Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
67. Методы идентификации вирусов в культуре клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1−0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30−60 мин. контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру клеток вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса. Индикатором наличия вируса в зараженных таким образом культурах клеток может служить: 1. развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток; 2. обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток; 3. положительная реакция гамагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс); 4. феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара. 5. при отсутствии ЦПД, ГА или ГАдс. можно использовать реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД. 68. Принцип и практическое использование РТГА Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами. Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах. 69. Вирус европейской(классической) чумы свиней. Классическая чума свиней - инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением толстого кишечника. вирус рода Pestivirus семейства Flaviviridae, РНК его вириона заключена в белковый капсид, покрытый липидным слоем. В зависимости от вирулентности вируса, а также иммунного статуса организма классическая чума свиней может протекать в сверхострой, острой, подострой и хронической формах. Сверхострое течение, типичное только для молодых животных, характеризуется быстрым течением, высокой лихорадкой и быстрой гибелью. Острое течение, проявляющееся обычно в начале эпизоотии, характеризуется лихорадкой, угнетением, поносами, рвотой, слизисто-гнойным ринитом, появлением пустул на коже, супоросные свиноматки абортируют. Классическая чума свиней в хронической форме протекает как сочетанная вирусно-бактериальная инфекция. В этом случае в патологический процесс обычно вовлекаются сальмонеллы (кишечная форма чумы, характеризующаяся крупозно-дифтеритическим тифлоколитом) или пастереллы (легочная форма с гнойно-фибринозным воспалением легких). Кроме клинически выраженной формы чумы болезнь может протекать субклинически, что наблюдается в случае внутриутробного заражения поросят, что происходит в случае размножения вирулентных штаммов вируса в организме свиноматок, привитых инактивированными вакцинами. Рождающиеся от таких свиней поросята отстают в росте, постоянно выделяют вирус во внешнюю среду или гибнут в возрасте 3-8 недель. Возможна длительная персистенция вируса в организме поросят, зараженных трансплацентарно от хронически больных свиноматок, что способствует появлению стационарных очагов чумы свиней. Культивирование вируса проводят на различных линиях культур клеток, наиболее приемлемой из которых является линия РК-15 (перевиваемая культура почки поросенка). При культивировании в культурах клеток развитие выраженного ЦПД обнаружить не удается - индикацию вируса и его титрование проводят с помощью метода иммунофлуоресценции. Эта реакция позволяет также проводить дифференциацию вакционного и эпизоотического штамма – последние выявляются в РИФ уже через 24 часа после заражения Отбор патматериала осуществляют в первые 2 часа после гибели или убоя больного животного. Материал в виде проб крови, кусочков селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости, почек и легких помещают в стерильные флаконы и закрывают резиновыми пробками. лимфоузлов, селезенки, почек и миндалин, а из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата – мазки. Последний готовят путем отстаивания в течение 1 часа стабилизированной крови и центрифугирования образовавшейся в верхнем слое после отстаивания плазмы. Образующийся беловатый осадок представляет собой лейкоциты. Лабораторная диагностика классической чумы свиней включает: - обнаружение вируса в первичном материале с последующим его выделением на культурах клеток; - постановка биопробы на поросятах; - обнаружение специфических антител в сыворотках крови свиней. Первичное обнаружение вируса в патматериале производится путем постановки РИФ, в которой исследуют мазки из костного мозга или лейкоцитов, реже – гистосрезы. При этом зафиксированный препарат обрабатывают флуоресцирующим конъюгатом в смеси с красителем Эванса (3:1). Специфическое зеленое свечение в цитоплазме даже в отдельных клетках препарата на красно-оранжевом фоне дает право на постановку предварительного диагноза. Выделение вируса осуществляют путем заражения перевиваемой культуры клеток РК-15, выращенной на стеклянной пластине. Вирус классической чумы свиней в культурах клеток ЦПД не вызывает, поэтому индикацию вируса проводят методом иммунофлуоресценции через 24-96 ч инкубации клеточного монослоя. При совпадении результатов РИФ при исследовании патматериала и культуры клеток можно ставить окончательный диагноз. Биопроба при диагностике классической чумы свиней заключается в подкожном заражении поросят 2-3-месячного возраста суспензией патматериала в количестве 2 мл. При этом проводят одновременное заражение неимунных поросят и поросят, предварительно привитых против классической чумы свиней (по три поросенка). Положительный результат биопробы характеризуется развитием клинически выраженной формы болезни у двух или трех неимунных поросят и отсутствием клинического проявления болезни у иммунизированных животных. В этом случае ставят окончательный диагноз на классическую чуму свиней. Для выявления специфических антител в сыворотке крови свиней используют РНГА, РДСК, РНИФ, ИФА. 70. Химический мутагенез. Мутагенез — это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Механизм мутагенеза Последовательность событий приводящая к мутации (внутри хромосомы) выглядит следующим образом: Происходит повреждение ДНК. В случае, если повреждение произошло в незначащем (интрон) фрагменте ДНК, то мутации не происходит. В случае если повреждение произошло в значащем фрагменте (экзон), и произошла корректная репарация ДНК, или вследствие вырожденности генетического кода не произошло нарушения, то мутации не происходит. Только в случае такого повреждения ДНК, которое произошло в значащей части, которое не было корректно репарированно, которое изменило кодировку аминокислоты, или которое привело к выпадению части ДНК и соединению ДНК вновь в единую цепь — то оно приведет к мутации. Мутагенез на уровне генома также может быть связан с инверсиями, делециями, транслокациями, полиплоидией, и анеуплоидией, удвоением, утроением (множественной дупликацией) и т. д. некоторых хромосом. Подавляющее число мутаций неблагоприятно или даже смертельно для организма, так как они разрушают отрегулированный на протяжении миллионов лет естественного отбора целостный генотип. Однако мутации возникают постоянно, и способностью мутировать обладают все живые организмы. У каждой мутации есть какая-то причина, хотя в большинстве случаев мы не можем ее определить. Однако число мутаций можно резко увеличить, воздействуя на организм так называемыми мутагенными факторами. Химические мутагены Предложено три классификации химических мутагенов: Рехборна, Фриза, Раппопорта. Фриз предложил разделить мутагены на две основные группы: 1) мутагены, реагирующие с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации; 2) мутагены, вступающие в реакцию с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты, но требующие для формирования мутащий последующих ее репликаций. В основе молекулярных изменений вирусной нуклеиновой кислоты, приводящих к мутации, лежат два основных процесса: замена основания или вставка основания. Различают два типа замены оснований: простую (транзиция) – на место одного пуринового основания встает другое или одно пиримидиновое основание заменяется другим; сложную (трансверсия) – вместо пуринового основания появляется пиримидиновое или пиримидиновое основание заменяется пуриновым. Вставка основания – ведет более к глубоким изменениям генетического кода, чем простая замена оснований. В то же время основой изменения генетического признака, имеющего одно и то же фенотипическое выражение, могут быть мутационные повреждения различных генов. Кроме простых замен, алкилирующие агенты способны индуцировать сложные замены – пурин на пиримидин. Мутагенное действие этих соединений было показано с вирусами ньюкаслской болезни и клещевого энцефалита. Гидроксиламин индуцирует мутации по типу образования простых замен оснований в нуклеиновой кислоте, направление которых зависит от типа нуклеиновой кислоты, которую содержит вирус. С помощью гидроксиламина были индуцированы мутации у вирусов герпеса, ньюкаслской болезни, полиомиелита. В последнее время был синтезированный и изучен один из аналогов гидроксиламина – оксиметилгидроксиламин (ОМГА), реагирующий только с цитозином, но не с урацилом РНК, а следовательно, обладающий более высокой специфичностью и одной направленностью мутагенного действия. Для вирусов человека и животных мутагеном является и формальдегид, с помощью которого были индуцированы мутанты у вируса полиомиелита и вируса западного энцефаломиелиталошадей при воздействии на очищенную РНК и внутриклеточный вирус. Механизм мутагенного действия формальдегида недостаточно изучен. Механизм действия азотистой кислоты (НNО2) как мутагена на нуклеиновые кислоты заключается в дезаминировании органических оснований, т. е. отщепление от их молекул аминогруппы (NH2). 71. Явление геммагглютинации, его использование в вирусологии. В основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куринных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови. Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1-2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистероловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объёме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25 - 1% взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса. При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками. РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования антител в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двухкратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус и по одной капле 1% взвеси эритроцитов. При использовании РТГА для определения типа вируса, используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения антигена. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу. РГА и РТГА широко применяется для диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам. 72. Вирус африканской чумы синей. Африканская чума свиней - острая, высоко контагиозная болезнь, характеризующаяся явлениями острого токсикоза, некробиозом клеток лимфоидной ткани, появлением в органах тромбозов, кровоизлияний и заканчивающаяся почти всегда смертельно. Клиническая картина, а также длительность течения при африканской чуме свиней аналогична классической чуме свиней. Однако в патологический процесс в бо степени вовлечена дыхательная система, чем пищеварительная, и, кроме того, воспаление внутренних органов носит ярко выраженный геморрагический характер. Хроническое течение характеризуется длительным персистированием вируса внутри организма свиней. Гибель при хронической форме болезни наступает после вовлечения в инфекционный процесс легких. Латентное течение характерно для естественных носителей вируса – диких свиней, которые являются пожизненными выделителями вируса во внешнюю среду. Особенностью эпизоотического процесса при африканской чуме свиней является постоянное присутствие резервуара возбудителя – отдельных видов клещей, в организме которых вирус длительно сохраняется и даже размножается. Инфицирование вирусом клещей, а также передача его здоровым свиньям происходит в процессе кровососания. Присутствие резервуара возбудителя инфекции в эпизоотическом процессе обусловливает длительную стационарность эпизоотических очагов и постоянное сохранение возбудителя в природе. Возбудителем африканской чумы свиней является вирус из семейства Asfarviridae, рода Asfarvirus. Данный род включает исключительно возбудителя африканской чумы свиней. Это ДНК- геномный вирус, репродукция которого происходит в цитоплазме с образованием специфических паракристаллических телец- включений в конце инфекционного цикла. Вирус реплицируется в макрофагах, а также может содержаться в высоких титрах в эритроцитах свиней. У вируса сложная антигенная структура: он содержит комплементсвязывающий, преципитирующий и гемадсорбирующий антигены. При этом белки первых двух антигенов не подвержены изменчивости и являются схожими у всех штаммов вируса, изолируемых от свиней в различных географических местах. В этой связи реакциями связывания комплемента и иммунодиффузии выявляют антитела, общие для всех вирусов африканской чумы свиней. Поверхностные суперкапсидные белки, отвечающие за феномен гемадсорбции на поверхности инфицированной культуры клеток, отличаются значительной вариабельностью, то есть гемадсорбирующий антиген у вируса является типоспецифическим. По результатам РТГАд выделено три антигенные группы, обозначенные как А, В и С, причем в пределах этих групп выявлено большое число серотипов. В редких случаях изолируют отдельные штаммы вируса, не обладающие гемадсорбирующими свойствами даже после длительной адаптации их на культуре клеток. Установлена прямая корреляция между активностью специфической гемадсорбции и вирулентностью вируса африканской чумы, а также между титром вируса в исследуемом материале и временем появления гемадсорбции на поверхности инфицированной культуры клеток. Особенностью вируса африканской чумы свиней является его неоднородность даже в пределах одной популяции. Он представляет собой гетерогенную популяцию, состоящую из клонов, отличающихся по признакам гемадсорбции, вирулентности, инфекционности, антигенным свойствам, причем изменение отдельных биологических характеристик может насту пать даже в ходе одного цикла культивирования in vitro. В этой связи при оценке эпизоотического штамма, изолируемого от свиней в ходе одной эпизо- отической вспышки, принимают во внимание характеристики доминирующего в популяции клона с наибольшей вирулентностью. Лабораторная диагностика. Основанием для подозрения африкан- ской чумы свиней может служить возникновение заболевания с быстрым тече- нием и высокой смертностью среди свинопоголовья, привитого против клас- сической чумы свиней. В лабораторной диагностике африканской чумы сви- ней главным является дифференциация болезни против классической чумы свиней. Отбор патматериала проводят от погибших или вынужденно убитых животных. Обязательным материалом для взятия являются пробы крови и се- лезенки, так как нахождение вируса в этих тканях является постоянным при всех формах болезни. В лабораторию также направляют ткани сердца, легких, печени, почек, миндалин и лимфоузлов. Пробы берут кусочками массой 10-15 г и помещают во флаконы, которые затем заключают в термос с охлаждающей жидкостью. Подготовка материала заключается в приготовлении 20%-ной сус- пензии из проб внутренних органов на физиологическом растворе или раство- ре Хенкса. После этого суспензию центрифугируют при 1-2 тыс об/мин, к на- досадочной жидкости добавляют антибиотики (по 500 ЕД/мл) пенициллина и стрептомицина, выдерживают 2 часа при комнатной температуре и используют для заражения культур клеток. Пробы крови дефибринируют. Из проб внут- ренних органов готовят мазки-отпечатки для исследования в РИФ. Лабораторную диагностику африканской чумы свиней проводят по следующим направлениям: - обнаружение вируса в патматериале с подтверждением диагноза путем выделения вируса на культуре клеток и его идентификацией; - постановки биопробы на подсвинках; - обнаружение специфических антител в сыворотке крови. Первичное обнаружение вируса в патматериале производится путем постановки РИФ. Обязательным в реакции является постановка отрицательно- го контроля с использованием иммунных сывороток против классической чу- мы свиней. Специфическое свечение наблюдается в виде отдельных гранул, диффузного скопления или включений. В препаратах из лимфоузлов и селе- зенки антиген содержится в цитоплазме лимфоидных клеток в форме отдель- ных зеленых гранул, гомогенных желтовато-зеленых округлых или бобовид- ных включений, а также в виде диффузного зеленого свечения всей цитоплаз- мы. Первичное обнаружение вируса можно также проводить путем поста- новки РСК и РИД. В качестве антигена используют надосадочную жидкость, образующуюся после центрифугирования суспензии из внутренних органов. Для ее получения проводят экстрагирование суспензии из внутренних органов смесью ацетона и эфира. Однако удовлетворительные результаты реакции по- лучают только при диагностике острого течения болезни - при хроническом и |