Морфологические, физиологические, биохимические

• Название: Морфологические, физиологические, биохимические
• Дата: 07.02.2021
• Размер: 398.4 Kb.
• Имя файла: MIKRA_EKZAMEN 1.docx
• Тип: Документы; #174597
• страница: 11 из 20

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфек­ционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. 
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого ма­териала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изото­ническим раствором хлорида натрия для удаления не связавших­ся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресци­рующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кро­лика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

36. Иммуноферментный анализ. Компоненты реакции, варианты её использования в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Иммуноферментный анализили метод — выявление ан­тигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интен­сивность окраски прямо пропорциональна количеству свя­завшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных бо­лезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепати­та В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекар­ственных препаратов и других биологически активных ве­ществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (10¹⁰-10¹² г/л).

Твердофазный ИФА— вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти­генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти­тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного.Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом.Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

37. Реакция иммунного лизиса как один из механизмов уничтожения микробов. Компоненты реакции. Практическое использование.

Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клет­ками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к акти­вации системы комплемента по классическому пути и лизи­су клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других при меняется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Реакция иммунного лизиса – растворение (разрушение) цельноклеточного антигена, соединенного с антителами, в присутствии комплемента.

Одним из важнейших защитных свойств иммунной сыворотки (сыворотки, содержащей специфические антитела) при инфекции является ее способность растворять (лизировать) микроорганизмы или другие клеточные элементы, поступившие в организм. Специфические антитела, обусловливающие лизис (растворение) клеток, носят название лизинов. В зависимости от антигена они точнее называются бактериолизинами, спирохетолизинами, цитолизинами и т. д.

Лизины способны проявить свое лизирующее действие на антиген только в присутствии дополнительного фактора — к о м п л е м е н т а (от лат. complementum — дополнение). При хранении или подогревании сыворотки комплемент разрушается.

Таким образом, реакция лизиса происходит при участии двух компонентов: одного

специфического, содержащегося в иммунной сыворотке (антитело), и другого неспецифического, присущего любой сыворотке, как иммунной, так и нормальной (комплемент).

Свежеизвлеченная из организма иммунная сыворотка способна к лизису, так как содержит и антитело и комплемент. Если же пользуются иммунной сывороткой, стоявшей или подвергнутой прогреванию и вследствие этого утратившей комплемент, то лизис произойдет только при условии добавления комплемента, т. е. свежей сыворотки. Для обеспечения постоянства результатов иммунную сыворотку заранее и н а к т и в и р у ю т нагреванием при 56°С в течение 30 минут (для разрушения имеющегося в ней комплемента) и прибавляют к ней строго определенное количество комплемента. В качестве комплемента принято пользоваться свежей сывороткой нормальной морской свинки.

В микробиологической практике наиболее широко применяются реакция б а к т е р и о л и з а — разрушения бактерий и гемолиза - разрушения эритроцитов

Бактериолиз.

Реакция бактериолиза состоит в том, что при соединении иммунной сыворотки с

соответствующими живыми бактериями в присутствии комплемента происходит лизис микробов. Р-я бактериолиза наблюдается как в организме иммунного животного, так и в пробирке.

Под воздействием антител — бактериолизинов микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), затем распадаются как бы на отдельные зернышки и, наконец, совсем растворяются.

Весь этот процесс происходит в течение 15—20 минут. Большинство микроорганизмов, за исключением холерного вибриона и трепонем, малочувствительны к литическому действию комплемента. Поэтому реакция лизиса не нашла широкого применения в лабораторной практике.

В практике реакцией бактериолиза пользуются для:

1) определения вида неизвестного микроба при помощи специфической сыворотки;

2) определения в исследуемой сыворотке наличия бактериолизинов к заранее известному микробу.

Реакция бактериолиза воспроизводится в пробирке (in vitro) и в организме животного (in vivo).

Реакция бактериолиза in vitro. В стерильной пробирке делают смеси из взвеси культуры, инактивированной иммунной сыворотки и комплемента. В контрольную пробирку вместо иммунной сыворотки добавляют такой же объем нормальной сыворотки. Пробирки помещают на 2 часа в термостат при температуре 37°С, после чего делают посев 0,1 мл на чашки с агаром и ставят посевы на сутки в термостат. На следующий день в посеве из контрольной пробирки обнаруживается обильный рост культуры. В посеве же из пробирки, содержавшей иммунную сыворотку, количество выросших колоний значительно меньше; возможно и полное отсутствие роста.

Иммунный гемолиз.

Является разновидностью реакции иммунного лизиса. В качестве антигена в этой реакции применяют эритроциты, которые разрушаются гемолизинами (антителами против эритроцитов) в присутствии комплемента.

Гемолизины появляются в организме при искусственной иммунизации чужеродными эритроцитами. Иммунная сыворотка, содержащая гемолизины, носит название гемолитической сыворотки. Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии гемолитической сыворотки на соответствующие эритроциты в присутствии комплемента происходит их разрушение (гемолиз) - взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — так называемую «лаковую кровь». Действие иммунной гемолитической сыворотки строго специфично — она вызывает гемолиз только тех эритроцитов, которые были взяты для иммунизации. Реакция гемолиза благодаря своей демонстративности получила широкое применение в лабораторной практике: ею пользуются в качестве показателя адсорбции комплемента при диагностических реакциях, например реакция Вассермана для диагностики сифилиса и аналогичных ей диагностических реакциях при других заболеваниях.

Обычно для реакции гемолиза принято пользоваться в качестве антигена бараньими эритроцитами и, следовательно, гемолитической сывороткой, полученной при иммунизации животного (кролика) теми же эритроцитами.

Постановка реакции.

Для постановки реакции гемолиза необходимо иметь:

1) антиген: отмытые эритроциты барана в виде 5% взвеси в растворе ИХН (ИХН –

изотонический хлорид натрия);

2) иммунную гемолитическую сыворотку, содержащую гемолизины к бараньим эритроцитам;

3) комплемент — свежую сыворотку морской свинки в разведении 1:10;

4) физиологический раствор (ИХН)

Взвесь эритроцитов получают из крови барана путем дефибринирования (удаления фибрина) во флаконе с бусами и встряхивания в течение 10-15 мин. После отмывания в 0,85% изотоническом растворе хлорида натрия в центрифуге готовят 3% взвесь эритроцитов.

Гемолитическую сыворотку готовят в производственных институтах. Для этой цели кроликам парентерально 3 — 4 раза вводят 2 — 5 мл 50 % взвеси эритроцитов барана. В организме кролика вырабатываются антитела на эритроциты – гемолизины. У кроликов забирают кровь, получают сыворотку и обязательно её титруют.

Титром гемолитической сыворотки называют ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента при температуре 37° С вызывает полный гемолиз эритроцитов барана на протяжении 1 ч.

Комплемент. Источником комплемента служит сыворотка крови морской свинки, полученная в день опыта. Применяется также сухой комплемент, полученный из этой сыворотки. Реакцию учитывают через 1 ч после инкубации пробирок в термостате при температуре 37 °С.

Реакциюиммунного гемолиза используют для определения

1. количества комплемента в сыворотке крови людей,

2. в качестве индикатора связывания комплемента в реакции связывания комплемента (РСК).

38. Реакция связывания комплемента в диагностике инфекционных заболеваний. Компоненты реакции, практическое значение.

Реакция связывания комплемента (РСК)за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорб­цией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связыва­ния комплемента не проявляется визуально. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемоли­за не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к слож­ным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологи­чески измененных и нормальных органов, тканевых липидов, ви­русы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыво­ротку морской свинки.

Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

39. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Практическое применение.

В основе этой реакции лежит способность специфической ан­титоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувст­вительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.

Реакцию нейтрализации(РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Для прове­дения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свин­кам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследу­емого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Конт­рольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.

40. Реакция нейтрализации вирусов. Применение для идентификации вирусов и для серологической диагностики инфекций. Варианты вирусной нейтрализации.

Реакция нейтрализации вирусов . применение для идентификации вирусов и для серологической диагностики инфекций. Варианты вирусной нейтрализации.

Реакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов.

Она применяется в двух направлениях:
1) для идентификации вирусов;
2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках.
Компоненты:
1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).
2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).
3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты.

Реакции нейтрализации т У!УО ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных.

Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.

Реакция нейтрализации — реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

РТГА применяется:
-для серотипирования вирусов;
-для серодиагностики инфекций.
Выделяют два способа постановки:
- капельный способ на стекле (ориентировочная реакция), применяется для серо копирования вирусов;
- развернутый в пробирках.