Вопросы и ответы фармтехнология. Непрерывный и периодический технологический процесс
 Скачать 6.32 Mb.
|
|
147.Принципиальная технологическая схема получения рекомбинантного интерферона. Этапы. Гормон роста. Биотехнологическая схема производства. Виды ГМО для производства препаратов соматотропина. Принципиальная технологическая схема получения рекомбинантного интерферона включает следующие этапы: 1.Выделение иРНК, несущую информацию о структуре молекулы интерферона (РНК выделяют после индукции синтеза интерферона); 2.Получение кДНК на матрице иРНК; 3.Встраивание кДНК в векторную плазмиду с участием ферментов рестриктаз и лигаз и получение рекомбинантной ДНК (рДНК), содержащей ДНК вектора с генетическими маркерами и ДНК, кодирующую синтез целевого продукта; 4.Трансформация рДНК в рецепиентную (пермиссивную) микробную клетку; 5.Получение клонов рекомбинантных продуцентов, способных синтезировать интерферон (на плотной питательной среде); 6.Размножение клоновой культуры – продуцента в жидкой питательной среде; 7.Отделение клеток из культуральной жидкости центрифугированием; 8.Выделение целевых белков из нативного раствора или лизата биомассы продуцента, например, осаждением сульфатом аммония; 9.Очистка интерферона после растворения осадка с помощью аффинной хроматографии при использовании сорбента, связанного с моноклональными антителами к интерферону. Гормон роста, или соматотропный гормон (СТГ), продуцируется специализированными клетками гипофиза - соматотрофами. Содержание соматотропного гормона в одном гипофизе человека составляет около 5 мг и по крайней мере на порядок превышает содержание других гормонов. Гормон роста обладает ярко выраженным анаболическим действием и влияет на все клетки организма, повышая в них уровень биосинтетических процессов, усиливает биосинтез белков, ДНК, РНК и гликогена, способствует мобилизации жиров из жировых депо и ускоряет распад высших жирных кислот и глюкозы. Соматотропный гормон улучшает функции почечных канальцев и нормализует минеральный и водный обмен организма, что способствует росту организма, но, в конечном счете, действие гормона гораздо шире, нежели только регуляция роста. Исследования на молекулярном уровне показали, что соматотропный гормон стимулирует действие РНК-полимераз и полирибосомного аппарата клетки. Как свидетельствуют опыты с меченым фосфором, самым ранним эффектом действия гормона роста является синтез в ядрах клеток предшественников мРНК и рРНК. Вместе с тем велико его влияние и на проницаемость клеточных стенок, т.к. фонд внутриклеточных аминокислот в присутствии СТГ значительно возрастает, что способствует новообразованию белка. СТГ повышает содержание в крови особых стимулирующих рост факторов – соматомединов. Получение гормона роста в биотехнологии Рекомбинантный соматотропин, -соматрем, стал вторым биосинтетическим фармацевтическим препаратом. СТГ, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 году фирмой «Genentech». Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NН 2 - конце молекулы. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов (промотор - специфическая последовательность в ДНК, необходимая для инициации транскрипции РНК-полимеразы) и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 млг на 1 мл культуры E.cоli (100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной м.м. и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было отщеплять. Изменяя аминокислотную последовательность СТГ посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы и этиологии карликовости на молекулярном уровне. Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образование которого индуцируется соматотропином. В 1982 году выделен и синтезирован полипептид, содержащий из 44 аминокислотных остатков, обладающий полной биологической активностью гипоталамического ризилинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Примнение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.Весь технологический цикл состоит из пяти функционально различных этапов: 1) ферментация;2) первичная очистка белка;3) хроматографическая очистка;4) изготовление лекарственной формы; 5) анализ качества субстанции и лекарственной формы соматогена. Важной особенностью технологического процесса является обеспечение апирогенности при проведении хроматографической очистки белка. Неотъемлемой составной частью каждого технологического цикла промышленного производства является проведение сложного комплекса анализов качества продукта. В основе объема и номенклатуры этих анализов лежат соответствующие рекомендации ВОЗ. Под ГМО понимают живые организмы, имеющие преднамеренно измененные последовательности нуклеиновых кислот. Виды гмо-генетически модифицированные бактерии- E.cоli.(больше не нашла) 148.Способ получения рекомбинантного эритропоэтина. Противоопухолевые антибиотики. Биотехнология факторов свертывания крови. Эритропоэтин — один из гормонов почек. По химическому строению является гликопротеином. Эритропоэтин — физиологический стимулятор эритропоэза. Пусковой механизм образования эритропоэтина- гипоския, особенно гипоксия почек. Введение эритропоэтина- альтернатива переливанию крови. Препараты эритропоэтина (эпоэтин альфа и эпоэтин бета) .В качестве продуцентов рекомбинантного ЭПО используют штаммы культивируемых клеток китайского хомячка. Уровень продукции, около 4 мг/л рЭПО. Штамм был получен по технологии, включавшей в себя трансформацию линии клеток яичника китайского хомяка плазмидой , несущей MT-I промотор, маркер DHFR+ и полноразмерный ген человеческого эритропоэтина с последующей одношаговой селекции целевых трансфектантов на питательной среде.Этапы получения ЭРО из штамма клеток яичника китайского хомяка штаммы подращивают в течении не менее 2 суток в роллерных флаконах на питательной среде Предварительно накопленную суспензию клеток высеивали в объеме 100 мл питательной среды ростового состава ( содержит эмбриональную сыворотку, глутамин, гентамицин и др_) Флаконы инкубировали при 37 o C в течение 3 суток в стационарных условиях. По окончании инкубации ростовую питательную среду во флаконах заменяли на эквивалентный объем накопительной среды( содержит фетаклон, глутамин и др.), и инкубацию флаконов при 37 o C продолжали еще 2 суток. По окончании инкубации накопительную среду из флаконов собирали в сборную емкость и помещали для хранения в холодильник при +4 o C. В культуральные флаконы с клеточной культурой вносили свежую порцию накопительной среды и весь цикл накопления эритропоэтина повторяли. В общей сложности было проведено 7 циклов накопления эритропоэтина и было собрано 6,8 л культуральной жидкости, содержащей эритропоэтин. По окончании накопительного периода клетки из каждого флакона были собраны посредством ресуспендирования в 500 мл накопительной среды В собранной накопительной среде определили содержание эритропоэтина с помощью твердофазного иммуноферментного анализа Собранную накопительную среду подвергли очистке с целью выделения и характеристики синтезированного эритропоэтина. Для этого культуральную жидкость осветляли микрофильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,8 мкм и очищали посредством иммуноаффинной и ионнообменной хроматографии до гомогенного состояния. Удельную биологическую активность полученного эритропоэтина контролировали in vivo на мышах с гипербарически индуцированной анемией Противоопухолевые антибиотики (ПА)..ПА могут обладать, но могут и не обладать антимикробной активностью, что будет зависеть от того, проникают ли они внутрь микроорганизмов. ПА подавляют синтез нуклеиновых кислот. Классификация: 1. ПА, которые действуют на синтез предшественников пуринов и пиримидинов. (представителем -азосерин, который подавляет синтез пуринов и является структурным аналогом глутамина). 2. ПА, которые действуют на стадии включения нуклеотидов в РНК. Такие АБ являются аналогами аденозина (нуклеотид). К ним относятся тойокомицин, формицин, 5- фторурацил. 3. ДНК-тропные антибиотики (реагируют более активно с ДНК опухолевых клеток). Это группа актиномицинов, в основе действия которых находится реакция с парами оснований (они имеют хромофор и две пептидные цепи). В рез- те их д-я прекращается синтез по матрице ДНК. это дактиномицин- продукт жизнедеятельности актиномицета Streptomyces parvuilus, оливомицин Продуцируется лучистым грибом Actinomyces olivoreticuli, и хромомицин. 4. Группа антрациклинов. В своей структуре они имеют 4 шестичленных кольца и аминосахар. Продуцентами- актиномицеты. - даунорубицин, доксорубицин. Их прим. для лечения лейкозов, рака легких, рака молочной железы. Антрациклины кардиотоксичны, так как они в клетке подавляют синтез ДНК и РНК и вызывают в ДНК одно и двунитевые разрывы. 5. Митомицин отличается тем, что предварительно активируется в клетке (восстанавливается) и сшивает комплементарные нити ДНК, подавляя репликацию ДНК ( в этом случае нити ДНК не могут разойтись). 6. Блеомицин - -избирательным подавлением синтеза ДНК, вызывая фрагментацию молекул ДНК. Он способен накапливаться в коже и поэтому особенно эффективен при раке кожи и слизистых оболочек. Этот антибиотик является продуктом жизнедеятельности гриба и по структуре является полипептидом. Cвертывание крови - это каскадный ферментный процесс, в котором участвуют физико-химические реакции. В свертывании крови участвуют более, чем 4 фактора, которые находятся в плазме, форменных элементах крови, тканях.Факторы свёртывания крови — группа веществ, содержащихся в плазме крови и тромбоцитах и обеспечивающих свёртывание крови. Большинство факторов свёртывания — белки. К факторам свёртывания относятся также ионы кальция и некоторые низкомолекулярные органические вещества.Известен способ получения очищенных препаратов фактора VIII свертывающей системы крови путем получения криопреципитата из плазмы крови, вирусинактивирующей обработки раствора криопреципитата, хроматографической очистки раствора криопреципитата методом ионообменной хроматографии, стерилизующей фильтрации, розлива, высушивания методом сублимации.Способ получения концентрата IX фактора свертывания крови из плазмы крови человека, включает ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, осаждение сульфатом аммония и металлохелаторную хроматографию с последующим диализом против буфера.Среди наследственных нарушений свертываемости крови подавляющее большинство приходится на гемофилии А и В, а также болезнь Виллебранда. Для них характерна кровоточивость, возникшая еще в детском возрасте; при этом отмечаются гематомный тип кровоточивости (с кровоизлияниями в суставы и поражением опорно-двигательного аппарата) у лиц мужского пола при гемофилиях и смешанный тип (петехиально-пятнистый с редкими гематомами) у лиц обоих полов при болезни Виллебранда.Основной принцип лечения нарушений свертываемости крови заключается в быстром (струйном) внутривенном введении препаратов, содержащих недостающие факторы свертывания крови (криопреципитат при гемофилии А и болезни Виллебранда; протромбиновый комплекс или PPSB — комплекс II, VII, IX и Х факторов свертывания крови при дефиците факторов IX, VII, Х и II, в т.ч. при геморрагической болезни новорожденных, передозировке антикоагулянтов непрямого действия; концентратов отдельных факторов свертывания крови, антикоагулянтов, компонентов фибринолитической системы). Заместительная терапия показана при проведении оперативных вмешательств, для предупреждения кровопотери в родах и др.Факторы свертывания крови В одном из вариантов подобной процедуры использовали рДНК, содержащую промотор β- лактальбумина. Этот промотор обеспечивает транскрипцию гена β-лактальбумина – одного из белков молока, но если его соединить с др. геном (с геном фактора IX – белка, участвующего в свертывании крови), то промотор будет включать транскрипцию этого гена и синтез соответствующего белка. Рекомбинантную плазмиду с промотором β- лактальбумина и геном человека вводят в яйцеклетку овцы (путем инъекции), и яйцеклетку имплантируют в матку овцы; некоторые особи из ее потомства будут содержать в своем геноме ген человека (трансгенные животные). Трансгенные животные синтезируют белок, кодируемый геном человека; поскольку промотор β-лактальбумина функционирует только в молочной железе, а в других органах он неактивен, то белок, кодируемый геном человека (фактор IX), синтезируется в молочной железе и секретируется с молоком. Синтезированный белок выделяют из молока трансгенных животных.Также биотехнологическим путем получают факторы свертывания крови, особенно фактор VIII (с помощью культивируемых клеток млекопитающих) и фактор IX (с помощью генноинженерного штамма Е. coli),необходимы для терапии форм гемофилии наследственной болезни, при которой кровь теряет способность свертываться. 149.Иммунобиологические препараты. Классификация. Вакцины. Общая характеристика. Классификация. Общими требования к вакцинным препаратам. В настоящее время разработано и используется более тысячи различных средств, объединенных в группу иммунобиологических препаратов. По современной классификации (Воробьев А.А.), к иммунобиологическим препаратам относятся:-препараты, получаемые из живых и убитых микроорганизмов и микробных продуктов, используемых для специфической профилактики или лечения (вакцины, анатоксины, фаги, пробиотики и эубиотики); -иммуноглобулины и иммунные сыворотки от иммунизированных животных и человека или полученные методами генной инженерии моноклональные антитела;- иммуномодуляторы для иммунокоррекции, лечения и профилактики иммунодефицитов разной этиологии (ИЛ, ИНФ, гормоны тимуса, миелопептиды, фактор некроза опухолей, ростовые факторы и др.);-диагностические препараты для выявления антител и антигенов, постановки кожных проб при аллергиях и иммунопатологических состояниях, определения сенсибилизированных иммунокомпетентных клеток, факторов неспецифической резистентности организма (комплемент, интерферон, лизоцим), индикации и идентификации микробов в объектах внешней среды, в санитарии и промышленной микробиологии. Вакцины – это препараты, приготовленные из убитых или ослабленных болезнетворных микроорганизмов или их токсинов.Введение вакцин вызывает иммунную реакцию, за которой следует приобретение устойчивости организма человека или животного к патогенным микроорганизмам. Классификации вакцин:Классические.Живые-спонтанно или искусственно полученные штаммы авирулентных возбудителей.Убитые (корпускулярные)инактивированные физическими или химическими факторами клетки возбудителя Химические- химически извлеченные молекулярные антигены микроорганизма;- анатоксины СовременныеИскусственные антигены;Генно-инженерные;Компонентные(по отдельным компонентам);Рибосомальные;ДНК-вакцины;Антиидиотипические 1.Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий. Примером таких вакцин являются БЦЖ и вакцина против натуральной оспы человека 2.Инактивированные (убитые) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины). В препараты иногда добавляют консерванты и адьюванты. Молекулярные вакцины – в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант. Корпускулярные вакцины – содержащие в своем составе протективный антиген 3.Анатоксины относятся к числу наиболее эффективных препаратов. Принцип получения – токсин соответствующей бактерии в молекулярном виде превращают в нетоксичную, но сохранившую свою антигенную специфичность форму путем воздействия 0.4% формальдегида при 37t в течение 3-4 недель, далее анатоксин концентрируют, очищают, добавляют адьюванты. 4.Синтетические вакцины. Молекулы эпитопов сами по себе не обладают высокой иммуногенностью для повышения их антигенных свойств эти молекулы сшиваются с полимерным крупномолекулярным безвредным веществом, иногда добавляют адьюванты. 5.Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов. Требования, предъявляемые к современным вакцинам: Иммуногенность;Низкая реактогенность (аллергенность);Не должны обладать тератогенностью, онкогенностью; Штаммы, из которых приготовлена вакцина, должны быть генетически стабильны;Длительный срок хранения;Технологичность производства;Простота и доступность в применении. Свойства вакцин.Основным свойством вакцин является создание активного поствакцинального иммунитета. Вакцинальный процесс при введении живых вакцин сводится к размножению и генерализации аттенуированного штамма в организме привитого и вовлечению в процесс иммунной системы. Хотя по характеру поствакцинальных реакций при введении живых В. вакцинальный процесс и напоминает инфекционный, однако он отличается от него своим доброкачественным течением. Живые вакцины обычно используют однократно, неживые - чаще двукратно или трехкратно. Поствакцинальный иммунитет сохраняется после первичной вакцинации 6-12 мес. (для слабых вакцин) и до 5 и более лет (для сильных вакцин); поддерживается периодическими ревакцинациями. |