Практикум по биофармации А.И. Тихонов 2003 г. — копия. Практикум по биофармации учебное пособие для студентов высших учебных заведений

• Название: Практикум по биофармации учебное пособие для студентов высших учебных заведений
• Дата: 26.04.2022
• Размер: 2.44 Mb.
• Имя файла: Практикум по биофармации А.И. Тихонов 2003 г. — копия.rtf
• Тип: Практикум; #497891
• страница: 2 из 15

АЛГОРИТМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВЛИЯНИЯ СТЕПЕНИ ДИСПЕРСНОСТИ СТРЕПТОЦИДА НА ПРОЦЕСС ЕГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ИЗ МАЗЕЙ МЕТОДОМ «АГАРОВЫХ ПЛАСТИНОК*



Приготовление геля и агаровых пластинок

Агаровый гель готовят 2 % концентрации в предвари­тельно старированном стеклянном стакане, плотно закры­том крышкой. Измельченный агар (ГОСТ 6470 - 53) за­ливают водой очищенной и оставляют на 30 мин для набу­хания.

Набухший агар нагревают до кипения, доводят до не­обходимой массы и к теплому гелю добавляют 5 % реакти­ва Эрлиха. Состав реактива Эрлиха: п-диметиламинобенз­альдегида 0,5 г, концентрированной кислоты хлороводо­родной и этанола 95 % по 15 мл, н-бутанола 90 мл.

Приготовленный агаровый гель разливают в чашки Петри (диаметр 98-100 мм, высота 20 мм), которые рас­ставляют на столе, предварительно выверенном по гори­зонтальному уровню с помощью ватерпаса. Агар разлива­ют в чашки двумя порциями по 10 и 15 мл. После застыва­ния первой порции агара на ее поверхность в каждую чаш­ку помещают три цилиндра из нержавеющей стали или стекла (наружный диаметр 8 мм, высота до 10 мм) и зали­вают второй слой агара. После застывания агара цилиндры осторожно вынимают.

Технология мазей

Для получения фракций различной степени дисперс­ности 50 г стрептоцида просеивают через набор сит, отде­ляя частицы размером 0,38 мм. Стрептоцид с частицами менее 0,38 мм дополнительно измельчают в ступке с 95 % спиртом в течение 10 мин и просеивают через сита, отби­рая фракцию с размером частиц 0,1 мм.

Мази готовят 10 % концентрации с использованием лю­бой имеющейся в наличии мазевой основы (например, вазе­лина), часть которой предварительно подплавляют и смеши­вают с определенной фракцией стрептоцида. Во избежание нежелательного дальнейшего измельчения частиц дисперс­ной фазы, мазевую основу подплавляют и смешивают с ве­ществом, используя пропеллерную мешалку (1500 об/мин).

При отсутствии пропеллерной мешалки мазь можно приготовить следующим образом: в ступку помещают стрептоцид с определенным размером частиц и смешива­ют по правилу Дерягина с половинным количеством рас­плавленной основы, а затем добавляют оставшуюся нерас­плавленную основу и перемешивают.

Определение скорости высвобождения
лекарственных веществ из мазей

Мази, содержащие лекарственное вещество с различ­ной степенью дисперсности, помещают в лунки двух ча­шек с агаром. Чашки нумеруют или указывают степень из­мельчения. Мазь в лунки вносят с помощью стеклянной палочки, осуществляя контроль за тем, чтобы был хоро­ший контакт с агаром. Чашки помещают в термостат с тем­пературой 37 °C.

Лекарственное вещество, высвобождаясь из мази, диф­фундирует в агаровый гель, взаимодействуя с реактивом Эрлиха и образуя окрашенную зону. Через 0,5; 1; 2 часа с помощью линейки измеряют диаметр окрашенной зоны. В случае образования эллипса измеряют больший и мень­ший диаметр и определяют среднее значение диаметра ок­рашенной зоны.

Статистическую обработку полученных результатов проводят по методу Монцевичюте-Эрингене.

Ошибку среднего арифметического вычисляют по фор­муле:

т - ± Z а • k, где т — ошибка среднего арифметического диаметров ок­рашенных зон;

Z — сумма;

а — цифровые значения отклонений диаметров зон от среднего арифметического со знаком «плюс» или «минус»;

k — величина, зависящая от числа вариантов, т. е. ко­личества опытов (п) для каждого образца мази (табл. 1).

Пример расчета

Мазь № 1. (d = 0,1 мм).

1 час

d. - 20 мм

20 + 20 + 21

d₂ = 20 мм б/_ср = ^{+ +} ₌ 20,3 (мм)

₃ - 21 мм

№ опыта	а
1	20,3 - 20 = +0,3
2	20,3 - 20 = +0,3
3	20,3 - 21 = - 0,7

а - | + 0,3 | + | +0,3 | + | - 0,7 | - 1,3 (значения ««» сумми­руются без учета алгебраических знаков);

т= 1,3-0,29004 = 0,38;

d - 20,3 ± 0,38 (мм).

Полученные данные внесите в табл. № 1.

Таблица 1

ДИФФУЗИЯ СТРЕПТОЦИДА С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ ДИСПЕРСНОСТИ ИЗ МАЗЕЙ

Мазь	Диаметр окрашенной зоны, мм
	0,5 часа	1 час	2 часа
№ 1 №2

После выполнения задания сформулируйте выводы о влиянии степени дисперсности стрептоцида на его вы­свобождение.

Задание № 2

Установить влияние степени дисперсности стрептоци­да на процесс его высвобождения из мазей методом диа­лиза через полупроницаемую мембрану.

Методические рекомендации
к выполнению задания

Для оценки степени высвобождения лекарственных ве­ществ из мазей используют метод прямой диффузии, при которой лекарственное вещество из мазевой основы диф­фундирует в среду, отделенную от мази полупроницаемой мембраной. В качестве мембраны используют целлофан толщиной 45 мкм. Средой является вода очищенная.

Перед выполнением задания ознакомьтесь с алгорит­мом экспериментальной работы к заданию № 2 (приложе­ние 2).

Приложение 2

АЛГОРИТМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВЛИЯНИЯ СТЕПЕНИ ДИСПЕРСНОСТИ СТРЕПТОЦИДА НА ПРОЦЕСС ЕГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ИЗ МАЗЕЙ МЕТОДОМ ДИАЛИЗА



Определение степени высвобождения
стрептоцида из мазей

Для эксперимента используют камеру для диализа с двумя ячейками, состоящую из двух частей. Ячейки ну­меруют, в 1-ю донорную ячейку помещают стрептоцидо- вую мазь с диаметром частиц 0,1 мм, во 2-ю — с диаметром частиц 0,38 мм. Ячейки должны быть заполнены доверху.

На поверхность накладывают целлофан и собирают диализатор (рис. 1). С помощью пипетки с тонким концом или шприца с иглой в рецепторные ячейки вносят по 15 мл воды очищенной. Диализатор помещают в термостат при температуре 37 °C.



а б

Рис. 1. Диализатор в собранном виде (а) и разобранном (б)

Отбор проб диализата из рецепторных ячеек проводят через 0,5; 1; 1,5 часа от начала опыта, восполняя водой очи­щенной отобранное количество раствора. Образец пробы диализата анализируют на содержание стрептоцида.

Количественное определение стрептоцида

В мерную колбу на 100 мл вносят 2 мл анализируемого диализата, содержащего 0,05-0,5 мг стрептоцида, прибав­ляют 8 мл воды очищенной и 2,5 мл 10 % раствора кисло­ты хлороводородной. Колбу помещают на 10 минут в ван­ну со льдом, затем прибавляют 5 мл 0,5 % свежеприготов­ленного раствора натрия нитрита. Через 5 мин прибавля­ют 1 г мочевины и взбалтывают. Спустя 15 мин прибавля­ют 1 мл свежеприготовленного 0,5 % раствора тимола в 10 % растворе натрия гидрооксида и 5 мл 10 % раствора натрия гидрооксида. Через 10 мин содержимое колбы до­водят водой до метки. Содержание стрептоцида определя­ют на фотоэлектроколориметре КФМ-Ц-2 с синим свето­фильтром (максимум пропускания 400 нм) в кювете с тол­щиной слоя 10 мм. В качестве контроля используют смесь всех реактивов, обработанную аналогично.

Фотоэлектроколориметр КФ М-Ц-2 предварительно калибруют по стандартному раствору.

Приготовление стандартного раствора

В мерную колбу на 1000 мл вносят 0,05 г (точная на­веска) стрептоцида, растворяют в 10 мл спирта этилового и доводят водой очищенной до метки. В 1 мл раствора со­держится 0,05 мг стрептоцида.

В мерную колбу на 100 мл вносят 6 мл приготовленно­го раствора стрептоцида, прибавляют 4 мл воды очищен­ной.

Далее поступают, как указано в разделе количествен­ного определения стрептоцида.

Приготовленный стандартный раствор используют для калибровки фотоэлектроколориметра КФМ-Ц-2, устанав­ливая масштаб таким образом, чтобы показания прибора численно совпадали с концентрацией вещества в пределах ±2 единицы счета (0,3 ± 0,02).

Расчет количества стрептоцида (X, мг), высвободивше­гося из мази за определенный промежуток времени, про­водят по формуле:

CV

X =JT+Y,
п ^V1 п’

где С — содержание стрептоцида в 2 мл диализата, най­денное по показаниям прибора (мг);

V — объем диализата в ячейке камеры (мл);

V_i— объем диализата, отобранного для анализа (мл);

Y_n—количество стрептоцида, содержащееся в ранее ото­бранном диализате (мг) = 0; Y₂- С₍; Y₃ = C_t+C₂.

Пример расчета

Мазь № 1. (d= 0,1 мм).

0,5 часа — 0,048 мг

Х_{ = ^0,04₂⁸'¹⁵ = 0,36 (мг)

1 час — 0,067 мг

_v 0,067-15 __,_о „ --, _ч

Х₂ ⁺ 0,048 - 0,55 (мг)

1,5 часа — 0,081 мг

П i

х_з = ’ ₂ + 0,048 + 0,067 = 0,72 (мг)

Полученные данные о количестве высвободившегося стрептоцида за определенные промежутки времени внеси­те в табл. 2, а затем на их основании постройте график в координатах: по оси ординат откладывают концентрацию высвободившегося стрептоцида (С, мг); по оси абсцисс — время (t, ч).

Таблица 2

ДИФФУЗИЯ СТРЕПТОЦИДА С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ
ДИСПЕРСНОСТИ ИЗ МАЗИ

Мазь	Количество высвободившегося стрептоцида, мг
	0,5 часа	1 час	1,5 часа
№1
№2

После выполнение задания сформулируйте выводы о влиянии степени дисперсности стрептоцида на его вы­свобождение и сравните результаты, полученные метода­ми «агаровых пластинок» и диализа.

Задание № 3

Установить влияние полиморфных модификаций пре­паратов инсулина на скорость его высвобождения мето­дом «in vivo».

Методические рекомендации
к выполнению задания

Объектами исследования служат цинк-инсулин аморф­ный и кристаллический, широко используемые в медицин­ской практике при сахарном диабете.

Проводя эксперимент, в учебных целях используют трех животных (белые крысы или кролики) одинаковой массы после 18-часового голодания.

У животных определяют исходную концентрацию глю­козы в крови. После этого двум животным подкожно вво­дят соответственно препараты: цинк-инсулин аморфный и цинк-инсулин кристаллический в дозе 1,0 ЕД/кг. При­нимая во внимание небольшую массу тела опытных жи­вотных (белых крыс), используют препараты в разведении 1:100. Третье животное является контрольным.

Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят через 1; 1,5; 2 часа от начала опыта.

Перед выполнением задания ознакомьтесь с алгоритмом экспериментальной работы к заданию № 3 (приложение 3).

Определение глюкозы в крови

В четыре центрифужные пробирки помещают по 1,5 мл 3 % раствора трихлоруксусной кислоты. В три из них вно­сят по 0,1 мл крови, взятой из ретроорбитального веноз­ного сплетения или хвостовой вены соответствующего жи­вотного, а в четвертую — 0,4 мл стандартного раствора глю­козы. Смесь взбалтывают и центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, затем в 4 химические пробирки помещают по 1,5 мл ортотолуидинового реактива и добав­ляют по 1 мл центрифугата. Пробирки со смесью встряхи­вают и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Пос­ле этого их охлаждают под струей холодной воды. Опти­ческую плотность раствора измеряют с помощью фото­электроколориметра (ФЭК-56 ПМ) при красном свето­фильтре (№ 8) с длиной волны 600-650 нм в кювете с тол­щиной слоя жидкости 5 мм. В качестве раствора сравне­ния используют воду очищенную.

Концентрацию глюкозы в крови (м моль/л) рассчиты­вают по формуле:

С ■ F

р¹ _ cm on
on р ,
¹^ст

где С_оп — концентрация глюкозы в опытной пробе
(м моль/л);

С_ст — концентрация глюкозы в стандартной пробе (м моль/л);

Е — оптическая плотность опытной пробы;

— оптическая плотность стандартного раствора.

Приложение 3

АЛГОРИТМ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ ПО ИЗУЧЕНИЮ ВЛИЯНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ МОДИФИКАЦИЙ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА НА СКОРОСТЬ ЕГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ

Полученные экспериментальные данные внесите в таб­лицу № 3 и на их основании постройте график в коорди­натах: по оси ординат — концентрация глюкозы в крови (С, м моль/л); по оси абсцисс — время (t, ч).Таблица 3

КОНЦЕНТРАЦИЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ БЕЛЫХ КРЫС
ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА
В ДОЗЕ 1 ЕД/кг

Марки­ровка	Масса животно­го, кг	Препа­рат	Концентрация глюкозы в крови, м моль/л
			исходная	1 час	1,5 часа	2 часа

После выполнения задания сформулируйте выводы о влиянии полиморфных модификаций цинк-инсулина на уровень сахара в крови

.Занятие № 2