных метаболитов важно сокращение до минимума латентной фазы и увеличение экспоненциальной фазы. Продолжительность латентной фазы зависит от состава питательной среды, возраста и массы инокулята. Перенос клеток из одной среды в другую, резкое 34 изменение условий при масштабировании может оказывать на продуцент разностороннее воздействие. Системы контроля и регуляции ферментативной активности включают и адаптационные механизм, т.е., сталкиваясь с новыми питательными веществами, клетки начинают усваивать их только после синтеза ферментов. Первичные метаболиты синтезируются в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, ферменты, витамины), в стационарной фазе и фазе отмирания - вторичные метаболиты ( антибиотики, красящие вещества). |