Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
МИНОБРНАУКИ РОССИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ―ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ‖ БИОТЕХНОЛОГИЯ (Часть 1) Микробная биотехнология Химическая энзимология Учебное пособие Составители: Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, А.С. Беленова С.Н. Суслина Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2011 2 Утверждено научно-методическим советом фармацевтического факультета 30 мая 2011 г., протокол 3 Рецензент д-р биол. наук, доцент М.Ю. Грабович В данном учебном пособии излагаются основные этапы становления и развития фармацевтической биотехнологии, методы хранения продуцентов лекарственных препаратов и БАД на фармацевтических предприятиях, основные принципы технологии антибиотиков. Кроме того, рассмотрены вопросы основных достижений микробной биотехнологии и Инженерной энзимологии. В конце каждой главы и некоторых наиболее сложных параграфов предложены вопросы для обсуждения, а также тесты для контроля усвоения учебного материала. Учебное пособие подготовлено на кафедре фармацевтической химии и фармацевтической технологии фармацевтического факультета Воронежского государственного университета. Рекомендовано для студентов 6 курса заочной формы обучения по специальности «Фармация». 3 СОДЕРЖАНИЕ 1. Биотехнология. Определение. История развития. Основные разделы биотехнологии 4 Вопросы для самоконтроля 4 2. Общая характеристика продуцентов лекарственных препаратов и биологически активных веществ 18 Вопросы для самоконтроля 28 3. Слагаемые биотехнологического процесса производства лекарственных средств. Методы культивирования лекарственных препаратов и биологически активных добавок 28 Вопросы для самоконтроля 36 4. Получение посевного материала, выделение, концентрирование, очистка, стандартизация, сушка и контроль фармацевтической продукции 37 Вопросы для самоконтроля 49 5. Антибиотики. Классификация. Получение антибиотиков. Биологические методы анализа антибиотиков 49 Вопросы для самоконтроля 67 6. Инженерная энзимология. Общая характеристика. Иммобилизованные ферменты 68 Вопросы для самоконтроля 71 7. Применение гетерогенных биокатализаторов в промышленной технологии 72 Вопросы для самоконтроля 77 Тестовые задания 77 Контрольно-измерительные материалы 83 Список литературы 85 4 1. Биотехнология. Определение. История развития. Основные разделы биотехнологии. В середине 60-х годов в литературе широко обсуждалась проблема возникновения «новой биологии», которая представляла собой развитие прикладных исследований, способствовавших коренному улучшению технологии получения химических и фармацевтических веществ. Это стало реальностью благодаря открытиям в биохимии, генетике, молекулярной биологии и химической технологии, и основывалось на расшифровке первичной структуры ферментов, их использовании в иммобилизованной форме в качестве биокатализаторов, открытии способов модификации ДНК, изучении плазмид и ферментов рестрикции. Таким образом, в середине 70-х годов появился термин «биотехнология», который сразу же заполнил страницы академических и популярных изданий. Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для социально- экономического прогресса общества. В биотехнологических производствах используются микроорганизмы, полученные путем индуцированного мутагенеза для получения белковых препаратов, аминокислот, вакцин, моноклональных антител. Применение новых подходов в производстве фармацевтической продукции позволило значительно удешевить себестоимость медицинских препаратов, получить новые уникальные лекарственные средства и одновременно разрешило проблемы утилизации отходов пищевой, деревообрабатывающей и нефтехимической промышленности. В настоящее время более 50 лекарственных веществ – это объект биотехнологических разработок: тромболитические агенты, дисмутазы, предупреждающие клеточные повреждения, эритропоэтин, стимулирующий эритропоэз, эпидермальный ростовой фактор, применяемый для заживления ран, моноклональные антитела для трансплантации костного мозга, лечения сепсиса и ряда других патологических состояний Важнейшим достижением биотехнологии является применение в клинической практике фармацевтических препаратов, полученных с помощью генетической инженерии: гормона роста человека (2 варианта), α- интерферона, активатора тканевого плазминогена для лечения тромбозов коронарных сосудов, вакцины против гепатита Б, фактора VIII для лечения гемофилии, мышиных моноклональных антител для предупреждения отторжения почечных трансплантантов. По оценкам экспертов в ближайшие годы биотехнология обеспечит прирост сельскохозяйственной продукции на 15-20%. Биосистемы для получения энергии смогут обеспечить 10-15% необходимого производства энергии в таких странах, как Китай, США, Канада, Индия, Филиппины. Термин биотехнология впервые был применен в 1917 г инженером 5 Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению К.Эреки биотехнология – это все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты. Однако это довольно точное определение не получило широкого распространения. В литературе нет единого мнения относительно определения биотехнологии как науки. М.Е. Беккер (1979) в книге «Биотехнология микробного синтеза» определяет биотехнологию как раздел науки о получении продуктов биосинтеза. По мнению А. Хастинга (1980) «Биотехнология – это промышленное получение продуктов (пива, уксуса, сыра) с использованием биохимических процессов. В 1980 году Европейская федерация по биотехнологии дала следующее определение. Биотехнология – это приложение биологических систем или процессов к промышленности. Эти определения в основном верные, но круг наук, практические результаты которых воплощаются в биотехнологии значительно шире. В 1983 году на конгрессе социалистических стран по биотехнологии в Братиславе было принято следующее определение: «биотехнология – это наука, разрабатывающая научные основы крупнотоннажной реализации процессов получения с помощью биокатализаторов, различных веществ и средств защиты окружающей среды». Академик Баев А.А. (1984) определяет биотехнологию как науку о применении биологических процессов и систем в производстве. Академик Ю.А. Овчинников считает, что биотехнология – это комплексная, многопрофильная область научно-технического прогресса, включающая микробиологический синтез в его широком понимании, генетическую и клеточную инженерию, инженерную энзимологию. Анализ существующих определений позволяет сделать заключение, что определение, данное в конце 70-ых годов, в основном, верно. Термин биотехнология имеет два значения: с одной стороны – это наука о применении биотехнологических процессов в производстве, с другой – это комплексное научно-техническое направление, изучающее эти процессы. Человечество использовало биотехнологические приемы многие тысячи лет (хлебопечение, виноделие, сыроварение, силосование кормов). Люди пользовались одноклеточными организмами давно, даже не подозревая об их существовании (за 6 тыс. лет до н.э.). Биотехнология возникла в процессе развития технологической микробиологии на базе традиционных микробиологических производств. Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере формирования и развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический. В эмпирическом периоде развития биотехнологии были распространены 6 способы получения квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, мыла из жиров, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений. Искусство ферментации, химическое превращения органических соединений с помощью ферментов, известно очень давно. Способность дрожжей вырабатывать спирт в виде пива использовалась шумерами и вавилонянами еще до шестого тысячелетия до н.э. Около 4000 г. до н. э. египтяне обнаружили, что пивные дрожжи благодаря образуемой ими двуокиси углерода, разрыхляют тесто при выпечке хлеба. К XIV веку во многих странах мира уже широко применяли перегонку спирта из сброженного зерна. К другим процессам ферментации, уходящим корнями в древние времена, относится культивирование уксуснокислых бактерий для получения уксуса, молочнокислых бактерий для сохранения молока, различных бактерий и плесеней для производства сыра. Таким образом, при помощи микроорганизмов получали пищевые продукты и напитки на протяжении более чем 8 тысяч лет, до того как об их существовании стало известно в XVII веке. Датчанин Антон ван Левенгук, исследуя с помощью простых линз воду, различные пищевые остатки, обнаружил в них крошечные движущиеся организмы, которые он назвал «анималькули». Этиологический, период охватывает вторую половину XIX века и связан с выдающимися исследованиями Л. Пастера (1822-1895 гг.), основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической). Л. Пастер открыл микробную природу брожений, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии, предложил метод стерилизации. На основе его учений Э. Бюхнер в 1887 г. открыл бесклеточный метаболизм. В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в 1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д.И. Ивановским (1864-1920). Последовавшие за этим открытие других вирусов обеспечили становление новой научной дисциплины – вирусологии. В 1928 г. А. Флеминг заметил, что плесневый гриб Penicillum notatum, случайно попавший в культуральные чашки, убил культуру бактерий Staphyllococcus aureus. Выделив бесклеточную жидкость из культуры, он обнаружил, что она может подавлять развитие многих бактерий. Флеминг назвал активный компонент жидкости пенициллином. В 1937 г. М. Велиш описал первый антибиотик, выделенный из стрептомицетов – актиномицетин. Работы по поиску новых антибиотических веществ, эффективных при лечении бактериальных, вирусных и раковых заболеваний, протозойных и паразитических болезний, активно развивались. В 1933 году А. Клюйвер и Л. Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов», в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. С этого 7 времени начинается третий период в развитии биотехнологии – биотехнический, связанный с внедрением в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечившего проведение процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков. Особую роль в формировании биотехнологии в данный период имели исследования Э. Мишера (1869 г.), открывшего нуклеиновые кислоты, Г. Хаберланда (1902 г.), впервые продемонстрировавщего возможность длительного культивирования различных растительных тканей на питательной среде, Г.А. Надсона и Г.С. Филиппова (1925 г.), разработавших основы получения мутантов дрожжевых клеток с помощью ионизирующей радиации. Примерно за 40 лет третьего периода развития биотехнологии были разрешены задачи по конструированию биореакторов, стерилизационного оборудования, систем концентрирования и очистки фармацевтической продукции, полученной с помощью нетрадиционных технологий. Четвертый период развития биотехнологии – генотехнический – начался в 1972 г., когда П. Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Особое значение для биотехнологии в это время имели исследования в области молекулярной биологии, изучение структуры и функций нуклеиновых кислот и белков, выделение и изучение механизма действия ферментов, осуществляющих гидролиз и синтез нуклеиновых кислот in vivo. К основным достижениям, которые определили развитие генетической инженерии можно отнести следующие: 1. Доказательства ДНК как носителя генетической информации О. Эйвери 1944 г. и открытия в 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком структуры ДНК. 2. Экспериментальное подтверждение универсальности генетического кода. 3. Интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали бактерии Esherichia coli, а также вирусы и плазмидные ДНК. 4. Разработка методов выделения и очистки неповрежденных ДНК вирусов и плазмид, а также методов введения в клетки реципиента рекомбинантных ДНК, конструируемых in vitro, обеспечивающих репликацию и экспрессию кодируемых ими генов. Для генотехнического периода характерны: 1. Использование генетической и клеточной инженерии для получения новых продуцентов; 2. Получение моноклональных антител, гибридов и изолированных протопластов; трансплантация эмбрионов; 3. Разработка и внедрение экологически чистых и безотходных технологий; 4. Автоматизация и компьютеризация промышленного производства биотехнологической продукции. 8 Биотехнология открыла перспективы создания принципиально новых продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. В настоящее время появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Развитие биотехнологии революционизировало биологическую науку и дало мощный толчок созданию новых и совершенствованию существующих технологических процессов получения биологически активных веществ и лекарственных препаратов путем селекции высокопродуктивных штаммов, а также разработки наиболее эффективных способов выделения, очистки и стабилизации фармацевтической продукции. Современная биотехнология имеет 3 раздела: микробная биотехнология, генетическая и клеточная инженерия, инженерная энзимология. Микробная биотехнология – это раздел биотехнологии, изучающий промышленное получение веществ с помощью микроорганизмов. Развитие микробной биотехнологии началось ранее, чем других разделов (генетической и клеточной инженерии и инженерной энзимологии). Этому способствовало в течение тысячелетий применение метода микробиологической ферментации для получения пищевых продуктов (уксуса, хлеба, сыра). Первые микробиологические производства появились в начале XX века – это производство органических растворителей (метанола, этанола, бутанола и изопропанола). Важным этапом было широкое промышленное производство антибиотиков после Второй мировой войны. Период с 1940 по 1960 год XX в. называют эрой антибиотиков или фармацевтическим периодом развития биотехнологии. В 60-70-е годы развивается «метаболическая инженерия» - получение с помощью микроорганизмов аминокислот, бактериальных полисахаридов, ферментов, белка, одноклеточных. Промышленный биосинтетический процесс, в котором для производства коммерческой продукции используются микроорганизмы, состоит из 3 этапов: 1. Исходная обработка сырья, чтобы его можно было использовать в качестве питательных веществ для микроорганизмов-продуцентов. 2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизмов в биореакторе (более 100 л) с последующим образованием нужного метаболита (антибиотиков, ферментов, гормонов). 3. Конечная обработка: очистка продукта от компонентов культуральной жидкости или от клеточной массы. Все препараты, получаемые в микробиологическом производстве, делятся на 3 основные группы: 1. Биопрепараты, имеющие в товарном продукте в качестве основного активного компонента жизнеспособные микроорганизмы (средства защиты 9 растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов). 2. Биопрепараты, в состав которых входит инактивированная биомасса (кормовые дрожжи, грибной мицелий). 3. Биопрепараты, получаемые на основе очистки продуктов метаболизма микроорганизмов (витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики, полисахариды). Продукты биотехнологической промышленности можно разделить на крупнотоннажные (этанол, дрожжи, органические кислоты) и малотоннажные медикаменты (аминокислоты, гормоны и другие продукты микробного синтеза). Получение белковых веществ не является единственным направлением крупнотоннажной отрасли биотехнологии. Очень велика роль производства аминокислот кормового, пищевого и медицинского назначения, различного ряда ферментных препаратов для медицины и ветеринарии, биологических удобрений, средств защиты растений, витаминов. Микробная биотехнология связана с геологической микробиологией. В этой связи возникла новая область биотехнологии – биогеотехнология. Биогеотехнология – это приложение биотехнологических приемов и методов к добыче, обогащению и переработке руд, отделению и концентрированию металлов из сточных вод как вторичного сырья, экстракции остаточных порций нефти из иссекающих месторождений. Биогеотехнология основана на применении смешанных культур микроорганизмов (ассоциаций). Методы биогеотехнологии используются для извлечения широкого круга ценных металлов: Cu, U, Mn, Au, Ag, Pt, Zn, Ni, Sn, Cd и др. Биотехнология получения металлов основана на способности некоторых микроорганизмов переводить металлы в растворимые соединения (выщелачивание металлов из руд). Так, Thiobacillus ferrooxidans выщелачивает железо, цинк, медь и другие металлы с помощью окисления серной кислоты, которую образуют эти организмы из сульфида. Chromobacterium способна растворять золото при обработке отходов золотодобывающих преприятий. Получены штаммы Pseudomonas для удаления серы из угля. Таким путем может быть решена важнейшая экологическая проблема: при сгорании уголь очень сильно загрязняет окружающую среду серой. Для извлечения металлов из сточных вод перспективно использовать штаммы Citobacter, способные накапливать уран, медь, кобальт. Бактерии рода Nocardia используют для эмульгирования и сорбции углеводородов нефти из водной среды. Они способны очищать источники воды от примесей нефти. Таким образом, мы видим, что микробная биотехнология наряду с решением чисто производственных задач включается в решение и экологических проблем. Именно с ней связаны надежды, что удастся создать экологически чистые и экономически высокоэффективные фармацевтические производства, которые придут в XXI веке на смену нынешним. 10 Генетическая инженерия изучает способы конструирования in vitro (в пробирке) функционально активных генетических структур. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой с целью создания нового продукта или получения уже известного вещества в промышленных масштабах. С развитием генетической инженерии появилась возможность не просто отбирать высокопродуктивные штаммы, но и использовать микроорганизмы и эукариотические клетки как биологические фабрики для производства ряда низкомолекулярных веществ и макромолекул, которые в естественных условиях (в клетке) синтезируются в минимальных количествах (инсулин, интерферон, гормоны роста, вирусные антигены и ряд других белков). Живые организмы становятся естественными биореакторами, продуцирующми новые или измененные генные продукты, которые никогда не могли бы быть созданы методами мутагенеза и селекции. Поэтому биотехнология способствует развитию принципиально новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. В нашей литературе употребляют как синонимы два термина: «генетическая инженерия» и «генная инженерия». Генная инженерия короче, произносится легче, включает только манипуляции генов. Генетическая инженерия точнее выражает суть дела, и сюда можно включить все виды работ, связанных с изменением генетических программ. Датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда была создана первая рекомбинантная ДНК. Генетическая инженерия связана с молекулярной генетикой, но становление ее зависело от химической энзимологии и химии нуклеиновых кислот. В нашей стране исследователи включились в разработку генноинженерных методов в 1972 году, с 1970 года в нашей стране ведутся исследования по селекции культур для промышленных целей. Различают три уровня генетической инженерии: 1. Генный – прямое манипулирование рекомбинантными ДНК; 2. Хромосомный – манипуляция с большими группами генов или хромосомами; 3. Геномный – перенос всего или большей части генетического материала из одной клетки в другую. Современная генетическая инженерия – это первый уровень, т.е. технология рекомбинантных ДНК. Геномная инженерия соответствует по существу клеточной инженерии. Работы в области генетической инженерии включают 4 основных этапа: 1. Получение гена; 2; Встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3. Введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент; 4. Идентификация клеток, которые приобрели желаемый ген. Инструментом молекулярного манипулирования являются два типа ферментов: Рестриктазы – это эндонуклеазы, разрывающие связи в определенных участках ДНК; Лигазы – сшивающие фрагменты гена. На стыке технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии возникла новая область – молекулярная биотехнология. Фрагментами этой дисциплины являются промышленная микробиология, молекулярная 11 биология, генетика бактерий, энзимология, химия нуклеиновых кислот. Конечной целью любого биотехнологического проекта является создание конечного продукта. Поэтому молекулярная биотехнология связана с экономикой. В период 1980-1983 гг. в США было создано около 200 биотехнологических компаний, причем вице-президентами их часто были ученые, открывшие метод клонирования гена. Сегодня в США работают более 1500 биотехнологических фирм, а во всем мире их более 3000. Большой вклад в развитие молекулярной биотехнологии внесли крупные химические и биотехнологические компании. Молекулярная медицина выявляет предрасположенность человека к различным болезням, и возникла она благодаря молекулярной биотехнологии. Отличительная черта молекулярной медицины – лечение заболеваний (как наследственной, так и ненаследственной природы) проводится на генном уровне. В качестве лекарственного препарата выступают гены (точнее специальные генетические конструкции). Генная терапия не только устраняет определенные симптомы заболевания, а корректирует функции клеток и организма в целом. Ее терапевтический эффект может достигаться различными путями: замена «больного» гена на «здоровый», направленная коррекция фигуры и, соответственно, функции «больного» гена, частичное или полное подавление «больного» гена. И, наконец, еще один важный принцип молекулярной медицины: любое медикаментозное лечение должно подбираться строго индивидуально, учитывая особенности генома больного. Этим занимается недавно возникшая наука – фармакогенетика. Уже сегодня практическое применение молекулярной медицины весьма разнообразно. Это – и молекулярная диагностика наследственных заболеваний на любой стадии развития организма, в том числе и до рождения (пренатальная диагностика), и определение генов предрасположенности к некоторым распространенным болезням, и геномная «дактилоскопия» – точная идентификация личности на основе особенностей структуры его генома (именно этот метод был с успехом применен при генетическом анализе останков царской семьи). В геноме человека насчитывается 35-50 тысяч различных генов, изменения в некоторых из них приводят к нескольким тысячам наследственных болезней. Гены практически всех наиболее частых (около 320) и сравнительно редких (около 170) наследственных болезней уже известны. Методы их обнаружения достаточно просты и универсальны и поэтому широко применяются в медицине. Сейчас у нас в стране можно определить около 40 наиболее тяжелых наследственных болезней. Молекулярная диагностика генов наследственных болезней проводится в НИИ акушерства и гинекологии в Санкт-Петербурге, в Научном центре медецинской генетики и Институте неврологии РАМН в Москве, в Институте биохимии и генетики научного центра РАН в Уфе, в Институте медицинской генетики в Томске и в Медико-генетическом центре 12 в Новосибирске. Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному заболеванию. Гены предрасположенности – объект исследования многих научных групп по всей России. Так, в Санкт-Петербурге на кафедре медицинской генетики Педиатрической академии активно изучаются гены предрасположенности к тромбофлебии, варикозному расширению вен и ряду других заболеваний. В настоящее время в мире около 400 проектов по генной терапии находятся на различных стадиях клинических испытаний: 261 из них проходит первую стадию (оценка токсичности), 133 – вторую (испытание на небольшой группе тяжелобольных пациентов) и только 3 проекта (два по лечению рака мозга и один по гемофилии) – на заключительной третьей стадии (масштабные клинические испытания). Пока генная терапия применяется в основном в онкологии (более 60% проектов). Примерно по 15% приходится на генную терапию инфекционных (СПИД, гепатит B, туберкулез) и моно генных заболеваний (муковисцидоз, семейная гиперхолестеринемия, мукополисахаридозы, гемофилия А и др.). Методы генной терапии позволяют лечить различные генетические патологии в период внутриутробного развития. Введенный ген или генная конструкция попадает во множество интенсивно делящихся клеток, предотвращая начало развития заболевания. После такой терапии нет необходимости искусственного прерывания беременности – ребенок рождается здоровым. Но, тем не менее, вопрос о ее целесообразности поднимается все чаще – теоретически существует опасность внедрения искусственных генных конструкций в геном половых клеток, что может привести к «засорению» генофонда. Генная терапия успешно применяется для лечения не только наследственных, но и значительно более распространенных мультифакториальных болезней (диабет, остеопороз, ревматоидный артрит, различные опухоли). Для лечения таких заболеваний применяется не одна, а сразу много генетических конструкций, исправляющих дефекты различных стадий течения патологического процесса. Научные работы в этой области ведутся и в России. В институте акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта РАМН разрабатываются новые подходы к генной терапии таких тяжелых наследственных заболеваний, как мышечная дистрофия Дюшенна и муковисцидоз. Работы по генной терапии также проводятся в научных учреждениях Москвы (Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН, Институт молекулярной генетики РАН, Институт медицинской химии РАМН, Научный центр медицинской генетики РАМН) и Новосибирска. Молекулярная геномика уже применяется в Европе и Соединенных Штатах для решения разнообразных задач медицины и медицинской генетики. Например, в Великобритании созданы информационные центры, и 13 каждый, позвонивший туда, может получить консультацию по любым вопросам, касающимся своей наследственности и генетической предрасположенности к различным заболеваниям. Во Франции создана и используется на практике компьютерная экспертная система Сезам (SESAM – Systeme Expert Specialisee aux Analyses Medicales) для определения склонности человека к различным заболеваниям. Она включает собственно экспертную систему оценки риска возникновения заболевания, основанную на многочисленных лабораторных (иммунологических, биохимических, серологических и генетических) тестах (более 80), программу для обучения врачей основам молекулярной медицины, медицинское консультирование по результатам лабораторных тестов и популярный справочник для населения. Клеточная инженерия – это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. Данный раздел биотехнологии начал свое развитие в 60-70-е годы XX в., хотя методы культивирования клеток были предложены в конце прошлого века. Новый этап развития биотехнологии связан в первую очередь с использованием растительных клеток. Клеточная инженерия основана на способности растений к неограниченному вегетативному размножению, т. е. к регенерации полноценного растения из черенка, а в условиях биотехнологических систем – из небольшой группы клеток или из одной клетки. При культивировании в питательных средах растительные клетки способны в одних условиях неограниченно наращивать биомассу, в других дифференцироваться, образуя вегетативные органы, формируя в пробирке миниатюрные растения. Таким образом, в неполевых, контролируемых условиях можно размножать наиболее ценные сорта растений или получать в контролируемых условиях фармацевтические препараты (убихинон-10-табак, ятрорризин-барбарис, шиконин). Благодаря биотехнологии традиционные методы гибридизации растений расширились и стали проводиться на клеточном уровне. С помощью новых методов клеточной инженерии теперь возможно слияние друг с другом клеток различных по систематическому положению растений, расширились границы спектра скрещиваемости. Этапным периодом для развития клеточной инженерии можно считать разработку способов, получение изолированных протопластов растений, а также открытие гибридизации соматических клеток (искусственное объединение целых клеток с образованием гибридного генома). Реконструкция гена связана с созданием жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, хромосом). Это служит для улучшения клеток продуцентов в культуре. Гибриды, полученные при слиянии протопластов, имеют важные отличия от половых гибридов, поскольку несут цитоплазму обоих родителей. Возможно создание гибридов, наследующих ядерные гены одного из родителей наряду с цитоплазматическими генами обоих родителей. Особый интерес представляют гибриды растений, несущие цитоплазматические гены устойчивости к различным патогенам и стрессорным факторам от 14 дикорастущих видов или цитоплазматические гены мужской стерильности. Слияние протопластов используют также для получения гибридов с ценными в хозяйственном отношении свойствами между отдаленными видами, которые плохо или вообще не скрещиваются обычным путем. Удалось, например, «ресинтезировать» рапс, являющийся естественным амфидиплоидом между турнепсом и капустой, получить соматический гибрид картофеля с томатами и т.д. При слиянии протопластов создают и новые клеточные линии-продуценты биологически активных веществ. Изменять свойства клеток можно, вводя клеточные органеллы (ядра, хлоропласты), изолированные из одних клеток, в протопласты других клеток. Так, одним из путей активизации фотосинтеза растительной клетки может служить введение в нее высокоэффективных хлоропластов. Искусственные ассоциации растительных клеток с микроорганизмами используют для моделирования на клеточном уровне природных симбиотических отношений, играющих важную роль в обеспечении растений азотным питанием в природных экосистемах. Рассматривается возможность придания растениям способности к фиксации молекулярного азота при введении в них целых клеток азотфиксирующих микроорганизмов. Реконструкцию клеток проводят также при слиянии клеточных фрагментов, безъядерных кариопластов с ядром, содержащим лишь часть генома интактной. В результате получают клетки с различными свойствами, например, цибриды, или клетки с ядром и цитоплазмой от разных родителей. Такие конструкции используют для изучения влияния цитоплазмы в регуляции активности ядра. Выращиваемые на искусственных питательных средах клетки и ткани растений составляют основу разнообразных технологий в сельском хозяйстве. Одни из них направлены на получение идентичных исходной форме растений и клональное микроразмножение на основе меристемных культур, создание искусственных семян, криосохранение генофонда при глубоком замораживании меристем и клеток пыльцы. Клеточные технологии при создании растений, генетически отличных от исходных, путем или облегчения и ускорения традиционного селекционного процесса. В первом случае применяют искусственное оплодотворение, культуру незрелых гибридных семяпочек и зародышей, регенерацию растений из тканей летальных гибридов, гаплоидные растения, полученные при культивировании пыльников или микроспор, во втором - формы растений создаются на основе мутантов, образующихся in vitro, и трансгенных растений. Таким путем получены растения, устойчивые к вирусам, гербицидам, способные синтезировать токсины, патогенные для насекомых- вредителей, а также растения с чужеродными генами, контролирующими синтез белков, определяющих морозоустойчивость и белков с улучшенным аминокислотным составом, растения с измененным балансом фитогормонов и др. Важную роль в животноводстве сыграла разработка методов длительного хранения спермы в замороженном состоянии и искусственного 15 осеменения. Реально же развернулись исследования по клеточной инженерии на млекопитающих только с освоением техники оплодотворения in vitro, обеспечившей получение зародышей на ранних стадиях развития. Генетическое улучшение животных связано с разработкой технологии трансплантации эмбрионов и методов микроманипуляций с ними (получение однояйцевых близнецов, межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных, клонирование животных при пересадке ядер эмбриональных клеток в энуклеированные, т.е. с удаленным ядром яйцеклетки). В 1996 г. шотландским ученым из Эдинбурга впервые удалось получить овцу из энуклеированной яйцеклетки, в которую было пересажено ядро соматической клетки (вымени) взрослого животного. Эта работа открывает широкие перспективы в области клонирования животных и принципиальную возможность клонирования в будущем и человека. В этой же лаборатории было получено еще пять клонированных ягнят, в геном одного из которых был встроен ген белка человека. Клеточная инженерия позволяет конструировать клетки нового типа с помощью мутационного процесса гибридизации, и более того, комбинировать отдельные фрагменты разных клеток, клетки различных видов, относящиеся не только к разным родам, семействам, но и царствам. Это облегчает решение разных теоретических проблем и имеет практическое значение. Клеточная инженерия широко используется в селекции растений. Выведены гибриды томата и картофеля, яблони и вишни. Регенерированные из таких клеток растения с измененной наследственностью позволяют синтезировать новые формы, сорта, обладающие полезными свойствами и устойчивые неблагоприятным условиям и болезням. Этот метод широко используется для «спасения» ценных сортов, пораженных вирусными болезнями. Этим путем созданы межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом и других растений. Приведем наиболее интересные гибриды, полученные в результате слияния клеток. В США получен гибридный сорт помидоров, устойчивых к вирусам (PRLV и PYV) в результате слияния протопластов дикого вида Solinum brevidens и коммерческого Solinum tuberosum. Инженерная энзимология объединяет целый ряд областей современного естествознания: химическую энзимологию, биохимию, химическую технологию. Инженерная энзимология занимается созданием биотехнологических процессов, в которых используется каталитическое действие ферментов, выделенных из биосистем. Промышленное применение ферментов, синтезированных микроорганизмами, было начато в 90-е годы XIX века. Высокая специфичность ферментативного катализа обеспечивает больший выход целевого продукта, заметно удешевляет технологические процессы, а также позволяет перейти на практически безотходные технологии, не загрязняющие окружающую среду. Эффективность ферментативных процессов, используемых в различных областях 16 человеческой деятельности (медицина, пищевая промышленность, энергетика, микроэлектроника) удалось увеличить с помощью иммобилизованных ферментов, связанных с нерастворимыми носителями. Препаративное получение ферментов в промышленных масштабах позволит существенным образом изменить технологические процессы получения лекарств, методы анализа, а также внедрить в промышленность принципиально новые технологии. В отличие от многих технологических процессов в химической технологии, требующих высоких давлений и температур, реакции, катализируемые ферментами, происходят при температурах, не превышающих 60-70ºС, нормальном атмосферном давлении и pH 4,5-9,0. Ферменты субстратно специфичны и это создает возможность осуществлять необходимые химические преобразования одного вещества, не затрагивая другие составные части обрабатываемого материала. Поэтому при биотехнологическом производстве фармацевтической продукции не возникает побочных соединений и применение ферментов лежит в основе экологически чистых промышленных технологий. В настоящее время описано более 3000 ферментов. Около пятидесяти из них будут иметь в ближайшее время прикладное значение. В современных технологических процессах наибольшее значение имеют гидролитические ферменты. Они осуществляют ферментативные реакции без кофакторов и коферментов. Во многих производствах гидролазы заменили процесс кислотного гидролиза на ферментативный, продукты которого содержат минимальное количество посторонних веществ и не требуют специальных методов очистки. К этому ряду ферментов относятся амилазы и глюкоамилазы, целлюлазы, β-галактозидаза, расщепляющая лактозу на глюкозу и галактозу. Иммобилизованные ферменты можно применять многократно в непрерывном технологическом режиме. Кроме иммобилизованных ферментов находят применение иммобилизованные микробные клетки. В жизнеспособных клетках ферменты более стабильны, чем в препаратах, они представляют собой целые полиферментные системы. Одним из ведущих направлений фармацевтической индустрии, имеющим уже сегодня реальные достижения, является ферментативный синтез аминокислот, пептидов, нуклеотидов. В этих процессах, как правило, используют доступные метаболические предшественники. Например, при синтезе L-аспарагиновой кислоты таким веществом является фумаровая кислота, реакция осуществляется аспартазой. Для получения L-лизина источником служит отход химической промышленности DL-α-амино-ε- капролактам. Переворот в технологическом процессе получения полусинтетических пенициллинов произошел после выделения и иммобилизации пенициллинамидазы. Применение этого фермента позволило сначала получить 6-аминопенициллановую кислоту. Благодаря специфичности 17 фермента обеспечивается высокая точность при гидролизе. Многие ферменты используются для анализа фармацевтических препаратов. Пируваткиназа применяется для определения глицерина и фосфосодержащих метаболитов, глутаматдекарбоксилаза – для определения глутаминовой кислоты; содержание ионов аммония определяют с помощью L-глутаматдегидрогеназы. Для диагностических целей в медицине выпускают готовые препараты. В настоящее время лидерами в области биотехнологии являются США – около 1000 биотехнологических фирм, Япония – 300, Западная Европа – 800. В этих странах биотехнология и ее развитие поставлены на уровень государственной политики, а фундаментальные исследования в этой области отнесены к разряду приоритетных и хорошо финансируются правительствами этих стран. Из научных учреждений России ведущее место в развитии биотехнологии занимает институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ). Существенный вклад в решение биотехнологических проблем внесли коллективы ВНИИ «Синтез-белок», ВНИИ биотехнологии, ВНИИА, Сибирское отделение РАН, институт молекулярной биологии РАН, институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и др. В России давно и хорошо известны предприятия, выпускающие биотехнологическую продукцию – антибиотики, ферменты, различные дрожжи и кормовые белки и т. д. Это же можно сказать и о предприятиях в странах СНГ. В Башкортостане примерами таких производств являются НПО «Иммунопрепарат» (г. Уфа), ББХК (г. Благовещенск) и др. С развитием биотехнологии связаны самые большие надежды человечества: 1. Возможность точной диагностики ряда инфекционных и генетических заболеваний. 2. Значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур путем создания новых сортов, устойчивых к вредителям, грибковым и вирусным инфекциям и вредным воздействиям среды. 3. Создание микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения, антибиотики, полимеры, ферменты, аминокислоты. 4. Создание пород сельскохозяйственных животных с улучшенными наследуемыми признаками. 5. Переработка отходов промышленности и сельского хозяйства. Но эта новая отрасль науки привела и к развитию дискуссии по следующим вопросам: 1. Не будут ли организмы, полученные методами генетической инженерии оказывать вредное воздействие на другие живые организмы или на окружающую среду? 2. Не приведет ли создание и распространение генетически модифицированных организмов к уменьшению природного генетического разнообразия? 18 3. Правомочно ли, используя генно-инженерные методы, изменять генетическую природу человека? 4. Следует ли патентовать животных, полученных генно-инженерными методами? 5. Не нанесет ли биотехнология вред традиционному сельскому хозяйству? Эти и многие другие вопросы рассматривают правительственные комиссии, активно обсуждают на конференциях и в научных публикациях ученые. |