Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
31. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток. В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток. Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 27). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными). Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды). Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп. Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой). Субкультуры.В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2–3 сут формируется монослой. Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2–5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8– 10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток. 32. Морфология фага. Размеры – 20 – 200нм. Большинство фагов имеют форму головастиков. Наиболее сложно устроенные фаги состоят из многогранной головки, в которой располагается нуклеиновая кислота, шейка и отростки. На конце отростка располагается базальная пластинка, с отходящими от нее нитями и зубцами. Эти нити и зубцы служат для прикрепления фага к оболочке бактерии. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент – лизоцим. Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. У многих фагов отросток окружен чехлом, который у некоторых фагов может сокращаться. Различают 5 морфологических групп 1. Бактериофаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом 2. Фаги с длинным отростком, но не сокращающимся чехлом 3. Фаги с коротким отростком 4. Фаги с аналогом отростка 5. Нитевидные фаги Химический состав. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белков. Большинство из них содержит 2хнитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Некоторые фаги содержат одну нить ДНК или РНК. Оболочка фагов – капсид, состоит из упорядоченных белковых субъединиц – капсомеров. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент – лизоцим. Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. Фаги хорошо переносят замораживание, нагревание до 70, высушивание. Чувствительны к кислотам, УФ и кипячению. Фаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействую со специфическими рецепторами клеток. 33. Специфическая профилактика. Применяют сухие вирус-вакцины из лапинизированных и культуральных аттенуированных штаммов вируса чумы свиней. Для пассивной иммунизации используют противочумную гипериммунную сыворотку крови. 34. То же, что и в 31. 35. Реакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов. Она применяется в двух направлениях:1) для идентификации вирусов;2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках. Компоненты:1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты. Реакции нейтрализации ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных. Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения. 36. Вирус оспы овец и коз. 41. Вирус оспы свиней. Оспа млекопитающих и птиц – острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными стадийными поражениями кожи различных участков тела и слизистых оболочек. Особенностью патологических изменений при оспе является их стадийность: розеола (локальное покраснение участка кожи), папула (уплотнение участка кожи за счет клеточной инфильтрации), везикула (наполнение его везикулярной серозной жидкостью), пустула (переход серозного воспаления в гнойное) и круста (появление корочек на месте поражения). Возбудителями оспы животных являются вирусы из семейства Poxviridae, подсемейства Chordopoxvirinae различных родов: Capripoxvirus – овец и коз, Suipoxvirus – свиней. Все оспенные вирусы являются ДНК-геномными и содержат в составе вириона фермент для собственной транскрипции, реплицируются в цитоплазме клеток. вирион оспы кирпичеобразную форму, до 450 нм. В окружающей среде устойчив, чуствителен к выс. Температуре, УФ, кислоты, кипечение моментально. В антигенном отношении различные вирусы оспы млекопитающих идентичны в пределах родов. В основном вирусы оспы млекопитающих гемагглютинирующими свойствами не обладают. Клин. Признаки: Абортивная форма – на теле небольшое количество оспин, быстро исчезают. Сливная – отдельные везикулы сливаются, образуя большие пузыри дальше струпья, под ними гной. Геморрагическая – множественный кровоизлияния внутри пустул и в коже, кровь из носа, крововая рвота, понос. Патмат: легкие, л/у увеличены и гиперемированы, печень, сердце, почки. Лаб. Диагностика: обнаружение элементарных частиц по Морозову, РГА, РИФ, электронная микроскопия. Выделение вируса на кк, кэ и молодняк животных. Исключить : ящур, везикулярную болезнь, паршу. Иммунитет – после переболевания стойкий и продолжительный. Лечение гамма-глобулины. Профилактика вакцина гидроксидалюминевуюформолвакцину и сухую культуральную вирусвакцину. 37. Классификация РНК- содержащих вирусов. В основу классификации положен тип нуклеиновой кислоты, размер и тип симметрии вирусного нуклеокапсида, наличие или отсутствие внешней оболочки. · вирусы, содержащие двуцепочечную РНК Как и большинство РНК-вирусов, представители класса III реплицируют геномную РНК в цитоплазме и используют полимеразы хозяина в меньшей степени, чем ДНК-вирусы. Класс III включает в себя два крупных семейства Reoviridae и Birnaviridae. Репликация моноцистронная, геном сегментирован, каждый ген кодирует один белок. · вирусы, содержащие одноцепочечную РНК Классы включают вирусы двух типов, репликация которых не зависит от стадии клеточного цикла. Наряду с вирусами, содержащими двуцепочечную ДНК. · вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК(IV класс) Непосредственно на (+) геномной РНК вирусов IV класса может идти синтез белка на рибосомах клетки хозяина. Вирусы классифицируют на две группы, в зависимости от особенностей РНК: 1. у вирусов с полицистронной мРНК трансляция приводит к образованию полипротеина, который затем разрезается на зрелые белки. С одной цепи РНК может синтезироваться несколько разных белков, что снижает длину генов. 2. вирусы со сложной транскрипцией содержат субгеномные мРНК, синтез белка идет со сдвигом рамки считывания, также используется протеолитический процессинг полипротеинов. Эти механизмы обеспечивают синтез разных белков с одной цепи РНК. Примеры вирусов данного класса включают представителей семейств Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Arteriviridae и Togaviridae. · вирусы, содержащие одноцепочечную (−)РНК (Vкласс) Геномные РНК вирусов класса V не могут быть транслированы на рибосомах клетки хозяина, предварительно требуется транскрипция вирусными РНК-полимеразами в (+)РНК. Вирусы пятого класса классификации по Балтимору классифицируют на две группы: 1. вирусы, содержащие несегментированный геном, на первом этапе репликации происходит транскрипция (−)РНК вирусной РНК- зависимой РНК-полимеразной в моноцистроннуюмРНК, и далее синтезируются дополнительные копии (+)РНК, служащие матрицами для синтеза геномных (−)РНК. Репликация геномных РНК таких вирусов осуществляется в цитоплазме. 2. вирусы с сегментированными геномами, репликация геномных РНК которых происходит в клеточном ядре, вирусная РНК- зависимая РНК-полимераза синтезирует моноцистронныемРНК с каждого сегмента генома. Наибольшим отличием данной группы вирусов от другой группы пятого класса состоит в том, что репликация осуществляется в двух местах. Представители данного класса входят в состав семейств: Arenaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Filoviridae и Rhabdoviridae. · вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК, реплицирующиеся через стадию ДНК Наиболее хорошо изученным семейством данного класса вирусов, являются ретровирусы. Вирусы класса VI используют фермент обратную транскриптазу для превращения (+)РНК в ДНК. Вместо использования РНК в качестве матрицы для синтеза белков, вирусы этого класса используют матрицу ДНК, которая встраивается в геном хозяина ферментом интегразой. Дальнейшая репликация происходит при помощи полимераз клетки хозяина. · вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК, реплицирующиеся через стадию одноцепочечной РНК Небольшая группа вирусов, в состав которой входит вирус гепатита В, представитель семейства Hepadnaviridae, имеют двуцепочечную геномную ДНК, которая ковалентно замкнута в форме кольца и является матрицей для синтеза мРНК вируса, а также субгеномных РНК. Субгеномная РНК служит матрицей для синтеза ДНК-генома ферментом обратной транскриптазой вируса. 38. Вирус болезни Ауески. Болезнь Ауески (псевдобешенство, зудящая чума, бешеная чесотка, инфекционный бульбарный паралич) – остро протекающая болезнь всех видов сельскохозяйственных животных, пушных зверей и грызунов. Характеризуется признаками поражения головного и спинного мозга, сильным зудом и расчесами. Возбудитель: сем. Герписвирус. ДНК содер. Вирион шаровидной формы 180-190 нм. Суперкапсидная оболочка, кубического типа укладки. Репродукция в ядру клетки. Устойчив к рН 5-9, чувствителен к эфиру, хлороформу, желчь, высокие температуры, 3% р-р щелочи и 5% хлорной извести. Культивируется на взрослых кроликах, 10-12 сут. кэ на хао или желчный мешок. Тропизм: нервная ткань. Клиника. Инкубационный период – 1,5 суток – 10-12 дней в зависимости от метода заражения, вирулентности вируса и устойчивости животного. У свиней клиника протекает без признаков зуда. Материал для исследования: смывы из носовой полости и кровь (лучше парные сыворотки), от трупов - кусочки головного мозга, легких, печени, селезенки. Экспресс-метод - обнаружение вирусного антигена в РИФ. Вирусологический метод: а) выделение вируса на культуре клеток почек поросят: б) биопроба на кроликах (характерны зуд и расчесы в месте заражения).Идентификация: РИФ, РН.Ретроспективная диагностика: по приросту титра антител в парных выворотках. Следует дифференцировать болезнь Ауески от бешенства, чумы свиней, гриппа, рожи, отравления поваренной солью. Применятся живая вирусвакцина ВГНКИ, инактивированная культурная вакцина – иммунитет на 6-10 месяцев.За рубежом используются субъединичные и рекомбинантные вакцины. 39. Индуцированные мутации. Физический мутагенез. Индуцированные мутации - это процесс возникновения мутаций под направленным действием физических, химических или биологических факторов. Такие факторы получили название мутагены или мутагенные факторы. 1. физический мутагенез. Физические мутагены: - ионизирующие излучения – волновые (рентген, космические лучи) и корпускулярные (β-частицы, протоны, нейтроны, α-частицы) Проходя через живое вещество, γ и рентгеновские лучи вырывают электроны из внешней оболочки атома или молекулы. Поэтому заряженные частицы – электроны присоединяются к нейтрально заряженным частицам. В результате нейтральная молекула приобретает заряд, что ведет к дальнейшим превращениям веществ. частота индуцируемых мутаций зависит от дозы радиации. При этом не имеет значение дана доза однократно или порциями, хотя эффект более выражен при однократном введении дозы. Ионизирующее излучение в большей степени увеличивает частоту перестроения хромосом, чем частоту генетических мутаций. не все повреждения генетического аппарата, вызванные облучением реализуются в виде мутаций. множество из них исправляются за счет репаративных ферментных систем. 1. Если вся доза дается сразу, то в клетках одновременно присутствуют митотические концы разорвавшихся хромосом. Концы могут соединяться в любых сочетаниях – инверсии, транслокации и делеции. 2. Если доза дается в несколько приемов, то часть ранее возникших перестроек успевает восстановиться до воздействия новой порции. - Сильное ионизирующее излучение (ультрафиолет) – большая длина волны и меньшая энергия. УФ-лучи не ионизируют атомы, таким образом возбуждение их оболочки, следовательно, различные химические реакции в этих клетках и, => мутации. Мутагенные свойства УФ-лучей зависят от длины волны. Наиболее мутагенные с длиной волны = 260 нм. И чем меньше длина волны, тем меньше мутагенные свойства. Это связано с тем, что ДНК поглощает УФ-лучи с длиной волны 260 нм. Проникающая способность УФ мала, => нет действия на половые клетки, и мутагенные свойства проявляются у низших организмов. У человека действует на кожу. 40. Методы идентификации вирусов на куриных эмбрионах Используют КЭ в вирусологии в основном для тех же целей, что и ЛЖ: обнаружения в патматериале активного вируса биопробой; первичного выделения вируса; поддержания вирусов в лаборатории; титрования вирусов; накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин; как тест-объект в реакции нейтрализации. Строение: 1.Скорлупа 2.Подскорлупная оболочка 3.Воздушная камера 4.Аллантоисная полость 5.Желточный мешок 6.Альбуминный мешок 7.ХАО – хорион-аллантоисная оболочка 8.Амниотическая полость 9.Эмбрион 10.Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной). С 5-12день КЭ могут использоваться для заражения 6 методов заражения КЭ: 1)Заражение в аллантоисную полость (грипп, болезнь Ньюкасла). КЭ фиксируют вертикально тупым концом вверх, на стороне зародыша на 5-6мм выше границы воздушной камеры делают отверстие 1мм. 2)на ХАО (оспа, чума плотоядных): а)Ч/з естественную воздушную камеру. КЭ в штатив тупым концом вверх, в скорлупе против центра воздушной камеры окно 15-20мм. Снимают подскорлупную оболочку. На ХАО наносят 0,2 мм суспензии. Отверст. лейкопластырем. б)Ч/з искусственную воздушную камеру. Штатив горизонтально зародышем вверх. Делают 2 отверстия: над центром воздушной камеры, другое 0,2-0,5см сбоку, со стороны зародыша. Из первого зародыша отсасывают воздух, образуется искусственная воздушная камера, дном которого является ХАО, на него наносят инфекционную жидкость, заклеивают лейкопластырем. 3)В желточный мешок (хламидий, б. Марека): а)КЭ помещают в штатив вертикально. Отверстие над центром воздушной камеры, иглу на 3,5-4см под углом 45, противоположно месту нахождения зародыша. б)аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном штативе КЭ; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. 4)В амниотическую полость (грипп, болезнь Ньюкасла): закрыт способ – зародыш. вверх. Иглу вводят затупленным концом по направлению к зародышу откр. способ – над воздушной полостью отверстие 1,5-2,5см. Удаляют подскорлупную оболочку. Пинцет продавливают ХАО по направлению к зародышу. Затем амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну, водят туда суспензию. Отпускают. Лейкопластырь. 5)Заражение в тело зародыша. 6)в кровеносные сосуды. 42. Использования метода иммунофлоуресценции в вирусологии. В основе метода лежит явление люминесценции, сущность которого в том, что поглощая различные виды энергии (световую, электрическую) атомы некоторых веществ переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения. Люминесценция наблюдается в виде флуоресценции - свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания. Фосфоресценция – свечение продолжающееся длительное время и по окончании процесса возбуждения 43. Титр вируса и его определение. Титр – это кол-во вируса, содержащееся в ед объема материала. Вир можно титровать по инфекционному действию. Эф-ть д-ия вир вырыражается в эффект-х дозах(ЭД). В зависимости от эффекта : 1)Гибель: ЛД50 (летальная доза)-лаб жив, ЭЛД50(эмбр лет доза)-кур эмбр, кк-нет гиб Берем несколько пробирок(напр 5). В каждую пробирку по 9мл физ р-ра. Затем в 1 проб из бутыли с вир переносим 1мл вир(пипетку в физ р-р),размешать. Затем из сод-го 1й во 2 1мл смеси,из 2й в 3ю и тд…из последний не выливаем. Каждым разведением мы заражаем четное число биол систем(не менее 4х)-4 кур эмбриона. Ставим в термостат, затем учитываем. Положит-й эф-т(+)-гибель 1(1:10)++++ 2(1:100)++++ 3(1:1000)++-- 50% эф-т =>в этом развед сод-ся 1ЭД50 =1 ЭЛД50 4(1:10000)---- 5(1:100000)---- Титр вир=числу(во сколько раз надо развести исх-й вир,чтобы пол-сь 1ЭД50) Если эф-т не виден, то подсчёт инфекц титра проводят по методу Кербера или методу Рида и Менча. Формула Кербера: lgЛД50=lgD+lgd/2-lg∑r/n Вир имеют белок- гемагглютинин. Они склеивают эр. Титр опред-ют по эф-ту гемагглютинации. 1)Готовят последовательное 2х кратное развед вир(1:2,1:4,1:8…) 2)В каждое развед доб-ют равный V 1% взвеси эритр-в опред-го вида и оставл-ют на контакт 3)Уч-т рез-т РГА в крестах: |