Вопросы и ответы фармтехнология. Непрерывный и периодический технологический процесс
 Скачать 6.32 Mb.
|
|
иммунизирующих молекул, синтезированных по принципу природных аналогов: · Конъюгированные антигены (гаптен-носитель); · Синтетические белки; · Синтетические полиаминокислотные антигены; · Конъюгенты синтетических полиаминокислотных антигенов с синтетическими адъювантами; · Синтетические полисахариды. II. Из искусственных иммунизирующих молекул, не имеющих аналогов в природе: · искусственные комплексы или конъюгенты антигенных детерминант с синтетической неприродной молекулой с иммуномодулирующим действием. Принципиальная новизна современного этапа конструирования вакцин -начато создание искусственных макромолекул, обладающих необходимыми антигенными детерминантами.иммуногенность вакцин можно увеличить, используя специальные адъювантыВ качестве носителя антигенной детерминанты, обладающего свойствами адъюванта, можно использовать такие неприродные полимерные объединения, как, например, поливинилпириды (класс синтетических полуэлектролитов). Они усиливают функцию Т-хелперов и способствуют взаимодействию В- и Т-лимфоцитов, увеличивая число антителобразующих клеток. На основе конъюгации синтетических антигенных детерминант (бактериальных и вирусных) с синтетическими носителями (МДП) созданы первые полностью синтетические вакцины против дифтерийного токсина, стрептококков, вируса гриппа, вируса гепатита В. Получены синтетические антигены вируса ящура. 152. Получение химических вакцин методами генно-инженерной технологии. Этапы серийного производства химических вакцин. Векторные (рекомбинантные) вакцины. Контроль качества вакцинных препаратов. Этапы контроля. Химические вакцины(ХВ) создаются из антигенных компонентов, извлеченных из микробной клетки (ацеллюлярная вакцина против коклюша, коньюгированная вакцина против гемофильной инфекции и др.). Выделяют антигены, опр-ие иммуногенные хар-ки м/о. Этот тип вакцин называют молекулярными вакцинами. К ХВ относятся также вакцины, полученные из растворимых дериватов микробной клетки (токсинов). ХВ могут быть получены методами биосинтеза и химическим синтезом. Для создания химических вакцин необходимо знать локализацию и иммуногенные свойства антигенных детерминант вирусных белков, их первичную структуру. Получение ХВ методами генно-инженерной технологии состоит из следующих этапов: синтез генов комплементарных кДНК и РНК вирусов, кодирующих выработку протективных антигенов; вычленение гена рестриктазами и эндонуклеазами; химико-ферментативный синтез искусственного гена, кодирующего протективный антиген (- это совокупность антигенных детерминант ( эпитопов), которые вызывают наиболее сильный иммунный ответ, что предохраняет организм от повторного инфицирования данным возбудителем.)или ряд протективных антигенных детерминант; встройка гена в экспрессирующий про- и эукариотический вектор (плазмиды, фаги, вирусы); трансформация клеток-реципиентов и отбор клонов, продуцирующих протективный антиген, и испытание рекомбинантных вирусов в качестве вакцины; культивирование клеток, продуцирующих протективные антигены, и конструирование вакцины. Вся работа по производству вакцин проводится в асептических условиях. По иммуногенности современные ХВ уступают живым и убитым вакцинам, но в то же время они обладают преимуществами: нет опасности реверсии, менее реактогенны, более стандартны, менее опасны побочным действием. В отличие от корпускулярных, ХВ вызывают защиту против определенных патогенных субстанций возбудителя, и не содержит избыточного количества балластных структур. Существенным преимуществом ХВ-возможность конструирования на их основе многокомпонентных препаратов против инфекц.заболеваний. Осн. недостаток ХВ - их действие направлено на предотвращение заключительного этапа инфекц. процесса. Создание антитоксического иммунитета не защищает от начальных стадий инфекционного процесса: колонизация бактериями входных ворот и инвазии во внутреннюю среду организма.Для повышения иммуногенности химических вакцин применяют адъюванты, (гели неорганических солей алюминия, синтетический аналог компонента клеточной стенки бактерий (мурамилдипептид), адъювант Фрейнда). Этапы серийного производства химических вакцин: 1. Наработка биомассы клеток возбудителя.2. Выделение протективного антигена путем дезинтеграции клеток или экстракции с использованием органических растворителей.3. Очистка антигена.4. Стерилизация вакцины.5. Стандартизация и контроль качества вакцины. Векторные (рекомбинантные) вакцины Вакцина рекомбинантная – вакцина, изготовленная на основе штамма микроорганизма, в который методами генетического переноса переданы гетерологичные фрагменты ДНК (РНК) прокариотов или эукариотов. Его преимущества перед применением обезвреженного вируса или белков оболочки является возможность вводить внутренний белок вируса, который образует комплекс с его ДНК, который в отличие от белков внешней оболочки вируса не изменяется. Перед использованием в клинической практике метода «генной вакцинации» необходимо убедиться, что плазмиды не будут встраиваться в геном клеток человека, повышая опасность онкологических заболеваний.Это вакцины, получают методами генной инженерии: гены вирулентного микроорганизма, отвечающий за синтез протективных антигенов, встраивают в геном какого-либо безвредного микроорганизма, который при культивировании продуцирует и накапливает соответствующий антиген. Для производства рекомбинантных вакцин применяют рекомбинантную технологию, встраивая генетический материал микроорганизма в дрожжевые клетки, продуцирующие антиген. После культивирования дрожжей из них выделяют нужный антиген, очищают и готовят вакцину (вакцина против гепатита В). К достоинствам этих вакцин относится возможность создания поливалентных вакцинных препаратов на основе объединения участков ДНК различных патогенов «под эгидой» ДНК вируса осповакцины. Открывается возможность одномоментной комплексной иммунизации. Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого- либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду, представляющую собой небольшую стабильную молекулу кольцевой двухцепочечной ДНК, способной к репликации в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, необходимые для экспрессии этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для биосинтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, что бы получить большое количество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от др. молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, приводящее к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека. Проводившиеся исследования подтвердили способность ДНК-вакцин формировать иммунитет в отношении разнообразных возбудителей. ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными. Способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных протеинов.. Введение ДНК-вакцин приводит к синтезу клетками вирусных антигенов в их нативной форме. Способствует выработке цитотоксических Т-лимфоцитов. Инактивированные или субъединичные вакцины индуцируют гуморальный иммунный ответ. Это обусловлено тем, что характер механизмов представления и распознавания антигенов клетками иммунной системы зависит от того, синтезируется антиген в клетке или поступает в нее извне, а от этого зависит характер активации и взаимодействия клеток, участвующих в иммунном ответе. Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез иммуногенных белков клетками самого организма, они способствуют формированию гуморального и клеточного иммунитета. Активация цитотоксических Т-лимфоцитов без введения живого патогена является важнейшей отличительной чертой ДНК-вакцин.Могут избирательно воздействовать на разные субпопуляции Т-лимфоцитов. Способствуют формированию длительного иммунитета.Устраняют риск инфицирования. ДНК-вакцины высокостабильны: способны выдерживать высокие и низкие температуры, разные условия влажности, поэтому генные вакцины не требуют создания холодовых цепочек. Это качество обеспечивает их значительные преимущества перед др. вакцинами, т.к. на поддержание холодовых цепочек приходится около 80 % стоимости проведения вакцинации. Контроль качества вакцинных препаратов "Идеальной" вакцин мог бы считаться препарат, обладающий качествами: 1. полной безвредностью для привитых, а в случае живых вакцин – и для лиц, к которым вакцинный микроорганизм попадает в результате контактов с привитыми; 2. способностью вызывать стойкий иммунитет после минимального количества введений (не более 3); 3. возможностью введения в организм способом, исключающим парентеральные манипуляции; 4. достаточной стабильностью, чтобы не допустить ухудшения свойств вакцины при транспортировке и хранении в условиях прививочного пункта; 5. умеренной ценой, которая способствовала массовому применению вакцины. Контроль качества вакцинных препаратов Этапы контроля В процессе производства традиционных вакцин контролируют: - нативную взвесь на стерильность, иммуногенность и густоту; - разведенную вакцину на стерильность и густоту. При контроле готовых препаратов оценивают: - растворимость (для сухой вакцины), гомогенность (при добавлении растворителя);- стерильность (оценивают методом посева на питательные среды);- содержание фенола;- безвредность;- иммуногенность; - переносимость; - правильность этикетирования и упаковки. 153. Анатоксины. Особенности получения бактериальных анатоксинов. Ассоциированные вакцины (АКДС). Анатоксины (anatoxinum от греч.— «an» — отрицание и toxo» — отравляю) представляют собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Цель применения анатоксинов — индукция иммунных реакций, направленных на нейтрализацию токсинов; в результате иммунизации синтезируются нейтрализующие AT (антитоксины). Анатоксины применяются для профилактики и реже для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций. Анатоксины представляют собой полностью обезвреженные бактериальные экзотоксины. Детоксикация токсинов, проводимая химическими и/или физическими методами, должна обеспечивать сохранение их антигенной активности и гарантировать отсутствие реверсии токсических свойств. Анатоксины должны быть максимально очищены от балластных примесей методами, обеспечивающими сохранность их антигенной активности. Жидкие лекарственные формы адсорбированных вакцин и анатоксинов не должны содержать неразбивающихся частиц. Метод получения анатоксина предложил в 1923 году крупнейший французский ученый Рамон (G. Ramon). При приготовлении анатоксинов культуры бактерий — возбудителей токсинемических инфекций, продуцирующих экзотоксины, выращивают в жидких питательных средах (реакторах большой емкости) для накопления токсина. Затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных тел. К фильтрату добавляют 0,3—0,4 % —формалина и помещают в термостат при температуре 37°—40°С на 3—4 недели до полного исчезновения токсических свойств. Полученный анатоксин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Такие препараты получили название нативных анатоксинов, т. к. они содержат большое количество веществ питательной среды, которые являются балластными и могут способствовать развитию нежелательных реакций организма при введении препарата. В настоящее время применяются преимущественно очищенные анатоксины, для чего нативные анатоксины подвергают обработке различными физическими и химическими методами (ионнообменной хромотографии, кислотному осаждению и др.), чтобы освободить от всех балластных веществ и сконцентрировать препарат в меньшем объеме. Вакцина АКДС проходит в международной номенклатуре как DTP. Расшифровывается аббревиатура просто – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина. Данный препарат является комбинированным, и применяется для борьбы с, соответственно, дифтерией, коклюшем и столбняком. На сегодняшний день имеется выбор данных вакцин – отечественный препарат АКДС или Инфанрикс. Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов и позволяющие проводить иммунизацию против нескольких инфекций одновременно. Если в препарат входят однородные антигены, то такую ассоциированную вакцину называют поливакциной. Если же ассоциированный препарат состоит из разнородных антигенов, то его целесообразно называть комбинированной вакциной. Возможна так же комбинированная иммунизация, когда одновременно вводят несколько вакцин в различные участки тела, например, против оспы (накожно) и чумы (подкожно). Примером поливакцины можно считать живую полиомиелитную поливакцину, содержащую аттенуированные штаммы вируса полиомиелита I, II, III типов. Примером комбинированной вакцины является АКДС, куда входят инактивированная корпускулярная коклюшная вакцина, дифтерийный и столбнячный анатоксин. Комбинированные вакцины применяются в сложной противоэпидемической обстановке. В основе их действия лежит способность иммунной системы отвечать на несколько антигенов одновременно. 154. Фармацевтический тест «Растворение». Приборы и аппараты «вращающаяся корзинка», «вращающаяся лопасть». Автоматизированные системы и приборы для определения скорости растворения и высвобождения лекарственных веществ из лекарственных форм: ТЕСТ «РАСТВОРЕНИЕ» И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ Одним из важнейших критериев качества твердых пероральных ЛФ (таблетки, драже, капсулы, гранулы) является тест «Растворение». Тест «Растворение» предназначен для оп- ределения количества ФС, которое в условиях, указанных в частной фармакопейной статье, за определенный промежуток времени должно высвобождаться в среду растворения из твердой дозированной формы. Тест «Растворение» для твердых пероральных ЛФ использу- ется в следующих случаях: - для определения скорости высвобождения ФС из ЛП; - при разработке ЛП с целью выбора оптимальной ЛФ; - для оценки биофармацевтических свойств ЛП с модифицированным и контролируемым высвобождением; - для оценки стабильности ЛП; - для проверки качества готового ЛП как в процессе его производства, так и при обра- щении на фармацевтическом рынке; - для гарантии неизменности качества ЛП, кроме тех случаев, когда изменения в техно- логии производства ЛП приводят к изменению механизма высвобождения; - для текущего контроля качества таблеток и капсул, обеспечения однородности внутри серий, выявления фальсифицированных препаратов. Цель теста – установить скорость и степень высвобождения ФС из ЛП[101]. Скорость растворения зависит от свойств ЛП и перемешивания в сосуде растворения; скорость уста- навливается на основе результатов растворения известных ЛП. Аппараты Приборы для определения скорости растворения. Используют отечественный прибор «вращающаяся корзинка» 545-АК-7, прибор фирмы «Эрвека», приборы «вращающаяся корзинка» и «лопастная мешалка», предлагаемые ОФС 42-0003-00 «Растворение». Прибор 545-АК-7 (рис. 46) устроен и работает следующим образом: на основании (1) установлен термостатированный сосуд (2), в который помещается химический стакан (3) для растворителя (объем до 1 л). Требуемая температура (37 ± 1,0 °С) обеспечивается с помощью контактного термометра (4). Основной рабочей частью прибора является цилиндрической формы сетчатая корзинка (5) с определенным диаметром отверстий, в которую помещается испытуемый образец. Вращение корзинки осуществляется от электромотора (6) через ступенчатые шкивы (7) ременной передачей. Привод укреплен на колонке (8), стоящей на основании (1). Привод прибора обеспечивает частоту вращения корзинки в пределах 50, 100, 150 и 200 мин -1 и поддерживает ее с точностью ±5%. Перед началом работы термостат наполняют водой очищенной. Сосуд заполняют водой очищенной или другим растворителем, указанным в частных статьях (0,1 н. кислота хлороводородная, 0,1 и. раствор натрия гидроксида, буферные среды с различными значениями рН и др.). Испытуемый образец – таблетку помещают в сухую корзинку, которую опускают в среду растворения так, чтобы расстояние от дна сосуда было 20 ± 2 мм, сосуд закрывают крышкой, затем приводят корзинку во вращение, режим которого обусловлен в частной статье или составляет 100 мин -1 Рис. 46. Прибор «вращающаяся корзинка» типа 545-АК-7 (Л.А. Иванова, 1991) Через 45 мин или время, указанное в частных статьях, пипеткой отбирают пробу раствора, который затем фильтруют через фильтр «Владипор» марки МФА-2А- № 2 (ТУ6- 05-221-483-79) или «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм. В фильтрате определяют содержание вещества, перешедшего в раствор. Для каждой серии (из 5 таблеток) рассчитывают количество вещества, перешедшего в раствор (в процентах от содержания в таблетке). Прибор фирмы «Эрвека» (рис. 47) для определения скорости растворения имеет специальный сосуд (1) для среды растворения. Сосуд сделан из нейтрального стекла, его высота составляет 16 см, внутренний диаметр – 10 см номинальный объем – 1000 мл. Сосуд покрыт крышкой (2), имеющей четыре отверстия: через центральное проходит ось мотора с корзинкой (3), в одно помещают термометр (7), а два других используются для взятия пробы на анализ и восполнения адекватного количества растворяющей среды. Сосуд помещают в термостат (4), снабженный электронагревателем воды (5), мешалкой и контактным термометром (6). Рис. 47. Прибор «вращающаяся корзинка»фирмы «Эрвека» (Л.А. Иванова, 1991) Фирма «Эрвека» выпускает прибор, в котором производится растворение одновременно 6 образцов. Прибор состоит из 6 колб по 1000 мл для растворения, помещенных в общую водяную баню. Платформа поддерживает 6 корзинок и их моторчики. Общий мотор приводит в движение корзинки (постоянная скорость их вращения обеспечивается тахиметрическим генератором). Прибор «лопасная мешалка», предлагаемый ОФС 42-0003-00 отличается от аппарата «вращающаяся корзинка», описанного выше, использованием определенной формы и размера лопастной мешалки, которая вместе с вращающимся валом обеспечивает перемешивание среды растворения. Металлическая мешалка и металлический стержень представляют собой единый элемент и могут быть покрыты инертным материалом (например, тефлоном). При работе с приборами «вращающаяся корзинка» и «лопасная мешалка», предлагаемыми ОФС 42-0003-00 в качестве растворяющей среды могут применяться вода очищенная, растворы кислоты хлористоводородной с различными значениями рН (допустимое отклонение значений рН ± 0,05). В отдельных случаях могут быть использованы водные растворы с добавлением ферментов, ПАВ (например, натрия додецилсульфат, твин-80 и др.) в низких концентрациях. Объем среды растворения, если нет других указаний в частных статьях, обычно составляет 900 мл, но не может быть менее 500 мл. Температура среды растворения 37 ± 0,5 °С, если нет других указаний в частных статьях. Скорость вращения должна быть 100 об./мин (вращающаяся корзинка) или 50 об/мин (лопастная мешалка). Допустимое отклонение скорости вращения от заданной ± 2 об./мин. При использовании прибора «вращающаяся корзинка», если нет других указаний в частной статье, помещают одну единицу лекарственной формы в сухую корзинку. Корзинку опускают в сосуд со средой растворения так, чтобы до дна сосуда было 25 ± 2 мм, обращая внимание на отсутствие пузырьков воздуха на поверхности лекарственной формы, и включают аппарат. При использовании прибора «лопастная мешалка», если нет других указаний в частной статье, одну единицу лекарственной формы помещают непосредственно в сосуд со средой растворения до начала вращения мешалки. В отдельных случаях для предотвращения всплытия испытуемый образец может быть зафиксирован в сосуде с помощью инертной металлической проволоки или каким-либо другим способом. |