Главная страница
Навигация по странице:

  • Проведение культуральных методов диагностики туберкулеза в ПТО

  • Основные биохимические тесты идентификации М. tuberculosis

  • Проведение культуральной диагностики туберкулеза на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960 с использованием жидких сред в лабораториях ПТО

  • Проведение молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и определения лекарственной чувствительности (GenoType ® MTBDR и Xpert MTB/RIF)

  • Генно-молекулярная технология Xpert MTB/RIF

  • приказ № 19. Об утверждении Инструкции по организации и осуществлению профилактических мероприятий по туберкулезу Общие положения


    Скачать 0.87 Mb.
    НазваниеОб утверждении Инструкции по организации и осуществлению профилактических мероприятий по туберкулезу Общие положения
    Дата11.10.2018
    Размер0.87 Mb.
    Формат файлаdoc
    Имя файлаприказ № 19.doc
    ТипДокументы
    #53088
    страница11 из 12
    1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12

    Градация результатов микроскопического исследования

    Результат
    исследования

    Количество полей
    зрения (п/з),
    для просмотра

    Форма

    записи
    результата

    Интерпретация
    результата
    исследования

    КУБ не обнаружены
    в 300 п/з

    300

    отр

    Отрицательный

    1-9 КУБ в 100 п/з

    100

    Точное количество КУБ в 100 п/з

    Положительный

    10-99 КУБ в 100 п/з

    100

    1+

    Положительный

    1-10 КУБ в 1 п/з

    50

    2+

    Положительный

    Более 10 КУБ в 1 п/з

    20

    3+

    Положительный

    Приложение 17

    к Инструкции по организации

    и осуществлению профилактических

    мероприятий по туберкулезу
    Проведение культуральных методов

    диагностики туберкулеза в ПТО


    1. Культуральные исследования диагностического материала осуществляются на плотных яичных средах Левенштейна-Йенсена.

    2. Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, имеют степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ).

    3. Поступивший в лабораторию материал до начала исследований регистрируется в лабораторном регистрационном журнале. Каждому образцу присваивается один регистрационный лабораторный номер для всех видов исследований.

    4. Перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание).

    5. Биологические жидкости и ткани не нуждаются в деконтаминации, при взятии в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики: спинномозговая, синовиальная и другие жидкости из закрытых полостей; костный мозг; гной из "холодных" абсцессов; резецированные ткани (за исключением материала аутопсии); пунктаты печени и лимфатических узлов и материалы биопсий (при отсутствии свища).

    6. Деконтаминация мокроты проводится двумя способами:

    1) раствором щелочи NaOH, с добавлением равного количества (2,9% раствора цитрата натрия + раствора NALC). Процедура деконтаминации проводится в соответствии с руководством производителя ВАСТЕС. Далее пробирки центрифугируют в центрифуге с охлаждением при 3000-3500g в течение 20 минут. После центрифугирования пробирки помещают в шкаф безопасности II класса и оставляют на 5 минут для осаждения аэрозоля. Надосадочная жидкость (супернатант) аккуратно сливается в емкость с дезинфицирующим раствором, к осадку добавляют 0,8-1,0 мл стерильного фосфатного буфера стерильной пастеровской пипеткой. Осадок аккуратно ресуспендируют с помощью пипетки, избегая интенсивного перемешивания, и производят посев;

    2) 4% раствором едкого натра (модифицированный метод Петрова) согласно утвержденным стандартам.

    7. Инкубация МБТ на плотной питательной среде проводится в течение 8 недель.

    8. Оценка результатов посева диагностического материала проводится по следующим параметрам:

    появление роста – срок появления;

    интенсивность роста – число колоний;

    загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;

    отсутствие роста.

    Во время еженедельных просмотров загрязненные пробирки (пророст) удаляются и уничтожаются автоклавированием или сжиганием.

    9. Положительный результат посева подтверждается:

    ростом колоний на плотных питательных средах не ранее 3-4 недель инкубации;

    наличием колоний характерной морфологии и окраски;

    микроскопическим подтверждением кислотоустойчивости микроорганизма по Циль-Нильсену из выросшей колонии.

    Интенсивность роста обозначают по 4-х балльной системе:

    Число колоний

    Степень градации

    От 1 до 19

    Указать точное число колоний

    От 20 до 100

    1+

    100-200

    2+

    200-500

    3+

    Более 500

    4+

    Все вышеперечисленные характеристики выросших микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.
    Основные биохимические тесты идентификации М. tuberculosis
    10. Подтверждение принадлежности, выделенной культуры микобактерий к комплексу М. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов, является обязательным.

    11. Первичная идентификация микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивости; температура роста. Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti, от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий применяются следующие основные биохимические тесты:

    тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);

    тест на наличие нитратредуктазной активности;

    тест на наличие термостабильной каталазы;

    тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл) (или рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия).

        1. Для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis учитываются результаты следующих проб:

    ниациновый тест;

    тест на наличие нитратредуктазы;

    тест на наличие пиразинамидазы;

    определение видовой принадлежности молекулярно-генетическим исследованием (Geno Type MTB® DR).

    13. Для определения лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда применяют метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена (далее – Л-Й).

    14. Устойчивость тестируемых штаммов определяется отношением числа колоний, выросших на среде с лекарствами к числу колоний, выросших на среде без лекарств. Этот показатель позволяет узнать процент устойчивых мутантов в общей популяции жизнеспособных колониеобразующих единиц.

    15. Критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й:

    Изониазид - 0,2 мкг/мл; Стрептомицин - 4,0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2,0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1,0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл.

    16. При приготовлении среды с препаратами учитывается активность препарата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой, в зависимости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются производителем.

    17. Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 C, до появления видимого роста на среде без лекарств, затем в течение 4-6 недель с закупоренными пробками.

    18. Интерпретация результатов. Критерием устойчивости является 1,0% роста бактериальной популяции для всех препаратов. Через 4 недели инкубации рост на среде, не содержащей лекарства, инокулированной из суспензии 10-4, сравнивают с ростом на среде с препаратом, инокулированным из суспензии 10-2. Если число колоний больше на среде, содержащей лекарство (равен или превышает 1%), тестируемый штамм считается устойчивым.

    Приложение 18

    к Инструкции по организации

    и осуществлению профилактических

    мероприятий по туберкулезу


    Проведение культуральной диагностики туберкулеза на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960 с использованием жидких сред в лабораториях ПТО

    1. Культуральная диагностика туберкулеза с использованием жидких сред осуществляется на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960. В случае роста МБТ (до уровня 105-106 КОЕ на 1 мл среды) прибор оценивает пробу как положительную и подает световой и/или звуковой сигнал. При отсутствии роста в течение шести недель (42 дня) прибор оценивает пробу как отрицательную.

    2. Посевы на жидкие среды выполняются в ламинарном боксе II класса защиты. Пробирки перед работой маркируют, обращая внимание на то, чтобы маркировочная запись не попала на штрих-код пробирок.

    3. При обнаружении изменений в питательной среде в отрицательных пробирках, готовят мазки для микроскопического исследования и проводят посев материала на кровяной агар (для контроля контаминации) и на среду Л-Й.

    4. Для подтверждения положительных результатов из каждой пробирки MGIT готовят мазки, которые окрашивают по Циль-Нильсену в соответствии с общими рекомендациями. Кислотоустойчивые колонии в виде «кос» подтверждают наличие микобактерий туберкулеза. При обнаружении отдельных кислотоустойчивых бактериальных клеток проводится идентификация культуры.

    5. Если в пробирке, идентифицируемой аппаратом как «положительная», при микроскопии отмечается отрицательный результат, а сама среда при визуальной оценке прозрачная и нет подозрения на контаминацию, пробирку необходимо поместить обратно в систему на 3 дополнительных дня. После этого повторяют микроскопию мазков. При повторном отрицательном результате микроскопии, отсутствии визуальных признаков роста и контаминации пробы (отрицательный рост на кровяном агаре), а также отсутствии признаков роста на среде Л-Й в течение 10 недель, пробу считают отрицательной.

    6. Допустимый уровень контаминации для плотных питательных сред 3-5%, для жидких питательных сред – 7-8%.

    7. Для идентификации видов микобактерий используются следующие критерии:

    1) интенсивность роста: M.tuberculosis, M. bovis и, в определенной степени, M.kansasii растут медленно по сравнению с нетуберкулезными микобактериями;

    2) при росте в жидкой среде МБТ принимают грануловидную форму, большинство нетуберкулезных микобактерий чаще образуют легкую однообразную замутненность среды (кроме M. kansasii);

    3) в мазке, сделанном из положительного бульона MGIТ, микобактерии туберкулезного комплекса образуют ярко выраженные сгустки и змеевидные нити (корд-фактор), тогда как нетуберкулезные бактерии образуют разрозненные небольшие сгустки и нити, либо единичные клетки.

    8. Постановка ТЛЧ:

    1) ТЛЧ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда на аппарате BАСТЕС MGIT – 960 проводятся на основе метода пропорций. Для ТЛЧ используются более низкие концентрации чистых субстанций ПТП, чем на плотных средах (во избежание ложных результатов чувствительности): стрептомицин – 1,0 мкг/мл; изониазид – 0,1 мкг/мл; рифампицин – 1,0 мкг/мл; этамбутол – 5,0 мкг/мл;

    2) засеянные пробирки ставят в специальные держатели для постановки лекарственной чувствительности в строгой последовательности: контроль, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол.

    9. Учет результатов: по завершении теста (14-21 день) на приборе появляется сообщение о готовности результатов. Для их получения сканируют штрих-код держателя и распечатывают отчет, в котором указаны результаты ТЛЧ к каждому лекарственному препарату: чувствительный (S); резистентный (R), результат теста не определен или ошибка (X).

    Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). Показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом оцениваются:

    S – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет не менее 100;

    R – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более;

    Х – неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые влияют на процедуру теста (например, при достижении единицей роста контрольного образца величины > 400 менее чем за 4 дня). В таком случае тест необходимо повторить с чистой, активно растущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis.

    Некоторые лекарственно-устойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо повторить исследование.

    Отчетность: результаты исследования на лекарственную чувствительность передаются в клинические подразделения сразу по мере их готовности. Результат указывается как «чувствительный» или «резистентный» с названием используемого метода, типа лекарственного препарата и его концентрации.

    10. Тесты на чувствительность к пиразинамиду:

    ТЛЧ к пиразинамиду требует соблюдения особых условий к уровню рН среды (in vitro пиразинамид активен только в кислой среде) и для аппарата BАСТЕС MGIT - 960 разработан тест, в котором рН среды не превышает 6,0; концентрация пиразинамида для компенсации рН увеличена до 100 мкг/ мл;

    11. ТЛЧ к препаратам второго ряда.

    Готовые наборы для ТЛЧ к препаратам второго ряда отсутствуют.

    Реагенты: проводится расчет критических концентраций субстанции ПТП второго ряда. Препараты, полученные после разведения дистиллированной водой или соответствующим растворителем, с помощью автоматической пипетки добавляют по 0,1мл (100 мкл) в промаркированные пробирки MGIT. Подготовка культуры для ТЛЧ и сам тест проводится аналогично вышеописанным процедурам постановки к ПТП первого ряда.

    Концентрации ПТП второго ряда: амикацин – 1,0 мкг/мл; капреомицин – 2,5 мкг/мл; офлоксацин – 2,0 мкг/мл; этионамид – 5,0 мкг/мл.

    При расчете учитывается количество активного вещества в 1 г субстанции:

    1) первичное разведение офлоксацина и этионамида проводится диметилсульфоксидом (DMSO).

    2) препараты для хранения дозируются объемом не менее 0,5 мл (3-4 ТЛЧ) с учетом потери при хранении.
    Приложение 19

    к Инструкции по организации

    и осуществлению профилактических

    мероприятий по туберкулезу


    Проведение молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и определения лекарственной чувствительности (GenoType ® MTBDR и Xpert MTB/RIF)
    1. Устойчивость к рифампицину закодирована в единственном гене rpoB, отвечающим за активность РНК, устойчивость к изониазиду контролируется мутациями сразу в четырех генах – katG, inhA, ahpC и oxyR, используется набор GenoType ® MTBDR plus- тест.

    2. Идентификация устойчивости к рифампицину проводится на основании выявления мутаций в гене rpoB (кодирующем бета-субъединицу РНК полимеразы). Идентификация высокого уровня устойчивости к изониазиду проводится на основании выявления мутаций в гене katG (кодирующем выработку каталазы-пероксидазы), тогда как низкий уровень устойчивости к этому препарату выявляется на основании выявления мутаций в регионе промотора гена inhA (кодирующего NADH-Enoyl-АТФ-редуктазу).

    3. Набор GenoType ® MTBDR sl-тест позволяет в течение 2-х дней выявлять мутации в генах МБТ, ответственных за устойчивость к аминогликозидам и фторхинолонам, т.е. выявлять у больных наличие ШЛУ ТБ задолго до получения результатов бактериологического анализа.
    Генно-молекулярная технология Xpert MTB/RIF
    4.Xpert MTB/RIF – полностью автоматизированная система, проводящая реакцию полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, в ходе которой происходит одновременная детекция ДНК MTB комплекса и мутации гена в кодоне rpoB, ассоциированного с резистентностью к рифампицину в течение 2 часов.

    5.Система Xpert MTB/RIF включает в себя компьютер, сканер для считывания штрих-кода и одноразовые картриджи, содержащие в себе реагент для проведения исследований.

    6. Материалы, подлежащие исследованию: мокрота, бронхоальвеолярный смыв, спинномозговая жидкость, лимфатические узлы или другие ткани.

    1. Объем мокроты для исследования – 3-5 мл. Каждый образец должен быть правильно промаркирован, как минимум универсальным идентификационным номером. Этот номер также указывается в лабораторной форме результата исследования и в лабораторном журнале. Образец не должен содержать кусочки пищи или другие плотные включения.

    2. Картриджи для Xpert MTB/RIF и реагенты хранятся при температуре 2–28 C. Картриджи сохраняют свои стабильные свойства до 7 календарных дней после открытия упаковки.

    3. Реагенты и картриджи после истечения срока годности не используются.

    4. Выдача результатов:

    МБТ не обнаружен (отрицательный результат);

    МБТ обнаружен, Rif resistance не обнаружен (положительный результат, рифампицин чувствительный);

    МБТ обнаружен, Rif resistance обнаружен (положительный результат, рифампицин устойчивый);

    МБТ обнаружен, Rif resistance не определен (положительный результат, устойчивость к рифампицину определить не удалось, это свидетельство того, что генетического материала микробной клетки было недостаточно).

    Приложение 20

    к Инструкции по организации

    и осуществлению профилактических

    мероприятий по туберкулезу

    1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12


    написать администратору сайта