Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
При непрерывном культивировании процесс постоянно протекает в экспоненциальной фазе, нет смены фаз развития культуры, как при периодическом культивировании (можно сравнить с оранжереей, где вегетация и плодоношение растений идет в течение всего года). Можно сказать, что при непрерывном культивировании жизнедеятельность культуры продлевается за счет постоянной подачи питательной среды и отбора культуральной жидкости, вместе с которой из реактора удаляются и токсические метаболиты. Непрерывное культивирование может осуществляться в условиях крупнотоннажного производства в каскаде реакторов. Впервые данный метод был применен в 1915 году при производстве спирта, в 1940 году – для получения ацетона. В настоящее время в фармацевтическом производстве применяются следующие разновидности непрерывного культивирования продуцентов. Непрерывное культивирование При гомогенно проточном процессе параметры постоянны во времени во всех реакторах. Основным принципом непрерывного процесса культивирования является равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и убылью в результате разбавления свежей питательной средой, причем объем заполнения ферментера остается постоянным. При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать такую скорость притока питательной среды и вытекания культуральной жидкости из системы, чтобы предотвратить вымывание клеток из системы, т.е. концентрация клеток должна быть постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время. При многостадийном непрерывном культивировании нарушение режима Одноступенчатое (в одном реакторе) Многоступенчатое (в каскаде реакторов) Гомогенно-проточное Гетерогенно-проточное 35 одного реактора влечет за собой выход из строя всей установки. Поэтому многостадийные непрерывные процессы требуют надежной системы стерильности и контроля, сложной конструкции реакторов. Длительное протекание непрерывных процессов приводит к обрастанию труб и стенок реактора прилипающими клетками или гифами мицелия. В этом случае процессы автоселекции протекают особенно интенсивно, и возникает проблема появления рекомбинантных мутантов. При непрерывном культивировании поддержание состояния динамического равновесия в реакторе осуществляется двумя методами - хемостатным и турбидостатным. По турбидостатному принципу в системе поддерживается определенная концентрация биомассы, а по хемостатному принципу – постоянная концентрация одного из компонентов среды (углерода, кислорода, витамина и др.). Известен также метод регулирования роста культуры по значению pH (pH-стат). При турбидостатном методе регулирования контролируется концентрация суспензии выходящей жидкости, создаваемая микробными клетками. Хемостатный способ контроля осуществляется по входящему потоку. Метод хемостатного регулирования непрерывного культивирования применим ко всем типам микроорганизмов и клеткам различных тканей животных или растений, которые могут расти в гомогенной перемешиваемой культуре. Биореактор, работающий в хемостатном режиме имеет: а) устройство для вливания питательной среды; б) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости; в) систему контроля скорости протока. Регулирование хемостатным способом предполагает перемешивание. Это означает, что при добавлении малых объемов среды, время, необходимое для того, чтобы вещество гомогенно распределилось по всей культуре, должно быть минимальным. Если перемешивание будет недостаточное, то в ферментере образуются области, скорость разбавления в которых будет отличаться от средней скорости разбавления. Такие отклонения называют «эффектом аппаратуры». Продуценты фармацевтической продукции могут прилипать к поверхности ферментеров при непрерывном культивировании в течение длительного времени (месяцы), и наблюдаеся так называемый пристеночный рост, который может приводить к массивным обрастаниям поверхности ферментера. Чтобы поддержать в реакторе действительно гомогенные условия, нужно эти процессы свести к минимуму. Прилипание биомассы можно предотвратить силиконированием стенок и чисткой ферментера или применением оболочек из тефлона. Таким образом, хемостатный режим регулирования непрерывного культивирования дает возможность изменять скорость роста биомассы, не производя в окружающей среде никаких изменений, кроме увеличения или уменьшения концентрации лимитирующего фактра среды. Хемостатный режим успешно применяется при малом протоке 36 питательной среды, когда концентрация клеток изменяется незначительно. Для турбидостатного режима непрерывного культивирования характерны высокие скорости разбавления и резкое изменение концентрации биомассы. Этот режим применяется лишь при выращивании одноклеточных организмов. Турбидостатный контроль с помощью фотоэлемента оправдывает себя, если при изменении скорости разбавления концентрация биомассы меняется быстро. Если скорость изменения концентрации биомассы незначительна, то турбидостатный контроль оказывается недостаточно чувствительным, чтобы поддерживать скорость разбавления культуры на постоянном уровне. В случае длительного культивирования применение турбидостата может приводить к прилипанию организмов к поверхности фотоэлементов. В настоящее время контроль при турбидостатном регулировании осуществляется не только с помощью фотоэлемента, но и другими средствами, чувствительными либо к продуктам биосинтеза, либо к диоксиду углерода. Турбидостатный контроль можно осуществить и с помощью pH- электрода в том случае, если в культуральной жидкости образуются органические кислоты. Для турбидостатного контроля можно также измерять концентрацию растворенного О 2 с помощью специального электрода. Непрерывный процесс можно использовать в производстве лекарственной продукции только в том случае, когда культура при длительном выращивании не теряет способности к синтезу, т.е. генетически устойчива и однородна. Характеризуя непрерывное культивирование, надо отметить, что высокая продуктивность процесса может быть достигнута при большем значении D (скорости разбавления), а это может быть связано с выносом неутилизированного субстрата. Поэтому данный метод далеко не всегда можно применять, например, в производстве антибиотиков и других препаратов медицинского назначения. Для штамма Brechibacterium flavium 22 (производство лизина) экономическая эффективность при непрерывном режиме в 6 раз выше, чем при периодическом культивировании. Вопросы для самоконтроля 1. Слагаемые биотехнологического процесса производства лекарственных средств. 2. Основные этапы общей технологической схемы производства. 3. Процесс ферментации. Общая характеристика. 4. Методы культивирования. 5. Периодическое культивирование: определение, типы периодического культивирования. 37 6. Непрерывное культивирование. Характеристика, виды непрерывного культивирования. 7. Фазы развития культуры при периодическом культивировании. 8. Методы поддержания состояния динамического равновесия в реакторе при непрерывном культивировании. 4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА, ВЫДЕЛЕНИЕ, КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ, ОЧИСТКА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ, СУШКА И КОНТРОЛЬ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ Для получения посевного материала используют исходную музейную культуру продуцента, которая поступает в заводскую лабораторию из научно-исследовательского института или с посевной станции. Как правило, посевной материал, содержащий молодые, растущие клетки микроорганизмов на начальной стадии спорообразования (споры, конидии) поступает в пробирках на скошенных агаровых средах или в виде чистых культур в ампулах. Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны продуцент и его коллекционный номер, серия и дата изготовления, средняя активность серии и срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл. В зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических способностей приготовление посевного материала (до стадии производственной ферментации) проходит в несколько этапов: исходная культура скошенная агаровая среда выращивание на качалке в колбах на жидкой питательной среде (одна или две стадии) посевные аппараты (одна, несколько стадий) стадия производственной ферментации. Исходную культуру при оптимальных температурах выращивают в про- бирках на скошенной агаровой питательной среде. Для микроскопических грибов, актиномицетов продуценты культивируют до наступления оптимального спорообразования (72-120 час), для бактериальных культур фаза устанавливается экспериментально. Выращенную культуру (1-5% от объема) с поверхности скошенной ага- ровой среды стерильно смывают водой и переносят в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы выращивают на качалке (120-240 об/мин) при температуре 28-30- 50°С в течение 18-36 часов, т.е. глубинным способом, что увеличивает скорость роста культуры. Все стадии роста продуцента контролируют по морфологическим показателям микроорганизмов. При этом установлено, что наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости. 38 Готовую культуру стерильно переносят в посевной аппарат (малый инокулятор) с предварительно простерилизованной питательной средой. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования рН среды, температуры и степени аэрации. Масштабирование при получении инокулята желательно осуществлять тогда, когда рост популяции происходит с максимальной скоростью, т.е. в экспоненциальной фазе. Процесс выделения и очистки представляет собой рядпоследовательных технологических операций, количество которых возрастает с повышением желаемой чистоты конечного продукта. Культуральная жидкость весьма чувствительна к различным воз- действиям, поэтому наблюдаются потери при выделении лекарственных соединений. Она представляет собой сложную многофазную систему, содержащую от 1 до 5% и более сухого вещества, отдельные микробные клетки или мицелий, продукты биосинтеза и остатки питательной среды. Как правило, выделение конечного продукта связано с определенными трудностями и в основном зависит от предварительной очистки нативного раствора. Первой стадией подготовки кулътуральной жидкости для дальнейшей переработки является отделение взвешенной фазы или микробной массы, в состав которой входят микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности,а также остатки неиспользованной питательной среды. Седиментацию применяют в качестве метода выделения в тех случаях, когда диаметр осаждаемых частиц более 3 мкм, продукты достаточно стабильны и различные фракцииосаждаемых продуктов содержат БАВ, необходимые для производства фармацевтической продукции. Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой, добавлением веществ, образующих наполнители. Процесс коагу- ляции улучшается при использовании комбинированных методов: кислотное и тепловое, электролитное и тепловое воздействие. Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами – флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флокулы или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации. Более прогрессивным методом разделения является метод центрифугирования, в основе которого лежит разделение неоднородных систем под воздействием центробежных сил в центрифугах. Основное преимущество центрифугирования по сравнению с другими методами обработки неоднородных систем (отстаиванием и фильтрованием) заключается в увеличении производительности разделения, и производительность современных центрифуг непрерывного действия достигает сотен м 3 /ч. С помощью центрифугирования удается выделить из 39 суспензий частицы размером до сотых долей микрометра. Центрифугирование широко применяется в биотехнологических производствах лекарственной продукции, прежде всего для выделения из культуральной жидкости меристемы растений, биомассы дрожжей, бактерий, грибов, отделения различных продуктов микробиологического синтеза (антибиотиков, ферментов, витаминов и т.п.), переведенных предварительно в твердую фазу, а также для разделения эмульсий, образующихся при экстракции. В биотехнологическомпроизводстве лекарственных веществ сепараторы являются одним из самых распространенных типов центрифуг. По способу работы они делятся на три группы: 1.Сепараторы непрерывно-циклическогодействия, обеспечивающие разделение жидких смесей с непрерывным выводом из барабана текучих фракций и периодической ручной выгрузкой осадка из барабана; 2.Сепараторы непрерывно-циклического действия, обеспечивающие раз деление жидких смесей с непрерывным выводом из барабана текучих фракций и периодической выгрузкой осадка из барабана под действием центробежных сил; 3.Сепараторы непрерывного действия, обеспечивающие разделение жидких смесей с непрерывным выводом из барабана всех отсепарированных фракций. Для извлечения внутриклеточных продуктов биосинтеза широко используются методы дезинтеграции. Дезинтеграция, т.е. разрушение клеточных оболочек микроорганизмов, осуществляется несколькими способами: химическими, биологическими, физическими (механическими). Химические способы дезинтеграции основаны на деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизма. Наиболее известные химические способы: обработка клеточной суспензии непосредственно щелочью, мочевиной, глицерином, аммиаком, перекисью. Химический способ предназначен для выделения суммарных белков пищевого назначения ине нашел широкого применения в фармацевтической промышленности вследствие возникновения нежелательных эффектов. Так, при обработке суспензии клеток микроорганизма щелочью в определенных условиях образуется лизин-аланин, из-за которого снижается количество доступного лизина и питательная ценность получаемого белка. Биологические способы относятся к наиболее мягким способам раз- рушения клеточной оболочки ивыделения внутриклеточных метаболитов. В качестве примера можно привести расщепление клеточной стенки при помощи литических ферментов. Расщепление клеток под действием внутриклеточных гидролитических ферментов проводится в кислой среде при температуре 30-35°С в течение нескольких часов или суток. В результате получают смесь продуктов гидролиза - аминокислоты, пептиды, полипептиды. 40 Физические способы. Физическая (механическая) дезинтеграция - это процесс, происходящий при высоких скоростях и сопровождающийся быстрым перемешиванием разрушаемого материала в зоне действия дезинтегрирующих сил. Физическую дезинтеграцию можно проводить в непрерывном режиме с автоматизацией процесса. Наиболее известные способы разрушения биоматериала - замораживание и оттаивание, ультразвуковое воздействие, истирание клеток, экструзия. Если целевой продукт представляет собой растворимый метаболит или он синтезируется внутри клетки и не секретируется в культуральную жидкость, то прибегают к следующим методам выделения: экстракции, сорбции, хроматографии, выделению с помощью мембран. Экстракцию проводят органическими растворителями изклеток (например, антибиотика гризеофульвина ацетоном, или бензилпенициллина при рН 2,0-3,0 – бутилацетатом). Экстракция ферментов осуществляется в двухфазных системах, например, полиэтиленгликолем. Метод адсорбции применяют в микробиологических производствахв основном при получении кристаллических аминокислот, а также высокоочищенных и иммобилизованных ферментов. При выделении и им- мобилизации ферментов используют органические сорбенты (крахмал, целлюлозу, синтетические и ионообменные смолы) или неорганические (цеолиты, гидроксид алюминия, силикагели и др.). Процессы адсорбции осуществляют в аппаратах периодического или непрерывного действия с неподвижным или подвижным слоем адсорбента. Для выделения из культуральных жидкостей аминокислот применяются иониты, которые адсорбируются при прохождении через слой ионообменника, а сопутствующие примеси отводятся из колонны с отработанной культуралыюй жидкостью. После насыщения смолы аминокислотой подачу культуральной жидкости прекращают и смолу промывают водой, после чего смола готова к повторному циклу. Хроматографическое разделение БАВ используют в различных вариантах: гель-фильтрация, ионобменная хроматография, аффинная хроматография. В случае аффинной хроматографии используют высокую специфичность таких природных веществ, как ферменты, антитела и лектины. Ферменты образуют комплексы с ингибиторами, антитела - с соответствующими антигенами (иммуносорбционная хроматография), лектины - со специальными рецепторами клеточных стенок. Метод выделения различных веществ или клеток с помощью мембран все шире внедряется в биотехнологию. К мембранным методам разделения относятся диализ и электродиализ, обратный осмос, ультрафильтрация и микрофильтрация. Общность всех мембранных методов разделения заключается в том, что основным элементом их аппаратурного оформления являются мембраны. Причем они обладают рядом преимуществ: 41 - концентрирование и очистка происходят без изменения агрегатного со стояния лекарственных соединений и фазовых превращений; - фармацевтический продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям; - механическое и гидродинамическое воздействие на биологический материал незначительно; - легко обеспечивают герметичностьи асептические условия. Основные ограничения в применении мембранных методов разделения связаны с тем, что некоторые материалы, из которых изготавливаются мембраны, не выдерживают очень низких и очень высоких значений рН и высоких температур. Получаемая в конце цикла культуральная жидкость содержит от 0,1 до 5% сухих веществ. На последующих стадиях из нее извлекают полезные продукты ( антибиотики, ферменты, аминокислоты и другие вещества), которые затем превращаются в конечную товарную форму. Большинство лекарственных соединений выпускаются в сухом виде с остаточной влажностью не более 5-12%. В промышленных условиях обезвоживание культуральной жидкости или полученных из нее промежуточных более концентрированных суспензий и растворов осуществляется двумя способами: • механическим, без изменения агрегатного состояния воды (фильтрова- ние, центрифугирование). Этим способом можно удалить основную часть влаги, но затруднительно получить продукт с необходимой конечной влажностью (около 5-12%); • тепловым с изменением агрегатного состояния воды из жидкого в парообразное. К тепловому способу обезвоживания относятся выпаривание и сушка. Удаление влаги и тепловое воздействие в ходе сушки фармацевтической продукции приводит к существенным изменениям, влияющим на их качество. Наибольшие трудности возникают при необходимости сохранить такие термолабильные объекты, как живые микроорганизмы (бактериальные препараты) или ферментные препараты. Основными причинами их термолабильности являются денатурация белка и инактивация ферментов при тепловом воздействии, увеличение концентрации электролитов и токсичных веществ при удалении влаги, а также структурныеи механические повреждения в процессе сушки. По исходному агрегатному состоянию влаги различают следующие ме- тоды сушки: сушку из жидкого состояния, испарение из твердого состояния, минуя жидкую фазу - сублимацию. Сушка культуральной жидкости или биомассы осуществляется контактным, конвективным и радиационным способом. При контактной сушке тепло передается высушиваемому материалу через нагретые поверхности (плиты, вальцы), а испаряющаяся влага переходит в 42 воздух. Для сушки продуктов биологического синтеза применяются одно- и двухвальцовые шкафные сушилки. При конвективной сушке тепло, необходимое для процесса сушки, доставляетсягазообразным сушильным агентом, который играетроль те- плоносителя и среды, в которую переходит влага из материала. Этот метод широко применяется в пневматических, аэрофонтанных, распылительных сушилках и сушилках в кипящем слое. Кроме перечисленных методов возможна также сушка в электромагнитном поле высокой частоты (диэлектрический нагрев), этот метод для сушки фармацевтической продукции из-за высокойстоимости установки, значительного расхода энергии и сложности эксплуатации не применяется. Поскольку большинство продуктов биологического синтеза являются термолабильными веществами, то при их стремятся снизить температуру и время воздействия. Для этих целей используют вакуум или сушку тонкодисперсного материала. Еще более выгодные условия для сушки термолабильных веществ создаются при сублимации. Сублимационный метод основан на удалении влаги из замороженного состояния путем перехода в газообразную фазу, минуя жидкую.. Характерными особенностями сублимации являются минимальные по сравнению с другими методами сушки изменения структуры высушиваемого материала и более низкие температуры высушивания. Поэтому данный метод применяется для особо термолабильных продуктов, например живых микроорганизмов, ферментов, некоторых антибиотиков. При сублимационной сушке хорошо сохраняется структура материала, так как растворенные вещества остаются более равномерно распределенными по всему объему, а влага перемещается внутри материала в виде пара. При сушке большую часть времени материал находится при температуре 20-30°С и лишь в конце ее, когда содержание влаги незначительно, температура повышается до 30-40°С. Так как высушивание ведется при давлении воздуха 0,1-1 Па, и концентрация кислорода снижается в десятки тысяч раз по сравнению с его концентрацией в воздухе при атмосферном давлении, окислительные процессы в высушиваемом продукте снижаются. Электролиты и другие растворенные вещества в ходе сушки не концентрируются, что в сочетании с низкой температурой создает благоприятные условия для сохранения белков, сложных биологически активных веществ и живых клеток. Однако проблемы воздействия на лекарственные соединения возникают не по время сушки, а на подго- товительном этапе замораживания. Так как, причиной гибели клеток может быть чрезмерное обезвоживание в процессе сублимационной сушки, для защиты их от гибели при замораживании и последующем высушивании применяются специальные защитные среды, включающие глицерин, сахарозу, поливинилпирролидон и другие вещества, замедляющие образование внутриклеточного льда. Эти 43 вещества уменьшают концентрирование электролитов и защищают клетки от грубого необратимого обезвоживания. Полученные сухие фармацевтические продукты обычно используются в измельченном состоянии. Иногда, при распылительной сушке дополнительного измельчения высушенного продукта не требуется. В других случаях, когда готовый продукт предварительно очень быстро должен растворяться или смешиваться до гомогенного состояния, вводят операцию измельчения. Измельчение зависит от размера частиц исходного материала и соответственно делится на несколько классов: • дробление - крупное, среднее, мелкое; • помол - грубый, средний, тонкий, коллоидный. В промышленных условиях измельчение осуществляется одним из сле- дующих способов: раздавливание, раскалывание, истирание и ударом. Иногда применяют комбинации этих методов. Высушенные порошковидные препараты трудно дозировать, расфасовывать и транспортировать. Для увеличения средней плотности, уменьшения объема и снижения пылеобразования препараты гранулируют. Известны различные способы гранулирования: экструзия с последующим центробежным скатыванием, псевдоожижение и орошение жидкостью порошка с нанесением глазированной пленки на поверхность гранулята, прессование и формовкас помощью формовочных машин сухим или жидким способом. Для объемного напорного дозирования жидких сред в точных и регулируемых количествах используют насосы и дозировочные агрегаты |