Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
54. Вирус болезни Ньюкасла Сем.: парамиксовирусы.Возбудитель болезни Ньюкасла является РНК-содержащим вирусом, его размер -100-300 нм, форма вириона может быть сферической, овальной или нитевидной, репродуцируется в цитоплазме. Вирус локализуется в паренхиматозных органах, костном и головном мозге, мышцах, трахеальной слизи, толстом и тонком кишечниках. Установлен тропизм вируса к нервной, легочной и висцеральным тканям. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью. Вирусы чувствительны к эфиру, хлороформу, кислой среде, сравнительно быстро инактивируются при температуре 20-37'С. Устойчив при рН 2-10. Кутивируют кэ, убивают через 30-120 ч. Накапливаются в аллантоизной и амниотической жидкости. Болезнь Ньюкасла - широко распространенная, остропротекающая, высококонтагиозная болезнь кур, индеек и некоторых видов диких птиц. В типичных случаях болезнь проявляется слабостью, затрудненным дыханием, кашлем, часто отмечают понос, поражение ЦНС (круговые движения, шаткость походки, парезы и параличи ног, крыльев, шеи). У 60-70 % взрослых кур, павших от этой болезни, обнаруживают точечные кровоизлияния при переходе железистого желудка в мышечный, некротическое воспаление кишечника (бубоны), имеет место атипичное и даже бессимптомное течение болезни. Диагноз основан на анализе эпизоотологических, клинических данных, патоморфологических изменений и результатов лабораторных исследований. В лабораторию направляют свежий труп птицы или трахею, легкие, селезенку, печень, головной мозг (или голову). Основой лабораторной диагностики является выделение вируса на 9-10-дневных КЭ, культуре клеток, постановка РГА и идентификация вируса в РТГА, РН, РСК, РИФ и др. Ретроспективный диагноз и определение напряженности иммунитета проводят в РТГА, РН и др. Птица, переболевшая в естественных условиях, приобретает пожизненный иммунитет. Для специфической профилактики болезни Ньюкасла применяют живые вакцины из штаммов В1, Ла-Сота, Н и БОР-74. 54. Методы идентификации вирусов с помощью лабораторных животных. Используют: 1)для обнаружения вируса в ПМ 2)первичного выделения вируса из ПМ 3)накопления вирусной массы 4)поддержания вируса в лаборатории в активном сост. 5)титровании вируса 6)в качестве тест-объекта в РН 6)получение гипериммунных сывороток. Используемые животные: белые мыши (бешенство, ящур), белые крысы (грипп свиней, б. Ауески), морские свинки (бешенство, ящур, чума плотоядных). Кролики (бешенство, миксомы кроликов). Требования к лабораторным животным – животное должно быть чувствительным к данному вирусу; возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных; стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе. По чувствительности наибольшей стандартностью обладают так называемые линейные животные, полученные в результате близкородственного скрещивания в течении ряда поколений; лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат на карантине и ведут клиническое наблюдение. При наличии заболевания их уничтожают. Животных размещают так, чтобы с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Для животных разных видов применяют разные способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. При использовании в эксперименте небольшой группы животных и при непродолжительном сроке его можно выстригать шерсть знаками на спине, бедрах. Метка белых мышей, белых крыс может быть проведена ампутацией отдельных пальцев на передних или задних конечностях. Часто пользуются методом нанесения цветных пятен на непигментированную шерсть. Заражение лабораторных животных: 1. подкожно 2. Внутрикожно 3. Внутримышечно 4. Внутривенно 5. Интранозально 6. Интероцеребрально 56.Тельца включения при вирусных инфекциях и их значение. Обнаружение специфических телец-включений. Это вспомогательный метод идентификации вируса. Внутриядерные тельца- включения обнаруживают в препаратах из зараженной культуры клеток, окрашенных гематоксилин-эозином, а также при электронной микроскопии, в случае типичного ЦПД, культуры клеток куриного эмбриона и почки свиньи. Вирусные тельца-включения – образования, состоящие или из скоплений вирусных частиц (вирионов), или из клеточного материала. Они встречаются при многих вирусных инфекциях и представляют собой овальные оксифильные тельца величиной1-10мкм, периферически окруженные светлой зоной – мантией. Их классифицируют по локализации в клетке (внутриядерные, цитоплазматические), составу нуклеиновой кислоты (ДНК-, РНК-содержащие), тинкториальным свойствам (базофильные, оксифильные), гомогенности (аморфные, зернистые и т.д.). Тельца включения локализуются избирательно. При оспе всех видов животных, в том числе птиц, бешенстве, гриппе , парагриппе, чуме крупного рогатого скота, пситтакозе и других болезнях, как правило, развиваются цитоплазматические тельца-включения; при болезни Борна, ринотрахеите крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, везикулярном стоматите, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции и других – ядерные. Цитоплазматические тельца – включения развиваются при болезнях, вызываемых сравнительно крупными вирусами (оспа, бешенство). Чаще они представленны в виде округлых, овальных, или неправильной формы образований. В пораженной клетке может быть несколько телец – включений различных размеров и форм. Обычно они прилегают к ядру, отодвигая его к периферии или окружая его, и обнаруживаются в хорошо сохранившихся клетках. Для каждого тельца-включения характерна внутренняя структура. Так, тельца Гварнирьери при оспе имеют вид рыхлых, зернистых образований, при бешенстве тельца Бабеша – Негри кажутся плотными, При одной и той же болезни характер вирусных включений различен, Так при кори накопление цитоплазматических включений кореллирует с накоплением вируса, а внутриядерных – с реакцией клетки на вирус. Ядерные включения встречаются при инфекциях, вызываемых как относительно крупными вирусами (герпес, болезнь Ауески, ИРТ, ринопневмония лошадей и др.) так и вирусами, имеющими очень мелкие размеры (ящур, гепатит собак). Ядерные включения лучше выявляются в гистологических препаратах, морфологические детали включений видны только при контрастной окраске срезов; форма и размеры их зависят от штаммовых особенностей вируса, а также от методов гистологической обработки материала. Различаютдва типа внутриядерных включений: А и В. Включения типа А – аморфные или округлой формы оксифильные образования, четко отграниченные от базофильной массы ядра; нуклеоплазма находится в состоянии глубокой деструкции; хроматин расположен глыбками на деформированной оболочке ядра. Включения типа А встречаются при ринопневмонии лошадей, ИРТ КРС, ларинготрахеите птиц, болезни Ауески. Включения типа В имеют вид ацидофилных гиалиновых зерен, нуклеоплазма относительно мало изменена. Они преимущественно при болезни Тешена, Аденоинфекции. При ряде вирусных болезней обнаружение телец – включений имеет диагностическое значение. Многие из них настолько патогномоничны, что обнаружение их, стало основным из экспресс методов диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии лошадей, аденовирусной инфекции и ИРТ КРС. В диагностике гриппа животных, болезни Ауески, ларинготрахеита птиц и других болезней выявление телец включений – вспомогательный метод. На частоту выявления телец – включений, кроме штаммовых различий влияет и возраст животного (у молодых они появляются с большим постоянством) и физиологическое состояние организма. 57. Вирус оспы коров. Оспа (Variola) – инфекционная контагиозная болезнь, характеризующаяся лихорадкой и папулезно-пустулезной сыпью на коже и слизистых оболочках.. Возбудитель принадлежит к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus, ДНК-содержащий вирус размером 170- 350 нм, эпителиотропный, образует элементарные округлой формы тельца Пашена, видимые в световом микроскопе после окраски по Морозову (рисунок 9). Основные эпизоотологические данные. Источником возбудителя служат больные овцы и вирусоносители в инкубационном периоде. Вирус выделяется из организма с истечениями из носа, глаз, со слюной, оспенными корочками. Факторами передачи являются предметы ухода, корма. Возможна передача кровососущими насекомыми, а также через молоко и трансплацентарно. Основные способы передачи возбудителя- через дыхательные пути (респираторно) и наружные покровы. Оспа овец возникает в любое время года в виде эпизоотии, поражает животных всех возрастов. Заболеваемость может достигать 100%. Течение и симптомы. Инкубационный период -3-14 дней. Болезнь начинается угнетением, анорексией, лихорадкой (41-42ºС). Появляются отеки кожи век, серозно-слизистые или серозно-гнойные истечения из носа и глаз. Дыхание затрудненное, пульс учащенный. Оспенную сыпь обнаруживают в коже области глаз, внутренней поверхности грудных и тазовых конечностей, головы, губ, крыльев носа. Вначале сыпь имеет вид округлых красных пятен-розеол, которые через 1-2 дня превращаются в плотные узелки- папулы, окруженные красным ободком. Папулы достигают размеров 12-15 мм, через 1-3 дня они размягчаются и в них появляется серозная жидкость. Наступает коагуляционный некроз кожи, покрывающий папулу, образуются струпья, которые отпадают. При тяжелом течении отмечают пневмонию, энтерит, кератит, артриты. В большинстве случаев животное погибает от сепсиса. Культивирование. Удается оно на овцах по методу Борреля. Некоторые штаммы, адаптируясь в ХАО куриного эмбриона, утрачивали патогенные и иммуногенные свойства. Вирус культивируется в первичной и субкультуре клеток почек и тестикулов ягнят, козлят и телят, вызывая цитопатические изменения через 48-96 ч. Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства не установлены. Лабораторная диагностика. Диагноз ставят с учетом эпизоотологических данных, результатов клинического обследования, биопробы и вирусоскопии мазков из свежеразвившихся первичных очагов поражения или мест инокуляции вируса при постановке биопробы. В этих случаях необходимо найти животных с характерными оспинами гнездно-сетчатого строения с кратерообразными в них углублениями, чего при других экземах, как правило, не бывает. Лечение. Больных животных изолируют в сухие, теплые помещения и обеспечивают полноценным, легко усваиваемым кормом. В питьевую воду добавляют йодистый калий. Применяют химиотерапевтические препараты и антибиотики для предупреждения и ликвидации осложнений, вызываемых секундарной микрофлорой. Тяжелобольных животных убивают. Иммунитет и специфическая профилактика. Естественно переболевшие животные приобретают иммунитет не менее чем на 2 года. С 1944 года используют ГОА-формолвакцину, а также поливалентную концентрированную вакцину, предохраняющую овец от оспы, брадзота и энтеротоксемии. С 1978 года применяют живую культуральную противооспенную вакцину, приготовленную из аттенуированного штамма. Овцы приобретают невосприимчивость к экспериментальному заражению уже через 3-5 дней после вакцинации и сохраняют иммунитет в течение 9-12 мес. Живая вакцина зарекомендовала себя как иммуногенный и безвредный препарат. 58. Методы экспериментальной селекции вирусов. В экспериментальных условиях гибридные (рекомбинантные) формы можно получить при совместном введении в клетку: 1) двух жизнеспособных вирусов ; 2) живого и инактивированного вируса 3) живого вируса и вирусной нуклеиновой кислоты , выделенной из другого штамма; 4) одновременно двух нуклеиновых кислот от разных вирусов. Другой иинфы не нашла. 59. Серологические реакции при вирусных инфекциях. В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток. Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить ЦПД, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек. Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки» клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований. С помощью серологической реакции можно: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства 2 вирусов, определять титр вируснейтрализующих АТ в сыворотке, или индекс нейтрализации, идентифицировать неизвестный вирус путем испытания его с различными заведомо известными сыворотками. Серологические реакции. 1. РИФ – реакция иммунофлюорисценции. АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. 2. ИФА – иммуно-ферментный анализ. АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию. 3. РСК – реакция связывания комплемента. АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная. 4. РДП - реакция диффузной преципитиции. АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации. 5. РНГА – реакция непрямой гемаглютинации. Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов. 6. РТГА – реакция торможения гамаглютинации 7. РТГАд – реакция торможения гемадсорбции 8. РН – реакция нейтрализации. Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса. 60. Лабораторная диагностика болезни Ньюкасла. Ньюкаслская болезнь (НБ), псевдочума птиц - высоко контагиозная вирусная инфекция, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественны¬ми точечными кровоизлияниями и поражением внутренних органов. Возбудителем является РНК-содержащий вирус (NDV) из семействаParamyxoviridae. Зарегистрирована на всех континентах. Наносит громадный экономический ущерб и относится к особо опасным инфекциям. При характерном течении болезни постановка диагноза не представляет сложности. При вспышке болезни на фоне пассивного или поствакцинального иммунитета, а тем более в стационарно неблагополучном хозяйстве поставить диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают эпизоотическую ситуацию, клиническую и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования - выделение ви¬руса на КЭ, его индикация и идентификация в РГА - РТГА, определение вирулентности ви¬руса на КЭ и цыплятах, а также выявление АТ в сыворотке переболевших или вакциниро-ванных птиц в РТГА. Выделение вируса. Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голо¬ву, легкие, трахею и селезенку от только что павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в период вспышки болезни. Через 15 дн выделить его обычными методами, как правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки (в первые 3-5 дн) и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внут¬ренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина на дистиллирован¬ной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре не выше 4°С. Мазки- отпечатки исследуют методом ФА, срезы - с помощью ЭМ или ИЭМ, а суспензию -вРГА. Это позволит выявить специфический АГ (вирус) и ГА-агент в течение 3-5 ч, определить направленность дальнейших исследований. Заражение КЭ.Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2 мл, не менее 10 КЭ на ка¬ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72 ч при 37,5°С (погибших в первые 24 ч эмбрионов не учитывают). Если через 72 ч нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ ин¬кубируют до 120 ч и затем убивают. Ненадежным оказался метод выделения вируса от зараженных иммунных кур: чем вы¬ше иммунитет у несушек, тем меньше вероятности выделения вируса из их эмбрионов. При исследовании большого количества полевых образцов на выделение вируса НБ можно ис¬пользовать фрагменты ХАО, связанные с яичной скорлупой. Для этого фрагменты ХАО размером 0,6-1,0 см2 культивируют в среде Игла. Эффективность выделения вируса 97%. При внесении вируса в среду культивирования или непосредственно на ХАО КЭ получены совпадающие результаты. Заражение культуры клеток.Выделение вируса в культуре клеток осуществляется редко, так как культуральный вирус по ГА- активности значительно уступает эмбрионально¬му. Однако в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов КЭ и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и идентифика¬ции вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом. Можно использовать переви¬ваемые линии ВНК-21 и Нер-2. В зараженной культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48-60 ч вызывает ЦПИ, спе¬цифичность которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур. С вируссодержащей культуральной жидкостью может быть поставлена РГА в отношении эритроци¬тов крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не пре¬вышает 1:32 - 1:128. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре ткани не дают основания исключить НБ. Заражение птиц.Если КЭ под руками нет, вирус можно выделить на неиммунной к НБ птице. Для этого испытуемый материал 1:10 (0,5 мл) внутримышечно инокулируют цыпля¬там в возрасте 2-4 мес. За инфицированной птицей наблюдают 10-12 дн. При появлении ха¬рактерных для болезни симптомов птиц в атональном состоянии убивают и берут пробы го¬ловного мозга и селезенки, которые можно использовать для заражения КЭ и иммунологи-ческой пробы (для одновременного заражения птиц иммунной и неиммунной групп). Титрование вируса.Обычно проводят на КЭ, культурах клеток по общепринятой ме¬тодике и на 6-10 нед цыплятах. Доза инокуляции вируса для цыплят 0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дн. |