Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
Правила взятия вируссодержащего материала, его транспортировка и обработка. Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни: • от свежих трупов (кровь, кость, лимфоузел и пораженные органы); • от убитых в агонии животных (кровь, кость, лимфоузлы и пораженные органы); • от выздоравливающих животных (кровь). Пробы необходимо брать асептически, не допуская их загрязнения, в стерильные флаконы (обычно из-под антибиотиков). Каждую пробу необходимо брать в отдельный флакон. Масса каждой пробы должна быть достаточной для исследования — не менее 5—10 мл, или грамм. Все флаконы должны герметически закрываться пробками (обычно резиновыми), продезинфицированы снаружи, высушены и маркированы. Надписи необходимо делать простым карандашом с указанием вида и номера животного, названия органа и даты взятия материала. Дополнительные данные, относящиеся к анамнезу, заболеваемости, размеру очага или вспышки, симптоматике, применявшимся вакцинам, препаратам и т. п., отражают в специальной карте или сопроводительном письме. Лучшие условия для сохранения проб материалов — замораживание. Для пересылки образцы должны быть помещены в термосы со льдом или изотермические ящики, приспособленные для пересылки. Если образцы можно доставить в лабораторию в течение суток после отбора, то их не замораживают и не консервируют. Образцы, которые не могут быть доставлена в лабораторию в течение суток или в замороженном виде, необходимо консервировать глицерином. Он должен полностью покрывать кусочки взятых органов. Даже консервированные образцы желательно хранить в холодильнике. Успешная и точная диагностика зависит от быстроты доставки материалов в лабораторию. При вспышках заболеваний со значительной массовостью или смертностью из близко расположенных к лаборатории районов кроме образцов материала желательно присылать больных животных или свежие трупы. Их также необходимо доставлять с предосторожностями (упаковывать в ящики или коробки) во избежание разноса инфекции. Образцы материалов от трупов должны быть отобраны в возможно короткие сроки после смерти животного, чтобы сохранить возможности для выделения возбудителя, вызывающего заболевание. В тропическом и субтропическом климате при повышенных температуре и относительной влажности воздуха время от гибели до отбора проб не должно быть более 12 ч. Все транспортируемые образцы должны быть упакованы в тройную упаковку, содержащую три упаковочных слоя. Упаковка должна быть выполнена с учётом предотвращения любой утечки содержимого, выдерживать удары и нагрузки, имеющие место при транспортировке. Между первичной ёмкостью и вторичной упаковкой должен находиться мягкий абсорбирующий материал, в количестве достаточном для впитывания всего содержимого первичных ёмкостей. При транспортировке нескольких клинических образцов – каждый упаковывается в первичную упаковку, исключается любой контакт между ними Каждая проба представляется с сопроводительным документом. 9. Мутация у вирусов. Процесс адаптации вирусов к гетерологичным условиям. Мутация – это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса. В основе мутаций лежат следующие процессы: 1) Инверсия – изменение последовательности расположения одного или нескольких нуклеотидов (КОТ – ТОК) . Аналогично тому как меняется смысл вновь полученного слова, так и меняется состав гена, а значит при синтезе получится другой белок и другие свойства у вируса. 2) Замена одной или нескольких пар нуклеотидов другими( КОТ-КОМ). 3) Вставки – в цепь встраивается один или несколько нуклеотидов (ОКО-ОКНО). 4) Делеция – выпадение из цепи одного или нескольких нуклеотидов (ОКНО-ОКО) 5) Дупликация- дублирование одного или нескольких нуклеотидов По обратимости необратимые при которых изменяется фенотип вируса и такие мутанты бястро вытесняют другиа популяции вируса. Обратимые мутации при котрых происходит обратная мутация в месте первичной По протяженности мутации могут быть точечными, захватывать лишь один триплет. Такие мутации могут не проявляться за счет того, что одна аминокислота кодируется– несколькими кодонами. Могут быть аберрационными , которые захватывают значительный участок гена. Такие мутации проявляются всегда. По природе мутации бывают спонтанные и индуцированные. Спонтанные – самопроизвольные, возникают в природе при воздействии на геном вируса различных естественных мутагенных факторов или ошибок действия ферментов ДНК-полимеразы или РНК-полимеразы Одной из важных причин, приводящих к изменению вирусов в естественных условиях ,является коллективный иммунитет, который препятствует дальнейшему размножению вируса, вызвавшего инфекцию – (спад эпизоотии). В иммунном организме могут репродуцироваться антигенные варианты этого вируса, которые не обезвреживаются специфическими антителами. Следовательно, в процессе эпизоотии выживают вирионы с измененной антигенной структурой, которые в последствии после селекции образуют новую популяцию вируса, способную инфицировать иммунный организм. Хорошо известна естественная изменчивость вируса гриппа, который проявляется появлением различных антигенных вариантов вируса. Способствующим фактором является фрагментированная РНК. В результате мутации и рекомбинации между вирусами гриппа человека и животных, образуются новые варианты вируса. Вирус ящура имеет 7 типов, а внутри десятки вариантов и в ходе эпидемии происходит смена типов и вариантов, что затрудняет специфическую профилактику болезни. Помимо антигенной изменчивости может наблюдаться изменчивость патогенных свойств – повышение или понижение вирулентности. Например вирус ньюкаслской болезни сначала вызывал смертельное заболевание птицы. В настоящее время регистрируют легкое течение данной болезни. такой вирус называется природно-ослабленный штамм и используется для приготовления вакцины. К сожалению, бывают и противоположные факты: усиление вирулентности вируса в природных условиях (так произошло с вирусом бешенства и вируса миксоматоза кроликов). Индуцированные (искусственные)мутации – возникают в результате направленных воздействий экспериментатора на вирус различными физическкими и химическими мутагенами а также при адаптации вируса к необычной биосистеме.Такое воздействие на вирус вызывают мутаций в десятки и сотни раз эффективнее, чем природные факторы. Действие мутагенов имеет определённую направленность, что позволяет заранее предвидеть, куда действует мутаген и какие последствия вызовет. Виды мутагенов: 1) Физические мутагены: повышенная температура способствует удалению пуринов из ДНК и замена другими; УФО – поглощается нуклеиновой кислотой, изменяет структуру пиримидинов 2).Химические мутагены могут действовать на нуклеиновую кислоту во время её репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований) или вступать в реакцию с покоящейся молекулой нуклеиновой кислотой, но требующие для выявления (формирования) мутаций, последующей её репликации (азотистая к-та, гидроксиломин) и т.д. 3) Процесс адаптаци вирусов к нечуствительной живой системе. Происходит это таким образом. Вирусом заражается нечувствительная живая система. В первых пассажах вируса на такой живой системе большинство вирионов погибает. Остаются и размножаются только те вирионы, у которых есть изменение в генах, эти изменения позволяют им репродуцироваться в новой для них системе . Так как вируса очень мало, то какие-либо признаки размножения вируса не проявляются. После нескольких «слепых» пассажей количество вирионов, способных размножаться в необычных условиях, увеличивается до такой степени, что появляются признаки размножения вируса. 10. Последовательность этапов репродукции ДНК-содержащих вирусов характеризуется сменой стадий: Транскрипция - переписывание ДНК на РНК – осуществляется с помощью фермента РНК- полимеразы, продуктами является биосинтез и-РНК. ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу. Этапы: 1.Адсорбция – физико-химический процесс, является следствием разности зарядов. Эта стадия обратима на ее исход оказывает влияние кислотность среды, температура и другие процессы. Основную роль в адсорбции вируса играет взаимодействие вируса с комплементарными рецепторами клетки. По химической природе они относятся к мукополипротейдам. На степень скорости адсорбции влияют гормоны действующие на рецепторы. Адсорбция вируса может и не наступить, что связано с различной чувствительностью клеток к вирусам. Чувствительность, в свою очередь определяется: - наличием в клеточной оболочке и цитоплазме ферментов, способных разрушить оболочку и освободить нуклеиновую кислоту. - наличием ферментов, материала, обеспечивающих синтез вирусных компонентов. 2.Проникновение вируса в клетку: Вирус проникает 3 путями – путем непосредственного впрыскивания (характерно для фагов); путем разрушения клеточной оболочки (путь сплавления – характерно для вирусов растений); путем пиноцитоза (характерен для вирусов позвоночных). 3.Репродукция ДНК-содержащих вирусов. Под воздействием ферментов у ДНК-содержащих вирусов осуществляется синтез и-РНК, и-РНК посылается на рибосомы чувствительной клетки. На рибосомах клетки начинается синтез ранних вирионных белков (наделены свойствами – ферментами, блокируют клеточный метаболизм). Ранние вирионные белки дают начало образованию ранних вирионных кислот. По мере накопления ранних вирионных белков они блокируют себя и процесс перестраивается на рибосомном аппарате. Идет сборка вирионов и вновь сформировавшиеся вирионы покидают клетку-мать. 4.Выход вириона из клетки: Пути: Просачиваются через оболочку клетки и одеваются суперкапсидом, в состав в состав которого включаются компоненты клетки: липиды, полисахариды. В данном случае клетка сохраняет свою жизнедеятельность затем погибает. В некоторых случаях в процессе репродукции процессы могут происходить в течение нескольких лет, но жизнедеятельность сохраняется. При этом способе зрелые вирионы из клетки выходят постепенно и относительно длительно. Этот путь характерен для сложных вирусов, имеющих двойную оболочку. 11. Перевиваемые культуры клеток Перевиваемые КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лаборатории их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают их из первичных КК с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом, стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. «+» перед первичными – проще готовить, заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные. Независимость от источников тканей, так как клетки пересеваются бесконечно, не влияют большие концентрации антибиотиков, соответствуют стандартному состоянию. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Но они склонны к злокачественному перерождению. Бесконечное деление. 12. Цитопатическое действие вирусов, его проявление и практическое использование деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, возникающие в результате продуктивной вирусной инфекции клеток и цитотоксического действия вирионов. В клеточном монослое ЦПД проявляется в форме сплошной или очаговой круглой или полиморфноклеточной дегенерации, образовании многоядерных клеток или клеточных симпластов, а также в пролиферативном разрастании клеток. В пораженных вирусом клетках ЦПД проявляется в пикнозе ядра, маргинации и зернистости хроматина, появлении включений, телец, кристаллов; в цитоплазме появляются вакуоли, наступает ее сморщивание и дегенерация. ЦПД используют для индикации и идентификации вирусов. 13. Генетическое взаимодействие вирусов при смешанной инфекции наблюдаются две различные формы взаимодействия: • между геномами вирусов (генетические взаимодействия) — рекомбинация, множественная реактивация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготность; • между продуктами генов (негенетические взаимодействия) — комплементация, интерференция, фенотипическое смешивание. Генетические взаимодействия вирусов. Рекомбинация, или обмен генами между организмами, может быть межгенная, т. е. обмен целыми генами, и внутригенная, т. е. обмен участками внутри одного гена. Рекомбинация с высокой частотой наблюдается у PHK-содержащих вирусов и у ДНК-содержащих вирусов, геном которых представлен двуспиральной ДНК. В экспериментальных условиях гибридные формы можно получить одним из четырех способов: 1) при совместном культивировании двух жизнеспособных вирусов и введении их в чувствительную систему одновременно или в разное время. 2) при введении в чувствительную систему живого и инактивированного (УФ-лучи, нагревание) вируса. 3) при совместном культивировании вируса и вирусной нуклеиновой кислоты, выделенной из другого штамма; 4) в случаях одновременного введения в культуру клеток разных нуклеиновых кислот, соответствующих двум разновидностям вирусов. Кросс-реактивация. Реактивация при скрещивании — это феномен, сходный с множественной реактивацией, но отличный тем, что один из вирусов используют в нативном (неизмененном) виде, другой — инактивируют путем частичного разрушения генетического материала (действие УФ, температуры и др.). При этом наблюдаются два различных явления: • реактивация (восстановление активности) инактивированного генома неповрежденным геномом вируса, т. е. сохраняются неповрежденные участки нуклеиновой кислоты инактивированного вируса; • взаимная реактивация двух инактивированных геномов. В результате могут возникать рекомбинанты со свойствами обоих использованных в опыте штаммов. Кросс-реактивация имеет место в тех случаях, когда инактивированный геном вводится в клетку до введения неповрежденного генома вируса или при их одновременном введении.. Пересортировка генов. Вид генетического взаимодействия, который наблюдается среди вирусов с фрагментированным геном. Образуются определенные группировки генов, которые в данной системе клеток более стойкие, и вирус более жизнеспособен. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Чаще всего и интенсивнее пересортировка генов происходит с вирусами гриппа А (ортомиксовирусы). Гибридные формы вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы, после чего из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие варианты. Гетерозиготность. Феномен, наблюдаемый при репродукции в клетке нескольких частиц вирусов, отличающихся наследственными признаками. В результате в клетке могут образовываться вирионы, содержащие полный геном одного родительского штамма и часть генома (или полный геном) другого вируса (диплоидные или полиплоидные вирионы). Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называются гетерозиготы. В отличие от обычных гомозиготных частиц все потомство обладает одинаковыми свойствами. Транскапсидация. Феномен, наблюдаемый при репродукции в клетке нескольких неродственных вирусов. При этом часть чужеродного генетического материала, заключенного внутри капсида одного неродственного вируса, способна переноситься (в стабильной форме) в чувствительные к основному вирусу клетки. 14. Диплойдные культуры клеток и их использование Диплоидные КК – морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. Особенности : стабильность в процессе культивирования инвитро; ограниченный срок жизни; наличие фаз стабилизации, активного роста и старения; сохранение в процессе пассирования содержание каротина на уровне исходной ткани. 15. Вирус чумы плотоядных 1. Сем. парамиксовирусы. Рнк. 2. Вирус в естественных условиях слабоустойчив. При температуре -60 – разрушается за 30 минут, 100 моментально. В организме больных животных вирус в высоких титрах находят в экскрете из носовой полости, в крови, селезенке, костном мозге, лимфоузлах, в экссудатах грудной и брюшной полостей. Вирус обладает гемаггютинируюищим свойством. Размер вирионов - 115-160 нм специфической формы или нитевидный. Вирус имеет преципитируюший, гемагглютинирующий и комплементсвязывающий антигены. 3. Чума плотоядных (болезнь Карре) - остропротекающая контагиозная болезнь собак, волков, лисиц, шакалов, норок, соболей, енотов, хорьков и других плотоядных, характеризующаяся лихорадкой, острым катаром слизистых оболочек, пневмониями, кожной экзантемой и поражением нервной системы. Распространена повсеместно. Инкубационный период - от нескольких дней до 3 нед. Симптомы: повышается температура тела до 39-40 С: при легочной форме развивается ринит; при кишечной форме чумы наблюдают рвоту, запоры, сменяющиеся поносом, при кожной форме на бесшерстных участках кожи живота и бедер появляется пустулезная сыпь; при нервной форме наблюдается угнетение, пугливость, раздражительность, клонические судороги мышц, могут быть и параличи. При вскрытии наблюдают мелкие кровоизлияния в сердечной мышце. Слизистая оболочка дыхательных путей гиперемирована, покрыта слизисто-гнойным экссудатом, легкие имеют уплотненные участки. Слизистая оболочка желудка и кишечника катарально воспалена, с кровоизлияниями и язвочками. Увеличены брыжеечные лимфатические узлы. Селезенка - без изменений или слегка увеличена. Наблюдают точечные кровоизлияния на слизистой оболочке мочевого пузыря, Вещество головного мозга отечно, количество субдуральной жидкости повышено. 4. Диагноз на чуму плотоядных ставят комплексно: на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и лабораторных исследований. В лабораторию направляют кровь для ретроспективной диагностики, секреты: носовые, конъюнктиву, слюну, фекалии для вирусологических исследований. Посмертно: мозг, кусочки селезенки, печени, их применяют в качестве антигена в серологических реакциях. Экспресс-методы - РИФ, РСК, РГА, РЗГА, тельца-включения. Вирусологические методы: выделение вируса (культура клеток, КЭ, лабораторные животные); идентификация вируса (РН, РДП, РСК).Ретроспективные методы - РСК, РЗГА. 5. У переболевших животных наступает практически пожизненный иммунитет. Щенята от иммунных матерей, а также подсосные щенята невосприимчивы в течение 2-3 мес. Для профилактики чумы плотоядных применяют сухие культуральные вирус-вакцины из аттенуированных штаммов 668-КФ, ЭПМ, ВАКЧУМ. |