Вопросы и ответы фармтехнология. Непрерывный и периодический технологический процесс
 Скачать 6.32 Mb.
|
|
142. Технология производства человеческого инсулина от «Eli Lilly and Co» преимущества получения инсулина биосинтетическим путем. Отличия человеческого и животного инсулина. Различия в процессе производства. Инсулин (от гист. Insulae pancreaticae – панкреатические островки) – белковопептидный гормон, синтезируемый в β-клетках островков поджелудочной железы; является универсальным анаболическим гормоном, необходимым для роста и развития организма, подобно соматотропному гормону гипофиза, синергистом которого в этом отношении он является. Одним из наиболее ярких эффектов инсулина служит его гипогликемическое действие. Действие этого гормона связано с регуляцией содержания сахара в крови. Считают, что инсулин осуществляет вспомогательную функцию при переносе глюкозы из крови через стенки сосудов к мускульной ткани, где глюкоза расходуется для энергетических целей, или к клеткам печени, где из глюкозы синтезируется резервный полисахарид – гликоген. Структура инсулина была установлена Сенджером. Это циклический гетерогенный пептид, состоящий из двух цепей, соединенных двумя сульфидными мостиками. В цепи А содержится 21, а в цепи В – 30 аминокислотных остатков. Со времени проведения первых опытов по использованию инсулина для лечения диабета в 1922 г. этот гормон выделяли из поджелудочной железы животных (коров и свиней). Инсулин увеличивает проницаемость плазматических мембран для глюкозы, активирует ключевые ферменты гликолиза, стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена, усиливает синтез жиров и белков. Кроме того, инсулин подавляет активность ферментов, расщепляющих гликоген и жиры. То есть, помимо анаболического действия, инсулин обладает также и антикатаболическим эффектом. Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток — абсолютная недостаточность инсулина — является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани — относительная инсулиновая недостаточность — имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа. Существует несколько причин, по которым целесообразна разработка методов крупномасштабного производства и выпуск на рынок инсулина человека: среди них коммерческие соображения и эмоциональные факторы, и потребности развития науки, и возможные преимущества при лечении. Инсулин, как коров, так и свиней немного отличается по аминокислотной последовательности от инсулина человека. Особенно близки инсулины человека и свиньи: у последнего лишь С-концевой треонин В-цепи заменен на аланин. Инсулины коровы и человека различаются по трем аминокислотным остаткам, и именно этими различиями определяется повышенная иммуногенная активность инсулина коровы по сравнению с инсулином свиньи. Почти у всех больных, которых лечат обычным методом, т.е. вводят им инсулин коровы, в крови появляются антитела к инсулину. Антигенные свойства инсулина частично определяются примесями в его препаратах. Скорее всего, именно образованием антител к инсулину объясняются некоторые незначительные побочные эффекты при инъекциях инсулина коровы, например, атрофия подкожной жировой прослойки. В случае высокоочищенного инсулина свиньи эти эффекты отсутствуют. Далее антитела к инсулину инактивируют его в кровотоке, так что больному приходится вводить большие дозы, чем это необходимо. Антитела влияют и на продолжительность биологического действия введенного инсулина. Можно предположить, что инсулин человека будет еще менее иммуногенным, чем инсулин свиньи. Так как число больных диабетом и соответственно потребность в инсулине растут, то вполне возможно, что доступность его в будущем уменьшится из-за нехватки исходного сырья – поджелудочной железы животных. Из-за чисто эмоциональных факторов лучше использовать инсулин человека, чем какого-либо животного. Ряд производителей инсулина во главе с фирмой «Eli Lilly and Co» использовали как основу для производства инсулина человека технологию рекомбинантных ДНК. На первом этапе воссоздают последовательность ДНК по аминокислотной последовательности инсулина, раздельно синтезируя искусственные гены его А- и В-цепей. На 5΄-конце каждого из них располагается кодон метионина (который в синтезированном белке оказывается N- концевым), а на 3΄-конце – терминирующие последовательности. Каждый из генов встраивается затем в ген β-галактозидазы плазмид, а их в свою очередь вводят в клетки E.coli. Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, то в них индуцируется синтез β- галактозидазы, а вместе с ней А- и В-цепей инсулина, присоединенных через остаток метионина. После лизиса бактерий и обработки бромцианом, который специфически расщепляет белки по остатку метионина, цепи инсулина отделяют от β-галактозидазы (инсулин метионина не содержит). Затем проводят очистку цепей и их объединение, в результате чего образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E.coli, эндотоксинов и пирогенных веществ, по физическим свойствам неотличим от инсулина из поджелудочной железы человека и в тест- системе проявляет полную биологическую активность. Впоследствии был испытан альтернативный метод: синтезировали ген молекулы– предшественника, проинсулина, который вводили в E.coli. После очистки проинсулина его расщепляли трипсином и β-карбоксипептидазой и получили нативный инсулин. Животный инсулин экстрагируют способом бисмацерации из тканей железы животного с последующей очисткой от кислот, белков, липидов, балластных веществ (см.147 вопрос подробно) Инсулин человека, полученный с помощью E.coli, оказался первым «генно-инженерным белком», испытанным на людях. В опытах со здоровыми добровольцами было установлено, что он безопасен, во всяком случае при краткосрочном применении (не вызывает аллергических и иных нежелательных реакций) и обладает практически одинаковой с инсулином свиньи способностью снижать уровень глюкозы в крови при введении его под кожу и внутривенно. 143. Технологическая схема производства антибиотиков. Основные направления поиска новых антибиотиков. Механизмы биосинтеза антибиотиков. Продуценты антибиотиков. Антибиотики — специфические продукты жизнедеятельности организмов, их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (бактериям, грибам, водорослям, протозоа), вирусам и злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих развитие. Причины интенсивного поиска новых антибиотиков: многие антибиотики – незаменимые лекарственные средства. аб–необходимы в сельском хозяйстве как лекарственные препараты. при широком применении антибиотиков в качестве лекарственных препаратов происходит быстрое накопление резистентных к этим соединениям форм микроорганизмов, что требует поиска все новых и новых антибиотиков; некоторые аб применяются в пищевой промышленности в качестве консервантов скоропортящихся продуктов; аб–ранее не известные по химическому строению соединения – представляют огромный интерес для специалистов в области химии. аб нашли широкое применение в научных исследованиях в качестве веществ, используемых при изучении отдельных сторон метаболизма организмов. изучение путей образования антибиотиков способствует раскрытию основных этапов их метаболизма. Основные направления поиска новых антибиотиков включают в себя: 1. Испытание новых продуцентов: н-р, начиная с 80-х гг. исследуются миксобактерии, продуцирующие большое количество антимикробных агентов (Н. Thierbach, N. Reichenbach, 1981). 2. Химическая модификация антибиотиков: н-р, противомикробные макролиды токсичны для человека: гептаен амфотерицин В, используемый при тяжелых микозах, вызывает необратимые поражения почек; получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и сохраняющие противогрибковую активность. 3. Мутасинтез: применяют мутантные штаммы, у которых блокирован синтез отдельных фрагментов молекулы антибиотика. В среду культивирования вносят аналоги этих фрагментов. Микроорганизм использует эти аналоги для биосинтеза, в результате получают модифицированный антибиотик. 4. Клеточная инженерия: получают гибридные антибиотики с новыми комбинациями агликона и сахаров. 5. Генетическая инженерия — введение в геном микроорганизма информации о ферменте, необходимом для модификации продуцируемого антибиотика. Механизмы биосинтеза антибиотиков 3 обстоятельства определяют особенности биосинтеза антибиотиков: антибиотики не относятся к прямым продуктам трансляции или вообще матричного синтеза; антибиотики как вторичные вещества образуются из первичных метаболитов; биосинтез молекулы любого антибиотика происходит с участием ряда ферментов. Координация действия ферментов обеспечивается разными путями. Один путь, доказанный на примере биосинтеза циклопептидных антибиотиков, связан с тем, что синтез или сборка антибиотической молекулы происходит в мультиферментных комплексах с упорядоченно расположенными ферментами. Первичные метаболиты «входят» в мультиферментный комплекс, в котором происходит ряд превращений. Из комплекса «выходит» завершенная молекула антибиотика или ее крупный фрагмент. При «сборке» углеродного скелета молекулы антибиотика могут происходить различные реакции: метилирование или деметилирование; карбоксилирование или декарбоксилирование и т.п. Продуценты антибиотиков Неспорообразующие бактерии: Pseudomonas aeruginosa – пиоцианин и пиоцианазу Спорообразующие бактерии: штаммы Bacillus subtilisпроизводят бацитрацин, субтилин; B. brevis– тиротрицин и др. Актиномицеты: кроме пенициллина, наиболее важные антибиотики получены из актиномицетов. К настоящему времени выделено или описано более 200 таких соединений (стрептомицин, тетрациклины, эритромицин, новобиоцин, неомицин и др.). Микроскопические грибки: цефалоспорин, гризеофульвин, микофеноловую и пенициллиновую кислоту, глиотоксин, клавацин, аспергилловую кислоту и др. Водоросли способны вырабатывать вещества, обладающие антибиотическими свойствами, но пока ни одно из них не нашло клинического применения. Лишайники:лихенин и усниновая кислота. Высшие растения образуют антибактериальные вещества, сходные по своим свойствам с истинными антибиотиками: фитонциды – аллицин, томатин и др. Животные:среди продуктов животного происхождения, обладающих антибактериальными свойствами, важное место занимает лизоцим. Многие простейшие, личинки насекомых и некоторые др. животные могут переваривать живые бактерии и грибки, но пока не выяснено, в какой степени эта способность связана с выработкой веществ, обладающих антибиотическими свойствами. Существует 3 способа получения антибиотиков. Биологический синтез. Для получения антибиотиков этим способом используют штаммы микроорганизмов, образующие наибольшее количество антибиотика. Химический синтез. С помощью этого метода получают основные синтетические антибиотики. Комбинированный способ представляет собой сочетание двух предыдущих способов: из полученного в результате биологического синтеза антибиотика выделяют так называемое ядро (6-аминопенициллановую кислоту из пенициллина) и химическим путём добавляют к нему различные радикалы. Антибиотики, полученные комбинированным способом, называются полусинтетическими, к которым более длительное время чувствительны микроорганизмы, устойчивые к природным антибиотикам. Комбинированный способ – наиболее экономически выгодный метод производства антибиотиков. Схема промышленного биотехнологического производства антибиотиков 1) подготовка питательно среды: в технологии получения антибиотиков применяют твердые питательные среды – агаризованные или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т.п.) и жидкие питательные среды. Условия синтеза антибиотиков: Стерильность. Питательная среда. Условия синтеза антибиотиков заключаются в том, что в питательной среде должны присутствовать источники азота, углерода, фосфора, предшественники антибиотиков и витамины. рН. Для бактерий рH питательной среды составляет 7, для грибов – 4,5–5, для актиномицетов – 6,7–7,5. Для большинства известных антибиотиков оптимальная величина рН близка к нейтральной. Температура. Для биосинтеза антибиотика требуется определенная температура: для биосинтеза пенициллина грибом рода пеницилиум оптимальной температурой является 25– 26 С, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами обычно поддерживают более высокую температуру 27–29 С. Перемешивание и аэрация:т.к. продуценты антибиотиков являются аэробами, следовательно, требуется создать при их синтезе хорошую аэрацию.Назначение аэрации и перемешивания – снабжение культуры кислородом, но одновременно они способствуют поддержанию мицелия во взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости. Вспенивание. Питательные среды, применяемые при получении антибиотиков, содержат вещества, способные образовывать весьма стойкие пены. Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента. В состав среды вводят пеногасители (растительные и животные жиры, минеральные масла, ПАВ). 2) Подготовка посевного материала (продуценты-мутанты колба на качалке первый инокулятор (10 л) второй инокулятор (100–500 л) ферментер). 3) Ферментация: для получения антибиотиков используют методы поверхностного и глубинного культивирования. В промышленном производстве антибиотиков используют аппараты разной емкости. В ходе ферментации культура непрерывно аэрируется стерильным подогретым воздухом. Температура среды, рН и ряд др. параметров автоматически регулируются в соответствии с регламентом производства антибиотика. Процесс ферментации осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре, носит выраженный двухфазный характер. 4) Выделение антибиотиков. Если антибиотик находится в клетках, на первом этапе обработки биомассу выделяют из культуральной жидкости (фильтрацией или центрифугированием); после разрушения клеток антибиотик экстрагируют и переводят в растворимую фазу. Затем данный раствор и культуральные среды (если антибиотик выделяется из клеток в среду) подвергают разным методам экстракции, разделения, очистки и концентрирования для получения готового продукта. Цель всех процедур постферментационной стадии – получение стерильных препаратов высокой степени чистоты. 5) Очистка антибиотиков. Данная стадия технологического процесса включает в себя: осаждение, сорбцию, сушку. Помимо традиционных экстракционных и сорбционных методов при выделении и очистке антибиотиков все большее значение приобретает комплекс приемов, объединяемых названием мембранные технологии. При обезвоживании препаратов антибиотиков в зависимости от свойств используют лиофильную или распылительную сушку. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением условий, гарантирующих стерильность. 6) Получение готового продукта: т.к. биосинтез антибиотиков ведется в асептических условиях, то при выделении, очистке и получении ЛФ также соблюдаются максимально возможные предосторожности против контаминации. Готовый продукт подвергается биологическому и фармакологическому контролю. Биологический контроль определяет степень стерильности препарата. При фармакологическом контроле проводят всесторонние испытания препарата на токсичность, пирогенность, токсикогенность и др., оценивают антимикробный спектр препарата, действие на лейкоциты крови, устанавливают максимально переносимую дозу антибиотика, дозы, вызывающие полную и 50 % гибель экспериментальных животных. Готовая форма лекарственного препарата антибиотического вещества поступает к потребителю с указанием биологической активности и даты выпуска. 144.Химическая модификация антибиотиков. Способы получения антибиотиков. Пути повышения выхода антибиотиков. Схема промышленного биотехнологического производства антибиотиков Термин «антибиотик» предложен А. Вюименом в 1889 г.Антибиотики — специфические продукты жизнедеятельности организмов, их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (бактериям, грибам, водорослям, протозоа), вирусам и злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих развитие. Существует 3 способа получения антибиотиков.Биологический синтез. используют штаммы микроорганизмов, образующие наибольшее количество антибиотика.Химический синтез. получают основные синтетические антибиотики.Комбинированный способ- сочетание двух предыдущих способов: из полученного антибиотика выделяют ядро (6- аминопенициллановую кислоту из пенициллина) и химическим путём добавляют к нему различные радикалы. Антибиотики, полученные комбинированным способом- полусинтетические, к которым более длительное время чувствительны микроорганизмы, устойчивые к природным антибиотикам. наиболее экономически выгодный метод производства антибиотиков. Пути повышения выхода антибиотиков 1. Прямая ферментация – продуцента с подходящим предшественником, индуцирущая синтез ферментов вторичного метаболизма в идиофазе. молекулы предшественника необходимо добавлять в среду в период фазы роста микроорганизма. Вводимый предшественник должен лимитировать скорость биосинтеза антибиотика. Аналогичный эффект вызывает применение ингибиторов. 2. Биосинтез антибиотиков с применением блокированных мутантов, у которых отсутствует или блокировано определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотиков. Блокированные мутанты не способны образовывать нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотиков, последние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез (мутасинтез). 3. |