Микробная биотехнология Химическая энзимология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Вопросы для самоконтроля 1. Биотехнология как наука. 2. Основные периоды развития биотехнологии. 3. Перечислите ключевые научные открытия, послужившие толчком для развития биотехнологии. 4. Основные этапы развития микробной биотехнологии 5. Генетическая и клеточная инженерия как ключевой этап развития биотехнологии 6. История формирования и развития инженерной энзимологии. 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУЦЕНТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Из громадного разнообразия (более 2 млн. видов) живых организмов нашей планеты в биотехнологии исследуются для применения в качестве продуцентов и используются непосредственно лишь сотая доля процента. Для обозначения продуцента так же, как и в других биологических дисциплинах, применяют бинарную номенклатуру, т.е. латинское название рода и вида, за которым указывают номер штамма, полученного путем селекции, например, Aspergillus awamori 16. В настоящее время в биотехнологии в качестве продуцентов используются одноклеточные и многоклеточные организмы, построенные из клеток одного типа (бактерии, грибы, водоросли), а также клетки и ткани высших растений и животных. Объектами биотехнологии являются ферменты, нуклеиновые кислоты, простагландины, лектины, нейропептиды и различные БАВ (биологически активные вещества). В промышленной биотехнологии применяют 3 вида штаммов: 1) природные штаммы, улучшенные естественным и искусственным отбором (при производстве микробной биомассы); 2) штаммы, полученные в результате индуцированного мутагенеза; 3) генно-инженерные штаммы (обладают самой высокой генетической нестабильностью). Промышленные штаммы должны удовлетворять следующим 19 требованиям: 1. Безвредность для потребителя и обслуживающего персонала. 2. Высокая скорость роста биомассы и целевого продукта (БАВ) при экономичном потреблении питательной среды. 3. Направленная биосинтетическая активность при минимальном образовании побочных продуктов. 4. Генетические однородность и стабильность в отношении к субстратам и условиям культивирования. 5. Отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках. 6. Устойчивость к фагам и другой посторонней микрофлоре. 7. Способность расти на дешевых и доступных субстратах, отходах пищевой и химической промышленности при высокой плотности клеток. Только по совокупности этих и других свойств можно оценить полезность и рентабельность продуцента. Наиболее изучены и чаще применяются в биотехнологии бактерии рода Clostridium, Thermoanaerobacter, Bacillus, Acetobacter, Pseudomonas, Brefibacterium. Охарактеризуем их особенности как продуцентов в биотехнологии. Бактерии имеют очень высокую скорость размножения, их клетки делятся через 30-60 минут (некоторые виды через 8-10 минут). Они могут перерабатывать в сутки объем биомассы, превышающий массу клетки в 30- 40 раз (масса 10 -12 г, объем – 10 -12 мл), и за 2-4 суток способны образовывать биомассу 10 10 т. В действительности этого не происходит, так как действуют разнообразные ограничивающие факторы. Но возможности бактерий к быстрому размножению намного превосходят другие виды организмов, что является важнейшим при производстве микробного белка и БАВ. Бактерии биохимически универсальны в том смысле, что могут усваивать самые разнообразные питательные вещества и даже способны выбирать наилучшие органические соединения из смеси, поэтому могут приспосабливаться к самым разнообразным условиям существования. Например, Pseudomonas multivorans в качестве источника углерода может использовать 90 веществ, в том числе углеводы и их производные, жирные кислоты, спирты, аминокислоты и даже циклические углеводороды (фенол). В зависимости от отношения к О 2 бактерии принято делить на облигатные аэробы, факультативные анаэробы, аэротолерантные анаэробы. Большинство продуцентов в микробной биотехнологии являются облигатными аэробами, поэтому культивирование их протекает при постоянном притоке О 2 , некоторые продуценты растут при низком содержании О 2 (2-10%), их называют микроаэрофилами, а условия, в которых их культивируют, микроаэробными. К факультативным анаэробам относятся некоторые представители рода Bacillus, Escherichia, к аэротолерантным анаэробам – метанообразующие бактерии. Большинство бактерий культивируют на сложных органических средах, 20 содержащих факторы роста (витамины, аминокислоты, пурины, пиримидины). Продуценты, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофами, штаммы, не обнаруживающие эту потребность, прототрофами. Молочнокислые бактерии можно отнести к ауксотрофам. Многие продуценты могут расти на синтетических средах, содержащих всего одно органическое вещество в качестве источника углерода. Некоторые продуценты используют в качестве источника энергии метан, метанол, метилированные амины. В микробной биотехнологии широко используется способность ряда бактерий осуществлять жизнедеятельность в результате окисления молекулярного водорода, сероводорода, аммония, нитратов, солей двухвалентного железа и некоторых других неорганических соединений. Для многих продуцентов характерен лабильный метаболизм, что выражается в способности использовать большое число разных соединений углерода, азота и др. элементов, а также переключения с одного типа питания на другой. Большинство бактерий имеют в составе клеточной стенки пептидогликаны (состоят из N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты). Особое значение как продуценты имеют архебактерии, древние представители прокариот. Они обитают в средах с экстремальными условиями (высокие концентрации неорганических веществ, повышенные температуры). Среди архебактерий галобактерии представляют большой интерес для биотехнологии. Они растут в среде, содержащей 20-30% NaCl (концентрированный раствор, Мертвое море), живут на сухой соленой рыбе, кожаных изделиях, имеют белки, нормальное функционирование которых происходит только при высоких концентрациях NaCl. Это палочки, кокки, квадраты, содержащие фотоактивные пигменты бактериородопсин и галородопсин. Галородопсин способен превращать электромагнитную энергию света в химическую энергию, за счет которой происходит фосфорилирование и синтез АТФ. Если пурпурные бактерии Halobacterium иммобилизовать на носителе, то при освещении можно получать электричество, АТФ и обессоливать морскую воду. В будущем предполагают с помощью таких микропреобразователей энергии обеспечивать электричеством отдельные жилища в странах с высокой солнечной радиацией. Метаногенные бактерии широко изучаются в биотехнологии как способ получения дополнительной энергии из возобновляемого субстрата. Биологический метаногенез был известен в Китае еще во II веке до н.э. В 1911 году в г. Бирменгеме был построен завод по анаэробному разложению сточных вод. Газовый генератор превращал метан в электричество, обеспечивая жизнь целого города. В настоящее время в Китае работает более 7 млн. установок по производству биогаза. Биомассу метаногенных бактерий можно применять как концентрат витамина B 12 для сельскохозяйственных животных. Серозависимые архебактерии и термоплазмы также вызывают большой интерес биотехнологов. Они обитают в горячих и кислых водоемах, в вулканических расщелинах. Энергию получают за счет окисления Н 2 , S, Fe 2+ 21 сульфитов металлов. Например, Thermoproteales живут при 108 ºС, (не ниже 80 ºС), анаэробы, причем ферменты, синтезированные в их клетках, обладают высокой терморезистентностью. Основное преимущество термофильных анаэробных архебактерий состоят в следующем: 1. сокращение сроков культивирования; 2. возможность обойтись без аэрации; 3. уменьшение вероятности заражения. Актиномицеты – группа грамположительных бактерий, клетки которых способны к ветвлению. Внешнее сходство с грибами нашло отражение в их названии («лучистые грибы», актис – луч, микес – гриб). Но фактически никакого родства с грибами, являющимися эукариотами, эти прокариотические организмы не имеют. Нити, образующие мицелий актиномицетов, имеют диаметр 0,3-1 мкм (у грибов – около 50 мкм). Колонии многих актиномицетов окрашены различными пигментами. Многие актиномицеты образуют плотный субстратный мицелий, врастающий в питательную среду. К антибиотикам, продуцируемым актиномицетами, относятся разнообразные химические соединения с широким спектром биологического действия: аминогликозиды, тетрациклины, актиномицины, макролиды, акзамицины. Важнейшими продуцентами этих групп антибиотиков являются Streptomyces griseus, Saccharopolispora hisuta, Micromonospora olivoasterospora, Nocardia mediterranea. Известно несколько основных вариантов использования бактерий для приготовления лекарств. Самый популярный основан на получении биомассы и последующем ее использовании в качестве полупродукта или же искомого препарата. Другой вариант основан на использовании биообъектов, которые накапливаются в среде выращивания. На этом принципе основано производство аминокислот, витаминов, ферментов, антибиотиков, полисахаридов. Микробные клетки используются в качестве источника белка главным образом в кормах для животных и для микробиологических трансформаций, которые проводят с помощью растущих или даже высушенных клеток. Суть таких превращений заключается в том, что одно соединение превращают в другое, родственное по структуре, с помощью одного или нескольких образуемых клетками ферментов. В отличие от большинства небиологических химических реакций биологические превращения происходят при биологических температурах, а растворителем служит вода. Полученные продукты отличаются высокой степенью чистоты, практически не содержат побочных продуктов. Биологическое превращение – строго специфичный процесс, т.е. каждый фермент катализирует только один вид реакции в специфическом месте молекулы субстрата. Однако при применении бактерий как продуцентов фармацевтической продукции должен быть тщательно изучен состав их липидов, так как у некоторых из них (например, у микобактерий) могут содержаться токсические компоненты. К тому же бактериальные клетки мелкие и процесс концентрирования 22 биомассы из-за этого затруднен. Известно около 30 видов бактерий, являющихся продуцентами различной биотехнологической продукции, в том числе и лекарственных веществ. Источником углерода при культивировании бактерий могут служить отходы различных видов промышленности, в том числе природный и попутный газы (водород), а также метанол, этанол, пропанол. На газовых питательных средах культивируются бактерии рода Methylococcus, Pseudomonas, Methylophillus. На метаноле в Великобритании организовано производство белкового препарата прутин, содержание белка в котором 74% от сухой массы. В России разработана технология промышленного получения меприна с использованием в качестве питательной среды метанол. В производстве белковых препаратов можно применять в качестве продуцентов и водородоокисляющие бактерии, накапливающие в клетках до 80% белка, особенно в близи химических предприятий. Использование бактерий в качестве продуцентов белка и витаминов при производстве фармацевтической продукции имеет ряд приоритетов: 1. Возможности использования отходов пищевых и химических производств для культивирования; 2. повышенное содержание незаменимых аминокислот в бактериальных клетках по сравнению с растительными белками; 3. Высокая скорость реакции биосинтеза белка; 4. Относительно несложная технология культивирования в промышленных масштабах, независимая от сезонов и других изменяющихся условий окружающей среды; 5. Возможность направленного воздействия с помощью методов селекции на химический состав клеток для совершенствования биологической ценности целевого продукта. Однако фармацевтическая продукция, полученная на основе клеток бактерий, должна подвергаться тщательной медико-биологической проверке для выявления канцерогенного, мутагенного, эмбриотропного действия на организм человека. Среди грибов в качестве продуцентов лекарственных веществ применяют микромицеты (дрожжи, Penizillum, Aspergillus) и макромицеты, формирующие в процессе роста и развития плодовые тела. Грибы имеют сходство и с растениями (верхушечный, или апикальный рост, прочная клеточная стенка, наличие вакуолей и поперечных перегородок у многих из них), и с животными (гетеротрофный тип питания, большая или меньшая потребность в витаминах, наличие хитина или хитозана, синтез гликогена). В то же время лишь грибам присуще мицелиальное строение и как следствие абсорбционный способ питания (осмотрофия). Для них известны явления дикариозиса -раздельное нахождение двух ядер в одной клетке, способных к одновременному делению и имитирующих диплоидное ядро, а также и гетерокариозиса - нахождение разнокачественных ядер в 23 одной клетке. Грибы имеют диаметр клеток в 3-5 раз больше, чем бактерии, и более устойчивы к фагам. Удельная производительность ферментеров по биомассе при применении бактерий в качестве продуцентов выше, чем при культивировании грибов (для Candida lipolytica 7 г/кг·ч, для бактерий Micrococcus lactis 22 г/кг·ч). Это связано не только с высокой скоростью роста бактерий, но и со способностью окисления более широкого спектра углеводов. В производстве спиртных напитков дрожжи представляют собой единственный промышленно используемый штамм микроорганизмов. Помимо производства пива и вина дрожжи применяют в промышленных масштабах для получения технического спирта и глицерина, а также в качестве добавок к кормам для животных. В качестве продуцентов используют Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica. Из соединений углерода дрожжи лучше всего используют гексозы, из полисахаридов утилизируют инулин и крахмал, некоторые можно культивировать на метаноле и этаноле, органических кислотах. В качестве источника азота при производстве дрожжей применяют соли аммония (нитраты, нитриты). Большинство дрожжей растет в границах pH 3,0-8,0, оптимальная температура культивирования 28-30 ºС, причем пивные дрожжи имеют более широкий оптимум температуры. Спиртовое брожение у дрожжей отличается от гликолиза у высших растений лишь последними этапами (образуется этиловый спирт), что обусловлено наличием фермента пируватдекарбоксилазы, катализирующей превращение пирувата в ацетальдегид, который затем восстанавливается в этанол. Штаммы Saccharomyu cerevisiae подразделяются на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относят винные и пивные дрожжи, к расам верхового – спиртовые, хлебопекарные. Дрожжи низового брожения функционируют в производстве при 6-10 ºС, верховые – при 14-25 ºС. В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, а верховые образуют «шапку». При культивировании дрожжей на этаноле выход по массе составляет 30% производительность ферментеров больше в 2-3 раза, чем при выращивании на n-алканах. Применение этанола для получения дрожжевой биомассы не встречает психологических возражений. В Чехии организовано производство биомассы Candida utilis на этаноле для добавления в продукты питания человека с целью улучшения их органолептических свойств. Дрожжи используют при производстве эргостерина и β-каротина. С точки зрения производства фармацевтической продукции наиболее важны продуценты родов: Aspergillus,Cephalosporium,Fusarium,Penicillum. К числу основных продуктов метаболизма их относятся антибиотики, органические кислоты и ферменты. Для культивирования дрожжей в качестве питательной среды 24 применяют неразветвленные углеводороды с 10-30 углеродными атомами в молекуле, т.е. жидкие фракции углеводородов нефти, а также молочную сыворотку (1 т сыворотки содержит 10 кг белка и 50 кг лактозы). В настоящее время разработана эффективная промышленная технология получения белка из молочной сыворотки методом ультрафильтрации, который применяется для получения сухого обезжиренного молока. Жидкие отходы от этого производства (перлиат) используются далее для выращивания кормовых дрожжей. Дрожжи культивируют на метаноле и этаноле. При такой технологии препарат содержит 56-62% белков и значительно меньшее количество вредных примесей (производных бензола, аминокислот, аномальных липидов, токсинов), чем при выращивании на n- парафинах нефти. Дрожжи по содержанию таких аминокислот, как лизин, треонин, валин и лейцин значительно превышает многие растительные белки. Белковые препараты из дрожжевой биомассы применяются в качестве пищевых добавок. Это пивные и пищевые дрожжи Sacharomices serevisiae, Candida arborea, Candida ufilis. В США разработана рецептура приготовления сосисок из мяса индейки с добавлением 25% дрожжевого белка. В Великобритании применяют 14 видов дрожжей рода Candida для утилизации молочной сыворотки и получения биомассы, богатой белками и витаминами. . Пивные дрожжи Sacharomyces carlsbergensis содержат не менее 48% белка, 14 различных витаминов и характеризуются хорошей сбалансированностью по незаменимым аминокислотам, поэтому широко применяются в медицине и пищевой промышленности при производстве колбас в качестве заменителя казеина. При переработке дрожжей в пищевой белок они подвергаются специальной обработке. Сначала стенки дрожжевых клеток разрушают (механическим, щелочным, кислотным воздействием или с помощью специальных ферментов), далее обрабатывают гомогенную биомассу подходящим органическим растворителем с целью освобождения от низкомолекулярных примесей и сопутствующих органических веществ. Следующая стадия – обработка растворами щелочей для растворения белков и диализ. Очищенные с помощью таких методических приемов белки осаждают, высушивают и применяют в пищевой технологии и медицине. Мицелиальные грибы образуют около 1200 антибиотических соединений. Наибольший интерес для клинической практики представляют пенициллины, цефалоспорины, гризеофульвин, трихотецин, фумагиллин и др. Пенициллины синтезируются определенными видами Penizillum (chrysogenium, brevicompactum, nigricans) и некоторыми видами Aspergillus (flavus, nidulans). Основным продуцентом при промышленном получении этого антибиотика является Penizillum chrysogenium, в процессе жизнедеятельности которого образуются различные формы пенициллинов, отличающиеся строением боковой части молекулы антибиотика, биологической активностью и спектром противомикробного действия. 25 Важнейшим продуцентом антибиотиков цефалоспоринового ряда, применяемым в фармацевтической промышленности, является Cephalosporium acremonium и актиномицет Streptococcus clavuligereus (цефалоспорин С, цефамицин С, цефалексин, цефрадин). В последние годы получены новые химические модификации цефалоспоринов (цефапарол, цефатризин, цефамандол, цефакситин). Большие затруднения при производстве антибиотиков на основе микромицетов представляет биомасса в виде мицелия, что усложняет конструкции биореакторов и приводит к изменению гидродинамических свойств культуральной жидкости. В качестве продуцентов в биотехнологии используют водоросли. Они медленнее растут, чем грибы. Общее содержание белка в них может достигать 40-70%, причем белки полноценные по аминокислотному составу. При культивировании водорослей можно получить в 2-10 раз больше сухого вещества, чем при культивировании высших растений. К макрофитам, применяемым в пищу человека относятся ульва, алария, порфира, родимения, хондрус, ундария, фурцеллярии, спирулина. В Японии культивирование порфиры занимает 60 000 г акватории. В нашей стране из черноморских водорослей добывают филлофору для производства иода, агар-агар производят из анфельции. Общая добыча водорослей около 3 млн. т (КНР, Япония), из них 2,2 млн т культивируют. Спирулина добывается и культивируется в водоемах, как традиционный продукт питания на территории Мексики и Центральной Африки. В России из нее получают вкусовые и белково-витаминные добавки к овощам, консервам, соусам (содержит 9 незаменимых аминокислот). Биомассу хлореллы и спирулины применяют для замены пищевого сырья для приготовления питательных сред при культивировании микроорганизмов, клеток растений и животных. Хлорелла представляет интерес для создания искусственных экологических систем для жизнеобеспечения экипажей космических кораблей. Следует отметить, что использование водорослей в качестве компонентов пищевых продуктов связано с рядом технологических проблем: 1. необходимость удаления клеточной стенки для уменьшения количества неперевариваемых компонентов; 2. обезжиривание, так как некоторые компоненты липидной фракции придают продукту неприятный вкус; 3. детоксикация пигментированных белков. Потенциальный продуцент биотехнологии царства животных – простейшие и различные группы почвенных беспозвоночных (дождевые черви и др.). Хотя простейшие в настоящее время не используются в промышленном масштабе ни для производства биомассы, ни для синтеза биологически активных веществ, они наряду с другими микроорганизмами играют большую роль в биологической очистке сточных вод фармацевтических предприятий. Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. настоящее время они лишь завоевывают себе место в 26 исследовательской работе и микробиологической промышленности как продуценты БАВ. При этом рациональнее использовать свободноживущих простейших. Они являются важной составной частью геологических пород, почвы, пресных и морских вод, некоторые продуцируют целлюлазный мультиферментный комплекс. Трипаносома стала первым продуцентом противоопухолевого препарата круцина (Россия, Франция), обладающего цитотоксическим эффектом при прямом контакте с опухолью. Свободноживущий жгутиконосец Astasia longa культивируют для получения астазилида, обладающего противоопухолевым действием не через цитотоксический эффект, а при воздействии на клеточное звено иммунитета. Эвгленовые можно рассматривать как перспективные продуценты гликанов и других гетерополисахаридов. |