Вопросы и ответы фармтехнология. Непрерывный и периодический технологический процесс
 Скачать 6.32 Mb.
|
|
Пути создание высокоактивных штаммов продуцентов антибиотиков с помощью рДНК-биотехнологии. технология рДНК: с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой. Схема промышленного биотехнологического производства антибиотиков Процесс промышленного производства антибиотиков включает следующие стадии: 1) подготовка питательно среды: применяют твердые питательные среды – агаризованные или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т.п.) и жидкие питательные среды. 2) Подготовка посевного материала (продуценты-мутанты колба на качалке первый инокулятор (10 л) второй инокулятор (100–500 л) ферментер). 3)Ферментация: методы поверхностного и глубинного культивирования. В ходе ферментации культура непрерывно аэрируется стерильным подогретым воздухом.Процесс ферментации осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре, носит выраженный двухфазный характер. 4) Выделение антибиотиков.Если антибиотик находится в клетках, на первом этапе обработки биомассу выделяют из культуральной жидкости (фильтрацией или центрифугированием); после разрушения клеток антибиотик экстрагируют и переводят в растворимую фазу. Затем данный раствор и культуральные среды (если антибиотик выделяется из клеток в среду) подвергают разным методам экстракции, разделения, очистки и концентрирования для получения готового продукта. Цель всех процедур постферментационной стадии – получение стерильных препаратов высокой степени чистоты. 5) Очистка антибиотиков. включает в себя: осаждение, сорбцию, сушку. Помимо традиционных экстракционных и сорбционных методов исп. мембранные технологии. При обезвоживании препаратов антибиотиков используют лиофильную или распылительную сушку. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением условий, гарантирующих стерильность. 6) Получение готового продукта: при выделении, очистке и получении ЛФ также соблюдаются максимально возможные предосторожности против контаминации.Биологический контроль-степень стерильности препарата. При фармакологическом контроле-испытания препарата на токсичность, пирогенность, токсикогенность и др., оценивают антимикробный спектр препарата, действие на лейкоциты крови, устанавливают максимально переносимую дозу антибиотика, дозы, вызывающие полную и 50 % гибель экспериментальных животных. Готовая форма лекарственного препарата антибиотического вещества поступает к потребителю с указанием биологической активности и даты выпуска. 145.Условия синтеза антибиотиков. Питательные среды. Частные биотехнологии антибиотиков. Схема производства пенициллина. Схема производства цефалоспорина. Схема биотехнологического получения стрептомицина Условия синтеза антибиотиков: Стерильность. Отсутствие посторонней микрофлоры .Для обеспечения стерильности процесса вся аппаратура и коммуникации герметизируются, стерилизуются и держаться под давлением. Питательная среда и воздух для аэрации также стерилизуются. Засев ферментера, отбор проб на анализ проводится в асептических условиях. Питательная среда. в питательной среде должны присутствовать источники азота, углерода, фосфора, предшественники антибиотиков и витамины. К источникам азота относятся: аминокислоты, аммонийные соли и нитраты; к источникам углерода – глюкоза и лактоза; также в питательной среде должны присутствовать сера, магний, марганец, железо, цинк, кобальт. Кроме того, при производстве антибиотиков в состав питательной среды должны входить соевая мука, кукурузный экстракт и жмых масленичных культур. рН. Для бактерий рH питательной среды составляет 7, для грибов – 4,5–5, для актиномицетов – 6,7–7,5. Для большинства известных антибиотиков оптимальная величина рН близка к нейтральной Температура: для биосинтеза пенициллина грибом рода пеницилиум оптимальной температурой является 25–26 С, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами 27–29 С. Перемешивание и аэрация:т.к. продуценты антибиотиков являются аэробами д.б. хорошая аэрация. Назначение аэрации и перемешивания – снабжение культуры кислородом, они способствуют поддержанию мицелия во взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости. Вспенивание. . Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента., в состав среды вводят пеногасители (растительные и животные жиры, минеральные масла, ПАВ). Частные биотехнологии антибиотиков.Схема производства пенициллина Пенициллины относятся к β-лактамным антибиотикам.Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы, представленной тиазолидиновым кольцом, соединенным с β-лактамным кольцом, и имеющим аминогруппы – 6-аминопенициланновая кислота (6-АПК).Для производства пенициллина применяют специально отобранные расы плесневых грибов-суперпродуцентов рода Penicillum crysogenum. применяют биореакторы с механическим перемешиванием. Питательная среда содержит: кукурузный экстракт (2–3 %), глюкозу (2 %) лактозу (1 %), сульфат аммония, фосфаты (0,5–1 %), производные фенилуксусной кислоты (0,3– 0,6 %), гидрол. В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь лактозы с глюкозой (1:1). Глюкоза может снижать биосинтез антибиотика; на средах, содержащих лактозу или сахарозу, биосинтез антибиотика протекает активнее. В качестве источников серы -натрия сульфат и натрия тиосульфат. Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но подавляет биосинтез пенициллина. Эффект торможения биосинтеза снимается добавлением в среду ионов железа. Penicillum crysogenum в качестве источника фосфора может использовать не только фосфаты, но и фитаты. Для стабилизации рН добавляют мел. добавляют в качестве пеногасителя. После стерилизации и охлаждения питательная среды засевается проросшими спорами гриба, аэрируется путем пропускания через нее воздуха и перемешивается с помощью мешалки. Температура в период первой фазы – 30 ºС, во вторую фазу – 20 ºС, рН роста гриба – ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы. Подготовка посевного материала: сначала размножаются споры на пшене во флаконах при 24–25 ºС в течении 4– 5 сут. Полученным споровым материалом засевают инокуляторы, затем посевные аппараты (12–18 ч). В процессе ферментации необходимо соблюдение строгой асептики. После окончания процесса ферментации мицелий гриба отделяют вакуум-фильтрованием или центрифугирование. Осадок на фильтре (мицелий гриба) промывают водой для максимального выхода пенициллина. Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислоты, выделяют экстракцией неполярными органическими растворителями (аминоацетатом, хлороформом, бутилацетатом и др.). Очистку антибиотика проводят путем замены растворителей. Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щелочь. Повторяя эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых и калиевых солей.В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли стабильны в течение длительного времени при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 ч при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением. Схема производства цефалоспорина Из гриба Cephalosporinum acremonium - цефалоспорин С. Его полусинтетические производные получили название цефалоспорины. К ним относятся цефалотин, цефалексин, цефаклор, цефотаксим, цефуроксим, цефоперазон, цефепим, цефтриаксон и др. По химическому строению цефалоспорин относится к β-лактамным соединениям, но β- лактамное кольцо конденсировано не с пяти, а с шестичленным гетероциклом.В процессе развития Cephalosporinum acremonium наряду с цефалоспорином С синтезируется и пенициллин N. Его образование идет тем же путем, что и образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпенициллина через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С. Продуцент целоспоринов может расти на средах, содержащих соевую муку, сухие дрожжи, жмыхи. Кроме того, в питательную среду добавляют аммонийные соли и фосфор, который способствует усвоению углеводов; цинк, марганец, магний, железо, мел. Посевной материал сначала готовят в качалочных колбах, затем переносят в инокулятор, в посевной аппарат большего объема, а после в ферментер (70 ч). Процесс ферментации осуществляется глубинным способом, в условиях постоянной аэрации и непрерывного перемешивания, при температуре 26–28 °С, в течение 7–8 сут. Процесс культивирования осуществляют в асептических условиях. Постферментационная стадия, связанная с выделением и очисткой цефалоспоринов, осуществляется по той же схеме, что и в случае пенициллинов. Схема биотехнологического получения стрептомицина Стрептомицин принадлежит к группе аминогликозидных антибиотиков Стрептомицина сульфат обладает широким спектром антимикробного действия. активен в отношении микобактерий туберкулеза и большинства Гр- и некоторых Гр+ м/о; менее активен в отношении стрептококков, пневмококков; не действует на анаэробы, риккетсии и вирусы. Действует бактерицидно.Для производства применяют штамм актиномицета Streptomyces griseus, образующего воздушный мицелий и спор. В качестве основы питательных сред -гидролизаты растительных и животных белков. Основными компонентами питат. сред, - являются: соевая мука, гидрол и аммонийные соли. Для стабилизации признаков, связанных с антибиотикообразованием, при хранении и поддержании штамма в среды добавляют антимутагены (пуриновые нуклеотиды, ионы марганца, L-метионины, гистидин, полиамины, кофеин и др.). Среду стерилизуют при 120 ºС, охлаждают и засевают посевным материалом. При развитии продуцента различают 2 стадии. 1-происходит быстрый рост и развитие микроорганизма с энергичным использованием основных компонентов субстрата, максимальное потребление кислорода. стрептомицин синтезируется в незначительном количестве. Через 28 ч масса мицелия прекращает увеличиваться, начинается вторая стадия, связанная с образованием стрептомицина. Хар. медленным потреблением оставшихся в среде питательных веществ, замедлением роста актиномицета, снижением потребления кислорода, автолизом мицелия, максимальным образованием стрептомицина. Максимальное накопление стрептомицина наблюдается, когда автолитические процессы начинают преобладать над процессами роста. Культивирование проводится при 27 – 29 ºС и сопровождается аэрацией, рН 7,5 – 8,0 и перемешиванием.В культуральной жидкости находятся минеральные вещества, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, полисахариды, жиры, стрептомицин и др. С целью извлечения стрептомицина из культуры продуцента культуральную жидкость вместе с биомассой обрабатывают минеральной кислотой. При этом весь антибиотик переходит в раствор. Мицелий отделяют фильтрованием или центрифугированием. Свободную от мицелия культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. При этом достигается удаление белков и органических оснований, ионов металлов (кальция, магния, железа). Далее ведется выделение стрептомицина в чистом виде. Для выделения культуральной жидкости в чистом виде используются методы адсорбции на активированном угле и метод ионообменной хроматографии.В асептических условиях соль стрептомицина растворяют в воде, пропускают через бактериальный фильтр для удаления микроорганизмов, лиофильно высушивают, измельчают в порошок и фасуют. 146. Пути получения новых антибиотиков. Усовершенствование производства антибиотиков. Биотехнологическое получение интерферонов Пути получения новых антибиотиков Новые антибиотики можно получить путем генно-инженерных манипуляций с генами, участвующими в биосинтезе известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе, которого получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика. Одна из плазмид Streptomyces, pIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК Streptomyces coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков. Целую плазмиду и различные субклоны, несущие части 32,5 т.п.н. фрагмента, вводили или в штамм АМ-7161 Strept. sp., синтезирующий родственный антибиотик медермицин, или в штамм В1140 или Tu22 Strept. violaceoruber, синтезирующие родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин. Все указанные антибиотики являются кислотно-щелочными индикаторами, которые дают растущей культуре характерный цвет, зависящий от рН среды. рН (и цвет) среды зависят от того, какое соединение синтезируется. Мутанты родительского штамма Strept. coelicolor, не способные синтезировать актинородин, бесцветные. Появление окраски после трансформации штамма АМ-7161 Strept. sp. либо штаммов В1140 или Tu22 Strept. violaceoruber плазмидой, несущей все или несколько генов, кодирующих ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе нового антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Strept. sp. и штамма В1140 Strept. violaceoruber, содержащие плазмиду pIJ2303, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и хромосомной ДНК. Однако при трансформации штамма Tu22 Strept. violaceoruber плазмидой pIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик – дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Strept. sp. плазмидой pIJ2315 синтезируют еще один новый антибиотик – медерорродин А. В структурном отношении эти новые антибиотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гарнатицина и гидрогранатицина, вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента др. пути. Когда будут детально изучены биохимич. свойства различных путей биосинтеза антибиотиков, появится возможность создавать новые уникальные высокоспецифичные антибиотики, манипулируя генами, которые кодируют соответствующие ферменты. Усовершенствование производства антибиотиков С помощью методов генетической инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличить эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces spp. его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Для того, чтобы решить эту проблему, можно: 1. изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces; 2. применяя методы генетической инженерии, создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти 2 подхода не исключают друг друга. Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки (аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину). Ген «гемоглобина» Vitreoscilla выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходится примерно 0,1 % всех клеточных белков Strept. coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки Streptomyces coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода (5 % от насыщающей концентрации), синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы, чем нетрансформированные. Этот подход можно применять для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. Интерфероны ( ИФН) – группа биологически активных белков или гликопротеинов, синтезируемых клетками организма в ответ на воздействие (индукцию) различными агентами – интерфероногенами, которыми могут быть вирусы, бактерии и продукты их метаболизма, а также другие антигены и митогены. 1.Обладает антивирусным действием.2. Интерферон вызывает ингибирование клеточного роста (используется как противоопухолевое средство3. Интерферон оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз, 4. Интерферон обладает антимикробной активностью5. Оказывает радиозащитное действие6. Интерферон является иммуномодулятором – т. е. регулирует иммунологические реакции, стимулирует иммунную систему организма.В зависимости от происхождения ИНФ разделяют на несколько видов. Различают α-, β-, γ-интерфероны. Расшифровка структурных генов позволила получить рекомбинантный интерферон. По химическому составу α-ИНФ является белком, а β, γ- интерфероны – гликопротеины. Биотехнология производства IFN Этапы на примере получения α-IFN 1. Суспензию лейкоцитарных клеток, выделенных из крови доноров, обрабатывают вирусом, оказывающим индуцирующий эффект на биосинтез IFN (н-р, вирусом Сендай).2. Из лейкоцитов получают и-РНК, которая программирует биосинтез интерферона, при этом концентрация и-РНК в индуцированных лейкоцитах не более 0,1%.3. С помощью фермента обратной транскриптитазы (ревертазы) на полипептидной основе и-РНК синтезируют комплементарную ей одноцепочечную копию ДНК.4. Эукариотический ген в условии in vitro перестраивают, удаляя рестриктазой ту часть нуклеотидов, которая кодирует ненужную информацию.5. Созданный ген переносят в плазмиду, где он совмещается с бактериальным промотором, а затем вводится в бактериальную клетку-хозяин. Таким образом создан штамм-продуцент E. coli, синтезирующий IFN в высоких концентрациях. В 1л полученной бактериальной суспензии содержится около 5 мг α-IFN, что в 5тыс. раз больше того количества, которое можно получить из 1л донорской крови. Существуют другие способы получения интерферона:1. На основе сконструированных рекомбинантных ДНК, экспрессируемых в клетках E. coli (α, β, α-IFN).2. Возможен синтез химическим путем β и α- интерферона3. Повышение биосинтеза IFN возможно при введении в эукариотическую дрожжевую клетку вектора, на основе которого сконструирована рекомбинантная молекула ДНК с ионами β и α- интерферонов4. Производство IFN с применением моноклональных антител к соответствующему IFN. |