Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
61. Методы генетического взаимодействия вирусов. Негенетическое взаимодейсвтие. Взаимодействие вирусов между собой может происходить только при заражении одной клетки несколькими вирусами (смешанная инфекция). При этом характер взаимодействия в условиях смешанной инфекции может быть генетический и негенетический. Генетические взаимодействия: 1. Кросс-реактивация – это тип рекомбинации между двумя вирусами, один из которых является неизмененным (интактным), а другой - мутантным инактивированным. При этом в ходе рекомбинации происходит восстановление активности инактивированного вируса в следствие замены дефектных генов нормальными от интактного вируса. 2. Множественная реактивация. Представляет собой также тип рекомбинации, происходящий между двумя мутантными инактивированными вирусами. При этом, вирусы, взаимодействуя, передают друг другу недефектные гены с формированием полноценного генома. В обоих случаях реактивации образующиеся в процессе рекомбинации вирусные частицы называются вирусы-реактиванты. 3. Пересортировка генов. Это отдельный тип рекомбинации, происходящий между двумя родственными вирусами с сегментированными молекулами РНК. При этом происходит обмен либо целыми фрагментами РНК, либо отдельными генами, либо отдельными участками генов, однако в любом случае при рекомбинации участвует недефектный генетический материал. Образующиеся в процессе рекомбинации вирусы называют вирусы-реассортанты 4. Гетерозиготность – нестойкое объединение нуклеиновых кислот двух вирусов под одним капсидом. Образующиеся при этом вирусные частицы называют вирусы-гетерозиготы. Негенетические взаимодействия. 1. Комплементация. При этом дефектный (мутантный) по функциональному белку вирус не способен к собственной репродукции и требует помощника. В этом случае вирусом - помощником может являться как родственный недефектный вирус, так и биологически неродственный вирус (лейкоз птиц и вирус саркомы Рауса). 2. Негенетическая реактивация. В случае проникновения в клетку вместе с полноценным живым вирусом дефектного по структурному белку инактивированного вируса возможна репродукция последнего. При этом живой вирус, используя собственные ферменты, раздевает инактивированный вирус, после чего начинается репликация его нуклеиновой кислоты. 3. Фенотипическое смешивание (транскапсидация). Является разновидностью гибридизации, при которой полноценный геном одного вируса в процессе сборки заключается в белковую оболочку (капсид) другого вируса. В этом случае образующиеся вирусы-гибриды являются генетически полноценными, то есть содержат неизмененный геном исходного вируса. При всех способах взаимодействия вирусов между собой явления, при которых происходит подавление активности одного вируса другим, условно называют интерференцией. Взаимодействия вирусов, при которых происходит повышение активности участвующих вирусов, называют экзальтацией. 62. Принцип работы электронного микроскопа, разрешающая способность, приготовление препаратов. 1. В электронном микроскопе образец облучается пучком электронов. Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой. Соответственно, волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше. 2. Конструктивная особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки. Типы электронных микроскопов трансмиссионные (просвечивающие) и сканирующие (растровые).1. При трансмиссионной микроскопии пучок электронов проходит через изучаемый объект, и в результате получаетсяплоскостное изображение объекта. 2. При сканирующей микроскопии на поверхность объекта вначале наносится металлическое напыление, а в ходе микроскопии электронный пучок последовательно “пробегает” по всем точкам поверхности объекта (сканирует поверхность), выбивая из напылённого вещества вторичные электроны (бета-лучи). Последние формируют пространственное изображение поверхности. собенности приготовления препарата. 1. Взятие материала и фиксация Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3 ), а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии:вначале глутаральдегидом (стабилизация белков), затем - четырёхокисью осмия (стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани). 2. Уплотнение материала 1. Образцы, как обычно, обезвоживают, а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы. 2. а) Заливку производят в специальных формах, б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате, в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей. 3. Приготовление срезов 1. Срез делают с помощью ультратома; их толщина - 30-50 нм (ср. с микротомными срезами - 10.000 – 20.000 нм). 2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла). 4. Окрашивание срезов 1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана). б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны. 2.Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными. 63. Вирус парагриппа КРС. Остро протекающая контагиозная болезнь, характеризующаяся поражением органов дыхания различной тяжести - от легких ринитов и бронхитов до тяжелой бронхопневмонии. Наблюдают бессимптомную латентную инфекцию без признаков поражения дыхательной системы. У стельных коров инфекция может привести к внутриутробному заражению плода, абортам или мертворождениям. Возбудителем является вирус семейства Paramyxoviridae, рода Paramyxovirus. Геном возбудителя представлен минус-нитью РНК. На поверхности вириона присутствует гликопротеин, обладающий одновременно гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью (NH). Внутренний белковый компонент вириона – рибонуклеопротеид.. Все штаммы вируса ПГ в антигенном отношении однородные, поэтому антигенной вариабельности среди вирусов ПГ не выявлено. Лабораторную диагностику проводят параллельно с исследованием материала на аденовирусную инфекцию, респираторносинцитиальную инфекцию, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею из-за сходства их клинических признаков (группа заболеваний, называемых пневмоэнтеритами). Отбор патматериала. В лабораторию направляют материал, взятый в течение первых 2-3 дней болезни, берут 15-20 проб следующего материала: - смывы со слизистой оболочки носовой полости путем введения - смывы с конъюнктивы; - смывы со слизистой оболочки прямой кишки. От животных, убитых с диагностической целью, берут кусочки легких и бронхов (на границе пораженных и здоровых участков), селезенки, лимфоузлов. Подготовку материала для исследования проводят по общей схеме. Она включает центрифугирование жидкого материала при 1000 об/мин в течение 10-15 минут, обработку надосадочной жидкости антибиотиками. В дальнейшем надосадочную жидкость используют для выделения вируса,. Лабораторная диагностика ПГ-может проводиться по следующим направлениям: - обнаружение вируса в патологическом материале методом РИФ; - выделение возбудителя на культурах клеток и его идентификация; - выявление специфических антител в крови животных. Обнаружение вируса-путем постановки РИФ. В положительном случае вирус обнаруживают в цитоплазме пораженных клеток. Выделение вируса. для выделения используют первичные субкультуры: ПЭК, ЛЭК, ПТ, ТБ. Идентификацию вируса проводят серологическими реакциями - РТГАд, РТГА. Последнюю применяют для типирования выделенного на культуре клеток гемадсорбирующего вируса. В реакции возможно использование только эритроцитов морских свинок, гусей и индюков. При этом гемагглютинация наступает через 60-90 минут, 1-3 минуты и 2-5 минут соответственно. Выявление антител проводят в серологических реакциях РТГА, РТГАд,. Положительным результатом считают 4-кратное и более увеличение титра антител при исследовании парных проб сывороток крови или носовых секретов. 64. Природа вирусов. Признаки живого и неживого. Вирусы =НК(нуклеиновая кислота) + белок. Вирусы – ультрамикроскопические организмы, обладающие только одним типом нуклеиновых кислот, лишенные собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии. Вирусы являются облигатными паразитами , так как не способны размножаться вне клетки. Вне клетки вирусные частицы не проявляют признаки живого и ведут себя как частицы биополимеров . Основные отличия вирусов от других форм жизни: Ультрамикроскопические размеры; Содержат только один тип нуклеиновой кислоты (либо РНК, либо ДНК); Отсутствуют собственные белоксинтезирующие системы, автономный метаболизм; Не способны к росту и бинарному делению; Репродуцируются дизъюнктивным способом - разобщенность в пространстве и во времени синтеза вирусных компонентов; Облигатные внутриклеточные паразиты на молекулярно-генетическом уровне; Присуща изменчивость, что ведет к появлению новых инфекционных агентов; Признаки живого. Способны размножаться, используя клетку; Присуща наследственность, изменчивость; Способны эволюционировать. Признаки неживого: Неклеточная организация; Отсутствие метаболизма; Дизъюнктивный (разобщенный) способ размножения; Способны кристаллизоваться. Формы существования вирусных агентов Внеклеточная – вирион;Внутриклеточная – вирус. 65. Методы получения противовирусных вакцин. Вакцина представляет собой биологический препарат, приготовленный из возбудителей инфекции, лишенных патогенных свойств, но сохранивших иммунногенные свойства. При изготовлении вакцин для получения вируссодержащего материала используют живые биологические системы, чувствительные к вирусам: животных, куриные эмбрионы, культуры клеток. В зависимости от биологической системы, используемой для культивирования вакцинного штамма вируса, различают тканевые, авинизированные, культуральные вакцины. Тканевые вакцины в своей основе содержат какую-либо ткань животных, в которой размножался и накапливался вакцинный вирус. Например, вакцину против бешенства готовили из мозговой ткани овец, зараженных пастеровским вирусом-фикс бешенства, лапинизированную вакцину против ящура — из тканей крольчат, зараженных адаптированным к ним вакцинным штаммом. Количество тканевых вакцин постепенно сокращается. Авинизированные вакцины готовят из эмбриональных жидкостей и тканей развивающихся эмбрионов птиц, зараженных вакцинным штаммом. Наиболее часто для этих целей используют эмбрионы кур, реже уток и японских перепелов, например, для получения вакцин против гриппа птиц, болезни Ньюкасла, гепатита утят и др. Культуральные вакциныготовят из зараженных культур клеток или переживающих тканей, при этом применяют роллерный (используют вращающиеся бутыли) или суспензионный (глубинный — используют реакторы) методы культивирования клеток и тканей. Это наиболее перспективный и прогрессивный метод получения вакцин. Таким методом готовят, например, вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 крупного рогатого скота, ящура, чумы крупного рогатого скота и др. В зависимости от видовой принадлежности вакцинного штамма различают гомологические и гетерологические противовирусные вакцины. Гомологические вакцины готовят из того вида вируса, против которого предполагается создать иммунитет, например, вакцины против вирусной диареи, чумы крупного рогатого скота, бешенства и др. Большинство вирусных вакцин — гомологические. Гетерологические вакцины готовят из вирусов другого вида, но имеющих в своем составе сходные антигены и обладающих перекрестной иммуногенностью. Например, вакцину против оспы кур готовят из вируса оспы голубей, вирус герпеса индеек используют для защиты кур от болезни Марека, вирус кори — для защиты собак от чумы плотоядных и т. д. В зависимости от количества типов или видов возбудителей, включенных в состав вакцины, различают моновалентные, поливалентные, ассоциированные и смешанные вакцины. Моновалентные вакцины содержат антигены одного типа (вида) вируса. Поливалентные вакцины (бивалентные, трехвалентные и т. д.) готовят из нескольких типов одного вируса. Например, трехвалентную противоящурную вакцину получают из трех типов вируса ящура — А, О и С. Ассоциированные вакцины содержат антигены возбудителей разных видов, например, вакцина «Бивак» — против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота, «Тетрапак» — против чумы, аденовироза, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита собак. Смешанные вакцины представляют собой смесь вирусных и бактерийных антигенов, например, вакцина против чумы плотоядных, ботулизма и вирусного энтерита собак. В зависимости от жизнеспособности (способности к репродукции) вируса, входящего в состав вакцины, все противовирусные вакцины подразделяют на живые и инактивированные. Живые вакцины это биологические препараты, содержащие штаммы вирусов, утратившие способность вызывать клинически выраженное заболевание, но сохранившие способность репродуцироваться в организме восприимчивого животного и стимулировать выработку специфических факторов противовирусного иммунитета (антител). Для изготовления живых вакцин используют селекционированные естественные, аттенуированные и гетерологические штаммы вирусов. Естественные(выделенные из природы) авирулентные или слабовирулентные штаммы - это спонтанные мутанты, утратившие способность вызывать заболевание, но сохранившие иммуногенные свойства. Аттенуированные, т. е. ослабленные экспериментатором штаммы это индуцированные мутанты. Их получают в лабораториях путем целенаправленного воздействия на эпизоотические штаммы различными физическими и химическими мутагенами или чаше путем пассажей вирулентного вируса через гетерологические (маловосприимчивые) биологические системы. Инактивированными вакцинами являются все вакцины, содержащие убитый неактивный вирус. В инактивированных вакцинах вирусный геном должен быть инактивирован полностью, поэтому основное требование в технологии получения инактивированных вакцин – необратимая инактивация генома при максимальном сохранении антигенов. Применяемый с этой целью инактивирующий фактор должен повреждать нуклеиновую кислоту и в минимальной степени затрагивать белки и полисахариды. Для этого используют формальдегид, гидроксиламин, βпропионлактон, УФЛ, температура. Технология получения инактивированных вакцин требует большего по сравнению с живыми вакцинами количества вируса 66. Лабораторная диагностика бешенства. Лабораторная диагностика бешенства включает: - обнаружение специфических телец-включений Бабеша-Негри при гистологическом исследовании; - выявление вирусного антигена в реакции иммунофлуоресценции; - выявление вирусного антигена в реакции иммунодиффузии; - постановку биопробы на белых мышах. Обнаружение специфических телец-включений проводят после окраски зафиксированных препаратов из левой и правой сторон головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кора полушарий, продолговатый мозг) по Селлерсу или Муромцеву. При этом тельца Бабеша-Негри по окраске по Селлерсу выглядят как четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розовокрасного цвета в цитоплазме, при окраске по Муромцеву – в виде темно-синих гранулярных образований, чаще расположенных вне нервных клеток. Постановка РИФ. Одновременно с исследованием на обнаружение телецвключений вторую часть мазков исследуют в реакции иммунофлуоресценции. В диагностической практике проводят прямой метод РИФ с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина. Фиксацию препарата осуществляют в охлажденном (8-10ºС) ацетоне на срок не менее 4 часов. Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках или (чаще) вне клеток. Диагноз на бешенство считается установленным при обнаружении в нескольких полях зрения достаточного количества (не менее 10) типичных гранул с характерным свечением или множества мельчайших точек. В случае получения отрицательных результатов гистологического и серологического (в РИФ) исследований проводят постановку РИД с целью выявления антигена и постановку биопробы. Постановку РИД проводят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ный агаровый гель по общепринятой методике. Антигеном для реакции служат измельченные пинцетом в гомогенную пастообразную массу кусочки головного мозга. При этом антиген помещают в 4 раздельные центральные лунки: материал с аммоновых рогов, коры полушарий, мозжечка и продолговатого мозга. При получении отрицательного результата окончательный диагноз ставят по результатам биопробы. Биопробу проводят на 6-10 молодых мышатах массой 16-20 г или мышатах-сосунах массой 6-8 г, причем последние являются более чувствительными к вирусу. Перед постановкой биопробы из оставшегося материала готовят 10-%-ную суспензию по общепринятой методике. Половину из используемых в эксперименте мышей заражают интрацеребрально в дозе 0,015 – 0,03 мл, а остальных – подкожно в верхнюю губу в дозе 0,1-0,2 мл. Ежедневное наблюдение за мышами ведут в течение 30 дней, причем гибель в первые 48 часов после заражения не учитывается. Экспериментальная инфекция у мышей характеризуется появлением симптомов, включающих взъерошенность шерсти, горбатость спины, нарушение координации движения, параличи задних, а затем и передних конечностей, после чего наступает гибель животного. У павших животных исследуют головной мозг на наличие телец Бабеша-Негри, в РИД и РИФ. По результатам биопробы ставят окончательный диагноз. Ретроспективную серодиагностику бешенства не применяют вследствие значительной сероконверсии вируса и высокой смертностью больных животных, а характер изменения титра антител исследуют только для оценки поствакцинального иммунитета. В мировой практике при осуществлении международной торговли животными проводят диагностику инфекции реакцией нейтрализации в культуре клеток или твердофазным ИФА |