Микробиология. Общая микробиология
 Скачать 476.77 Kb.
|
|
Реакция преципитации в геле по Оухтерлони . Для постановки реакции используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток. Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципити-рующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в'вертикальное положение. Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм. Компоненты. Разновидности. Применение. Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности. Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии. Иммуноферментный анализ. Механизм. Компоненты. Применение. Иммуноферментный анализ или метод — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активныхвеществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012г/л). Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти генов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания, А)При определении антител в лунки планшеток с Сорбированным антигеном последовательно добавляют сы воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента. Б)При определенииантигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво ротку против него и вторичные антитела(против диагностической сыворотки),меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента. Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента. Диагностические препараты, содержащие антигены (диагностикумы, эритроцитарные диагностикумы, антигены, аллергены). Получение, применение. В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции. Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства. Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко. В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами. Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. В настоящее время в лабораториях используются следующие диагноста кумы. 1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных. 2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-аптител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных. 3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью. 4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона. 6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллеэной инфекции. 7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеиом S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа. 9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветлення) и инактивируют химическими веществами. Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания. Диагностические сыворотки. Типы диагностических сывороток. Получение и применение. Диагностические сыворотки (диагностикумы) представляют собой взвесь убитых бактерий определенного вида. К диагностическим специфическим сывороткам, применяемым для обнаружения в тех или иных материалах антигенов или для определения вида и даже типа микроба или вируса, относятся агглютинирующие, преципитирующие и лизирующие (комплементсвязывающие). Такая классификация основана на функциональной способности специфических гамма-глобулинов склеивать (агглютинировать), осаждать (преципитировать), растворять (лизировать) соответствующие антигены. Наиболее широко агглютинирующие сыворотки применяют при дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Brucella, Listeria, возбудителей риккетсиозных и вирусных инфекций. Агглютинирующие сыворотки готовят путем гипериммунизации животных различными корпускулярными антигенами, введением их парентеральным путем. В качестве антигенов используют живые или убитые различными способами культуры соответствующих микробов. Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600. Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция. Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Преципитирующие сыворотки предпочтительно готовят для диагностики сибирской язвы. Иммунизируют внутривенным способом лошадей слабовирулентной культурой возбудителя сибирской язвы. Реакции преципитации используют в судебно-медицинской и ветеринарной экспертизе. При ряде инфекционных заболеваний образуются так называемые комплементсвязывающие антитела. При их определении в практике используются специфические диагностические сыворотки, содержащие такие антитела. Показательным примером является приготовление специфических диагностических ящурных сывороток. Идентификацию штамма циркулирующего вируса ящура проводят с помощью реакции связывания комплемента (РСК). Специфическую типовую и вариантную сыворотки получают от морских свинок, которых заражают вирусосодержащей суспензией соответствующего типа, Диагностические комплементсвязывающие сыворотки используются как контрольные при постановке РСК на бруцеллез, сап, кампилобактериоз, вирусные респираторные болезни, грипп и другие бактерийные, вирусные и паразитарные инфекции. При постановке РСК непременным условием является применение в качестве одного из ее компонентов комплемента. Комплемент-- это неспецифический фактор гуморального иммунитета, содержащийся в сыворотках крови теплокровных и холоднокровных животных. Наиболее изучен комплемент морской свинки. Поэтому при постановке РСК в качестве комплемента используют сыворотку крови морских свинок. Живые вакцины, получение, применение. Достоинства и недостатки. Проверка их безвредности, реактогенности и иммуногенности. Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий. Аттенуация (ослабление) возможна путём воздействия на штамм химических (мутагены) и физических (температура) факторов или посредством длительных пассажей через невосприимчивый организм. Так же в качестве живых вакцин используются дивергентные штаммы (непатогенные для человека), имеющие общие протективные антигены с патогенными для человека микробами. Примером такой вакцины является БЦЖ и вакцина против натуральной оспы. Возможно получение живых вакцин генно-инженерным способом. Принцип получения таких вакцин сводится к созданию непатогенных для человека рекмбинантных штаммов, несущих протективные антигены патогенных микробов и способных при введении в орг. человека размножаться и создавать иммунитет. Такие вакцины называют векторными. Вне зависимости от того, какие штаммы включены в вакцины, бактерии получают путём выращивания на искусственных питательных средах, культурах клеток или куриных эмбрионах. В живую вакцину, как правило, добавляют стабилизатор, после чего подвергают лиофильному высушиванию. В связи с тем, что живые вакцины способны вызывать вакцинную инфекцию (живые аттенуированные микробы размножаются в организме, вызывая воспалительный процесс проходящий без клинических проявлений), они всегда вызывают перестройку иммунобиологического статуса организма и образование специфических антител. Это так же может являться недостатком, т. к. живые вакцины чаще вызывают аллергические реакции. Вакцины данного типа, как правило, вводятся однократно. Примеры: сибиреязвенная вакцина, чумная вакцина, бруцеллёзная вакцина, БЦЖ вакцина, оспенная дермальная вакцина. Убитые вакцины. Получение, применение. Достоинства и недостатки. Проверка их безвредности, реактогенности и иммуногенности. Убитые вакцины представляют собой культуру бактерий или вирусов возбудителя, уби- тую тем или иным способом. Для инактивации культуры возбудителя используют физические (нагревание, ультрафиолетовое облучение, ионизирующая радиация) или химические (форма- лин, спирт, фенол) методы. В результате инактивации бактерии и вирусы полностью теряют жизнеспособность, но сохраняют антигенные и иммуногенные свойства. Убитые вакцины можно разделить на две большие группы: корпускулярные и молекулярные вакцины. Действующим началом в корпускулярных вакцинах являются или инактивированные цельные клетки бактерий и частицы вирусов (цельноклеточные, цельновирионные вакцины), или структурные элементы микробов, несущие специфические протективные антигены (суб- клеточные, субвирионные вакцины). Для получения субклеточных или субвирионных вакцин из бактерий или вирусов извле- кают протективные антигены, являющиеся белковыми, липополисахаридно-белковыми ком- плексами. Выделение из бактерий или вирусов протективных антигенных комплексов осуществляют различными физико-химическими методами: осаждением спиртами, высаливанием нейтральными солями, хроматографическими способами, ультрацентрифугированием. В связи с этим субклеточные вакцины раньше называли химическими вакцинами. В состав вакцин на основе протективных антигенов вводят консервант (мертиолят в кон- центрации 1:10 000) и адъюванты. Вакцины из протективных антигенов разработаны против многих бактерийных и вирусных инфекций (брюшнотифозная, дизентерийная, гриппозная, бруцеллезная и др.). Молекулярные вакцины – это препараты, в которых антиген находится в молекулярной форме. Антигены в молекулярном виде получают: а) в процессе биосинтеза при выращивании природных, а также рекомбинантных штаммов бактерий и вирусов; б) химическим синтезом. Типичным примером молекулярных антигенов, образуемых биосинтезом природными штаммами, являются анатоксины (столбнячный, дифтерийный, ботулинический и др.), полу- чаемые из обезвреженных токсинов. Убитые вакцины получают путем культивирования вакцинного штамма в производствен- ных условиях на питательных средах или субстратах, обеспечивающих достаточное накопление вакцинного штамма. Чистую культуру вакцинного штамма инактивируют одним из способов (чаще всего 0,4 % формальдегидом при 37—40 оС в течение 4 нед), очищают от балластных компонентов, дозируют по числу бактерий или вирусов и в большинстве случаев подвергают лиофильной сушке. Вакцину контролируют по основным показателям: остаточной вирулентности, содержа- нию бактерий или вирусов вакцинного штамма, остаточной влажности, стерильности, безвредности, аллергенности, иммуногенности и др. |