Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с 64 предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации. Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда иона в них называют катионитами или анионитами. Антибиотик в виде отрицательно заряженного иона будет сорбироваться на катионитной смоле, положительно заряженный – на анионите. Далее его элюируют (десорбируют) и получают значительно очищенный и сконцентрированный препарат. Затем раствор препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный за- ряд. При этом примеси осядут на смоле, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку. Метод осаждения основан на том, что антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок. Полученный осадок с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают, после чего образовавшееся соединение разлагают и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают (кристаллизуют). Одной из стадий химической очистки антибиотиков является концентрирование полученных растворов путем отгонки большей части растворителя, как правило, в вакууме. Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и для увеличения его выхода. Известно, что к антибиотикам, используемым в медицинской практике, предъявляются очень высокие требования (высокая степень очистки, стерильность препарата и др.). Поэтому на указанной стадии работы, а также при химической очистке препарата необходимо соблюдать высокую степень чистоты на всех операциях. Для этого поддерживают в исключительной чистоте не только используемое оборудование, но и помещение, где про- изводят работу. Антибиотики, предназначенные для инъекций, должны быть стерильными. Поэтому получение таких препаратов, приготовление различных лекарственных форм, расфасовка и упаковка осуществляются в асептических условиях. После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить – удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени 65 термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности и не изменяющие цвета препарата. На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют различные методы обезвоживания препаратов. Широкое распространение получила лиофильная сушка антибиотиков, которая проводится при сравнительно низких температурах (-8, -12°С). Прогрессивным методом при работе с большими количествами антибиотика является высушивание с применением распылительной сушилки. Раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение нескольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют своих свойств. Сушка зернистых и пастообразных антибиотических препаратов производится в вакуум-сушильных шкафах или методом взвешенного слоя. Готовый антибиотик подвергается тщательному биологическому и фармакологическому контролю. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в соответствии с Государственной фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и другие жизненно важные функции организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на состав крови, центральную нервную систему, дыхание и т. Д.). Показатели острой токсичности – один из критериев качества антибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика, дозу, вызывающую гибель 50% подопытных животных (LD 50 ) и дозу, смертельную для всех животных (LD 100 ). Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению. Количественное определение большинства антибиотиков проводят биологическими методами, основанными на сравнительной оценке угнетения роста тест-микроорганизма. Активность устанавливают диффузионным или турбидиметричесхим методами. Государственная Фармакопея XI издания рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, сущность которого заключается в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм. Стандарты, отвечающие требованиям международных стандартов, готовят в Государственном контрольном институте медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, они выпускаются в запаянных ампулах нейтрального стекла и хранятся при температуре не выше 0°С. 66 Так как состав агаровой среды и условия выполнения биологического испытания одинаковы, величина зоны диффузии, в которой развитие тест-микроорганизма подавляется испытуемым антибиотиком, зависит только от химической природы препарата и его концентрации. Процесс инкубации осуществляется в течение 16-18 часов при 36-38°С. При определении биологической активности методом диффузии в агар необходимо, чтобы зона задержки роста была достаточного диаметра и имела четкие границы. После завершения инкубации измеряют диаметры зон задержки роста (ЗЗР) тест-микроорганизма стандартным и испытуемым растворами. Для повышения точности измерений находят среднее значение площадей зон диффузии из трех опытов. При изучении зон задержки роста и четкости краев рационально применят микрофотометры (например, марки, ИОФ-451), что позволяет получать более объективные количественные оценки результатов микробиологического анализа. Единица действия (ЕД) является величиной биологической активности антибиотиков. За ЕД принимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды. Количественное выражение 1 ЕД различно у различных антибиотиков. Например, у натриевой соли бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химически чистого вещества, а у стрептомицина, тетрациклина и его производных 1 ЕД соответствует 1 мкг химически чистого вещества. Расчет биологической активности производят по стандартной кривой, предварительно построенной на основании результатов определения пяти концентраций стандартного препарата. Степень активности антибиотика в1 мг препарата вычисляют, умножая полученную концентрации в ЕД/мл на степень разведения. Среднее значение активности, найденной биологическим методом, несколько ниже, чем рассчитанная теоретическая активность. В соответствующих фармакопейных статьях приводятся значения теоретической активности и нижний допустимый предел активности испытуемого антибиотика в ЕД/мг. В настоящее время разработаны ускоренные биологические методы определения антибиотиков в биологических жидкостях. К ускоренным микробиологическим методам относят методы, основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест- микроорганизмов. Концентрацию определяют путем сравнения изменений рН в средах испытуемых и стандартных образцов через 1,5 часа после инкубации. На этом принципе основан так называемый уреазный метод, заключающийся в наблюдении за изменением рН 67 жидкой питательной среды, содержащей 2% мочевины. Выделяющийся в процессе роста микроорганизма аммиак вызывает изменение рН среды. Ферментный метод основан на инактивации аминогликозидов в крови специфическими ферментами (аденилтрансфераза и ацетилтрансфераза), продуцируемые грамотрицательными микроорганизмами, устойчивыми к препаратам этой группы. Эти ферменты катализируют процесс аденилирования или ацетилирования аминогликозидов в присутствии 14 С-аденозинтрифосфата или 14 С- ацетилкоэнзима А. Они являются источником радиоактивности. Инактивированный антибиотик имеет положительный заряд и остаточную радиоактивность, что позволяет адсорбировать его на фосфоцеллюлозной бумаге. После адсорбции, методом подсчета радиоактивности делают заключение о концентрации антибиотика. Определение занимает 1-2 часа. Радиоиммунный метод основан на сравнительной оценке конкуренции антибиотика, меченного тритием, и испытуемого антибиотика по отношению к специфическим антителам иммунной сыворотки. Метод отличается очень высокой чувствительностью (0,003-0,01 мкг/мл), результаты получают в течение 1 - 2 часов, точность данного метода довольно высока – коэффициент вариации составляет 4 – 5%. Анализируя различные методы анализа антибиотиков можно прийти к заключению, что наиболее простыми и доступными в настоящее время являются метод диффузии в агар-агар и уреазный метод Ферментативный и радиоиммунный метод – наиболее специфичные и точные. Они не требуют предварительной обработки сыворотки крови, когда в ней присутствуют другие антибиотики. Однако применение этих методов требует соответствующих условий и оборудования для работы с радиоактивными веществами, труднодоступных реактивов и специфической иммунной сыворотки. На точность биологических методов оказывают влияние целый ряд факторов – характер питательной среды, условия инкубации, точность измерения зон угнетения роста и т.д. Вопросы для самоконтроля 1. Назовите основные группы антибиотиков, учитывая механизм их действия и спектр влияния на клетки возбудителей инфекционных болезней. 2. β-лактамы, их структура и механизм действия. 3. Напишите радикалы, входящие в состав антибиотиков цефалоспоринового ряда. 4. Методы получения антибиотиков на фармацевтических предприятиях. 5. Структура и механизм действия антибиотиков – полиенов. 68 6. Структура и механизм действия антибиотиков – депсипептидов. 7. Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза. 8. Методы культивирования продуцентов, применяемых при производстве антибиотиков. 9. Питательные среды, используемые на фармацевтических предприятиях при производстве антибиотиков. 10. Методы выделения и очистки антибиотиков, применяемых при производстве антибиотиков. 11. Методы получения 6-аминопенициллиновой кислоты, применяемые в промышленной технологии. 12. Основные способы получения 7- аминоцефалоспориновой кислоты. 13. Схема выделения антибиотика из культуральной жидкости. 14. Принципиальная схема выделения и очистки канамицина. 15. Промышленный метод получения полусинтетических антибиотиков. 16. Биологические методы анализа качества антибиотиков. 6. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ. Химическая и инженерная энзимология возникла на стыке молекулярной биологии, физической химии и энзимологии. Это наука о создании биоорганических катализаторов, в которых использованы принципы действия активных центров ферментов. Химическая энзимология изучает широкий круг вопросов, связанных с новыми аспектами функционирования ферментов как гетерогенных биокатализаторов, создаваемых для промышленного производства фармацевтических препаратов и пищевых продуктов. Ферменты традиционно и давно (еще в древности) применялись в практической деятельности как уникальные ускорители многих химических реакций. Скорость реакций, протекающих при участии ферментов, в 10 12 -10 14 раз выше, чем реакций, катализируемых катализаторами неорганической природы. Ферменты – биологические катализаторы белковой природы, которые применяются в различных отраслях народного хозяйства, в том числе при производстве лекарственных средств, а также в медицинской практике как лечебные и диагностические препараты. Всего для клинического применения разрешено свыше 40 ферментных препаратов животного, растительного и микробного происхождения. Среди основных направлений использования ферментов как терапевтических средств наибольший удельный вес занимают три области, которые и потребляют основное количество выпускаемых промышленностью препаратов: 1) заместительная терапия при недостаточной функции пищеварительных желез и ряде наследственных заболеваний; 69 2) местная (локальная, литическая) терапия для расщепления и удаления из организма некротических масс и экссудатов; 3) парентеральное применение свободных и связанных форм ферментов для лизиса тромбов в кровеносных сосудах и как противовоспалительные средства. В фармацевтической промышленности ферменты используются в качестве биокатализаторов, биодатчиков и биосенсоров и для биотрансформации. Путем микробиологического синтеза для медицинских целей получают следующие ферментные препараты: - солизим (липолитический фермент, гидролизующий жиры), применяется при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта; - амилазы (расщепляют крахмал до глюкозы), в составе лечебного препарата «Фестал» используется при недостаточной функции поджелудочной железы; - террилитин (протеолитический фермент), рекомендуется для лечения гнойных ран, ожогов, трофических язв; - стрептокииаза (фибринолитический фермент) эффективен при лечении тромбозов; - β-галактозидаза (расщепляет лактозу), применяется для лечения лактозной недостаточности. Традиционные биотехнологии, основанные на переработке тканей животных, поставляют в медицинскую практику: - трипсин, химотрипсин (протеолитические ферменты), используемые для рассасывания рубцов и спаечных процессов; - урокиназу (протеолитический фермент), предназначенный для лечения тромбозов; - пепсин (протеолитический фермент), незаменимый при расстройствах пищеварения; - бромелин, папаин, фицин, которые используются в заместительной терапии при нарушении пищеварения, а также для лечения гнойно- воспалительных процессов. При энзиматическом очищении ран сроки заживления сокращаются в 1,5-2 раза. Бромелин, папаин, фицин применяются в заместительной терапии при нарушении пищеварения, а также в акушерской практике при выявлении и предотвращении резус-конфликтных ситуаций. В традиционных технологиях ферментные препараты могут быть получены из животного, растительного сырья и микроорганизмов. Лекарственные формы на основе ферментов характеризуются большим разнообразием – это таблетки, капсулы, мази, аэрозоли. В нашей стране и за рубежом первое место по объему выпускаемых ферментных препаратов занимают протеолитические – наиболее глубоко изученные среди всех известных ферментов. Протеазы в числе первых белков были получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии. 70 Ферменты группы ацилаз используются в биотехнологическом производстве медицинских препаратов как реагенты для трансформации биологически активных веществ (например, N-ацилоаминокислот). Иммобилизацию ферментов можно определить как процесс включения молекул в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться с находящимися в ней молекулами субстрата, эффектора или ингибитора. Химический метод иммобилизации Иммобилизация ферментов путем образования ковалентной связи с носителем в настоящее время является доминирующим способом получения биокатализаторов пролонгированного действия. Первые работы в этом направлении относятся к 1949 году. Различают 2 основных метода химической иммобилизации ферментов: 1. Иммобилизация на носителе любого типа за счет образования ковалентных связей; 2. Поперечная сшивка молекул белка без носителя специальными реагентами. Методы образования ковалентной связи между носителем и белком классифицируют по типам происходящих химических реакций. Наиболее часто используются следующие виды химических реакций: реакции диазосочетания, ацилирования, окислительно-восстановительные и радикальные реакции, а также смешанные методы. Адсорбционная иммобилизация Адсорбционная иммобилизация является наиболее разработаным из всех существующих способов иммобилизации ферментов. Еще в 1916г. Дж. Нельсон и Э. Гриффин провели успешную иммобилизацию инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гидроксида алюминия. В настоящее время адсорбционная иммобилизация благодаря целому ряду преимуществ является наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментных препаратов промышленного значения. Носителей для адсорбционной иммобилизации можно разделить на два основных класса — неорганические и органические. Вкачестве неор- ганических носителей главным образом используются кремнезем, оксиды алюминия, титана и других металлов, различные природные алюмосили- каты (глины), пористое стекло, керамика, активированный уголь и др. Среди органических носителей наибольшее распространение получили различные полисахариды и полимерные ионообменные смолы, коллаген. Обычно носители применяются в виде порошков, мелких шариков и гранул. Иногда для снижения гидродинамического сопротивления носи- тели изготавливают в форме монолитов, пронизанных большим числом узких параллельных каналов, разделенных тонкими стенками. Важней- шими характеристиками носителей являются удельная поверхность, размер пор, механическая прочность и химическая стойкость. 71 Иммобилизация ферментов путем включения в гели Сущность этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных поли- мерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не покидает полимерную матрицу и не выходит в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее поли- мерными цепями. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран) Общий принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного рас- твора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Микрокапсулирование Этот способ иммобилизации разработан Т. Чангом (1964 г.). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микро- капсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких со- тен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые – десятые доли микрометра при диаметре пор порядка нескольких нанометров. Включение в волокна От микрокапсулирования этот способ иммобилизации, предложенный Д. Динелли (1972), отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы, а во втором — нити. Суть состоит в том, что эмульсию водного раствора фер- мента в органическом растворе волокнообразующего полимера продавли- вают через фильтры в жидкость (например, толуол), вызывающую коагу- ляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые по- лимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около 1 мкм. Ферментсодержащие волокна обладают высокой механической прочностью, например, из них можно изготовить ткань, которая будет обладать ферментативной актив- ностью. Для дополнительного повышения механической прочности во- локна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку. |