Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
73. строение куриных эмбрионов и методы их экспериментального заражения. Существует шесть методов заражения эмбрионов. Наиболее часто используют заражение в аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку, реже – в амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко – в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса, а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1–0,2 мл инфекционного материала. Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед: заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого концы, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллатиоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят па хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверсто закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином. На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения Заражение в амниотическую полость.Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие и скорлупе на глубину 2-3 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком. После чего оба отверстия заливают парафином. Заражение в аллантоисную полость.Заражение производят и затененном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином. Заражение, в желточный мешок.Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный меток был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объёме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют. Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств данного вируса. Инфицированные яйца ежедневно проверяют, овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта. Наличие вируса в заражённом эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона. Вирусы, не обладающие гемагпотинирующей активностью, выявляют с помощью РСК. Для выявления вируса в аллантоисной или амниотической жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА. 74. Принцип расчета титра вируса по 50%-му инфекционному действию. Этот метод более универсален. Количество вируса (титр вируса) при этом измеряется в эффективной 50% дозе – ЭД50. 1 ЭД50 = доза вируса, способная вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных тест-объектов. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект - лабораторные животные (обычно белые мыши), куриные эмбрионы или культура клеток. Инфекционный эффект или действие вируса на разных тест-системах может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. У лабораторных животных и куриных эмбрионов действие вируса оценивается в летальной и инфекционной дозах: 1 ЛД50 - доза вируса, убивающая 50% лабораторных животных; I ЭЛД50 - доза вируса, убивающая 50% куриных эмбрионов; 1 ИД50 - доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50% зараженных лабораторных животных; 1 ЭИД50 - доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куриных эмбрионов. В культуре клеток действие вируса оценивается по цитопатическому эффекту или действию (ЦПД): 1 ЦПД50 - доза вируса, вызывающая цитопатический эффект в 50% пробирок с зараженной культурой клеток. Количество ЭД50 (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, будет выражением титра вируса в этом материале. Так, запись Т = 103.48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждом 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103.48 доз, каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50% пробирок с культурой клеток. Метод титрования вирусов по 50% инфекционному действию пригоден для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую тест-систему. Недостатком является трудоемкость, длительность и необходимость статистического расчета. Методика определения титра вируса в единицах 50% инфекционного действия (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) заключается в том, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала. Это и будет титр вируса. Для этого: 1) из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. Количество разведений необходимо делать больше (т.е. столько, чтобы последнее наиболее высокое уже не давало инфекционного эффекта совсем). Для 10 последовательных разведений в каждую из 10 стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем в первую вносят ровно 1 мл исследуемой суспензии. Перемешивают содержимое первой пробирки, набирают 1 мл смеси и вносят во вторую пробирку, перемешивают содержимое и 1 мл из второй пробирки - в третью, и т. д, 2) одинаковыми объемами каждого разведения вируссодержащего материала заражают чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов. В каждой их группе требуется не менее 4-6 тест-объектов (для статистической достоверности); 3) по истечении времени учитывают результат действия вируса на зараженные объекты (гибель, заболевание, патологоанатомические изменения или цитопатический эффект). Гибель лабораторных животных, КЭ впервые 48 часов считают неспецифической. Учет заканчивают через 2 -3 суток после прекращения падежа; 4) определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Действие вируса определяют в ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50. Считают, что доза в этом разведении соответствует 1 ЭД50. Дозу вируса подсчитывают различными методами (по Риду и Менчу, Керберу). Для проведения титрования из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 1:10, т.е. 10-1 до 1:10.000.000, т. е. 10-7, и более (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 и т.д.). Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса, их нужно готовить столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разведение уже не давало бы инфекционного эффекта. Инфекционное действие вируса (величина инфекционного эффекта) с каждым разведением убывает пропорционально логарифму разведения (или дозы). То есть при разведении 1:100 (10-2) инфекционное действие уменьшается в два раза, если 1:1000 (10-3) в три раза и т. д. Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном одинаковом объеме заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры тканей). При этом учитывают тропизм и дозы вируса, общепринятые для данного способа введения материала. В каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т. к. при меньшем количестве статистическая обработка материала будет иметь слишком большую погрешность. Метод Рида и Менча основан на логической предпосылке о том, что животные (и другие модели), погибшие при заражении каким- либо разведением вируса, например 10-5, погибнут и при заражении более низким разведением (10-4, 10-3) вируса. Если же животное не пало при данном разведении, то останется живым и при заражении более высоким разведением (10-6, 10-7). На этом основании полученные результаты подвергают интерполяции и выражают их в виде кумулятивных данных, на основании которых рассчитывают % летальности. 75. Вирус оспы птиц. Оспа птиц — контагиозная болезнь птиц разных видов (кур, голубей, канареек, скворцов, перепелов, индюков, фазанов, попугали), протекающая с поражением слизистых оболочек ротовой, носовой полостей и кожных покровов преимущественно неоперенных участков тела. Болезнь распространена повсеместно. Отмечается ее сезонное осенне-весеннее усиление. Экономический ущерб заключается в снижении яйценоскости и вынужденном убое больных и переболевших птиц. Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Poxviridae, подсемейству Chordopoxvirinae и роду Avipoxvirus. Вирионы овальной или прямоугольной формы, размером в среднем 140—450 нм и со сложным типом симметрии. Состоят из нуклеоида, содержащего геном, боковых тел и наружной липопротеидной оболочки, образующей выступы. Геном представлен двуспиральном линейной ДНК. Антигенная структура. Вирионы вируса оспы содержат наружным протеидный антиген в составе поверхностных ворсинок (филаментов). Наружный антиген индуцирует образование антигемагглютинирующих вируснейтрализующих антител, которые обеспечивают развитие иммунитета. Внутренние полипептиды индуцируют комплементсвязывающие и преципитирующие антитела. Антигенная вариабельность и родство. Штаммы вируса оспы кур идентичны в антигенном отношении, но различаются по спектру патогенности, вирулентности и гемагглютинирующей активности. . Инкубационный период болезни длится в среднем 15—20 дней. В дальнейшем у больной птицы ухудшается аппетит, появляется вялость, снижается яйценоскость. Болезнь может приобретать кожную, дифтеритическую или смешанную формы течения. При кожной форме чаще на гребне, бородках, сережках, основании клюва, щеках, клоаке, иногда по всему туловищу развиваются бородавчатые образования (оспины). Течение чаще доброкачественное, летальность низкая. При дифтеритической форме развивается дифтеритическое воспаление слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, а также гортани, трахеи, бронхов и глаз. Прогноз неблагоприятный, летальность в холодное время года может достигать 70 %. Локализация вируса. В организме больной птицы вирус локализуется в оспинах бесперьевых участков головы, на слизистой глотки, гортани, трахеи. На 17—20-й день после инфицирования вирус можно обнаружить в крови, почках, яичниках, селезенке, головном мозге. У переболевшей птицы остается длительное вирусоносительство (более 10 мес). Источник инфекции — больная птица. Переносчиками возбудителя служат клещи и клопы. Вирус передается контактным путем через загрязненные инвентарь, одежду персонала, непосредственно через поврежденную кожу, а также воздушно-капельным и алиментарным путями через загрязненные корм и воду. В естественных условиях некоторые штаммы вируса оспы кур патогенны только для кур, другие — для кур, голубей и индеек. Иммунитет и специфическая профилактика. В нашей стране разработаны и применяются живые аэрозольные вакцины двух типов: из нереактогенного гетерологичного штамма вируса оспы голубей Нью-Джерси и из природно-ослабленного штамма оспы кур АШ- 27. А также разработана вакцина из аттенуированного культурального штамма К вируса оспы кур, которую вводят парентерально в перепонку крыла. Иммунитет у привитых цыплят в среднем сохраняется в течение 3—6 мес, у кур — до 10 мес. 76. Этапы репродукции вирусов. В интернете чушь написана. Проще по лекции (2-3) 77. Явление гемадсорбции, его использование в вирусологии. РГАд.Гемадсорбция – соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток – впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках. Методика РГАд состоит в следующем. На 3–4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2–3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5–10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной. В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким: – эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы свиней); – эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа); – эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа). Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов. 78.Вирус чумы крс. Чума крупного рогатого скота (лат. —Pestisbovum) — остро протекающая контагиозная септицемическая болезнь домашних и диких жвачных, проявляющаяся высокой лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспа-лительно-некротическим поражением слизистых оболочек пищеварительного тракта, образованием эрозий и язв в ротовой полости, диареей, ринитом, конъюнктивитом, слизисто- гнойными истечениями из носа и глаз, чрезвычайно высокой заболеваемостью и летальностью. Возбудитель болезни. Возбудитель — РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Morbillivirus семейства парамиксовирусов. Частицы вируса полиморфны. Большинство вирионов круглой или овальной формы, размером 120...300нм; обнаружены и нитчатые формы. Инфекционный ви-рион содержит преципитирующий, комплементсвязывающий антигены. Антигенных вариантов нет. Между вирусами чумы крупного рогатого скота, кори человека и чумы собак установлено антигенное и иммунологическое родство. Вирус пантропен — разносится кровью по всему организму и в наиболее высоких титрах обнаруживается в лимфатических узлах, слизистой оболочке сычуга, легких и почках. Вирус пассируют в куриных эмбрионах и культурах клеток, в которых проявляется цитопато-генное действие (ЦПД). Эпизоотология. К чуме восприимчивы животные всех видов из отряда парнокопытных. В естественных условиях из сельскохозяйственных животных чаще болеют крупный рогатый скот, зебу и буйволы, реже — овцы, козы, верблюды, яки и свиньи. Из диких животных поражаются представители почти 60 различных видов. Однокопытные плотоядные, птицы, обезьяны и человек невосприимчивы. Источник возбудителя инфекции — больные и переболевшие чумой животные, выделяющие вирус во внешнюю среду с истечениями из носовой полости (вирус появляется в носовом секрете за 2 дня до начала лихорадки и обнаруживается до 9-го дня болезни) и половых органов (выделяется из влагалища в течение 3 нед после клинического выздоровления), с калом (с 3...8-го дня болезни), мочой (с 1...8-го дня), молоком, слюной, конъюнктивальной слизью и кровью (при кровотечениях). В крови вирус появляется за 12...48 ч до начала лихорадки, и вирусемия продолжается до 8-го дня болезни. Вирус сохраняется в язвах сычуга крупного рогатого скота до 140 дней после клинического выздоровления. Чума отличается высокой контагиозностью. В естественных условиях крупный рогатый скот заражается через слизистую оболочку носовой полости, конъюнктиву и пищеварительный тракт. Экспериментально удавалось воспроизвести болезнь путем перорального, подкожного и внутримышечного введения вируссодержащей крови, слюны, носовой слизи, мочи, кала, желчи, слез, влагалищного экссудата больного животного. Свиньи легко инфицируются алиментарно. В свежих очагах эпизоотии носят взрывоподобный опустошительный характер с 90...100%-ной летальностью животных всех пород и любого возраста. В стационарных очагах чума регистрируется у животных в возрасте от 10 мес до 2 лет; летальность составляет 5...20 %. Патогенез. Вскоре после заражения вирус проникает в кровь, разносится по всему организму и размножается преимущественно в лимфатических узлах, костном мозге, в легких, слизистых оболочках дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Рано развиваются угнетение и затем блокада иммунной системы. В результате повреждения стенок кровеносных сосудов начинается некроз эпителия слизистых оболочек, появляются эрозии и язвы. В некротизированных участках и по краям эрозий откладывается фибрин и образуются псевдомембраны, в результате чего возникают рыхлые наложения на стенке кишечника и характерные изменения во рту. Вследствие тяжелого поражения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта резко нарушается пищеварение, развивается диарея, что приводит к быстрому обезвоживанию организма и исхуданию животного, нарушению кровообращения, сердечной недостаточности и смерти. У крупного рогатого скота и буйволов различают три стадии болезни: лихорадочную (продромальный период), стадию повреждения слизистых оболочек и стадию выраженных желудочно-кишечных расстройств. Иммунитет, специфическая профилактика. Переболевший чумой крупный рогатый скот приобретает сначала нестерильный, затем стерильный, практически пожизненный иммунитет (на срок более 5 лет). Телята от переболевших матерей получают колостральный иммунитет. Пассивная иммунизация защищает животных от заболевания только в течение 14 дней. Ее применение целесообразно при кратковременной опасности заражения, например при транспортировке разных групп скота. Для активной иммунизации используют инактивированные и живые вакцины. В нашей стране выпускают вирус-вакцину против чумы крупного рогатого скота сухую культуральную из штамма К37/70, которая вызывает в организме привитых животных выработку специфических антител, передающихся потомству и защищающих молодняк в первые месяцы жизни. Лечение. Лечение при чуме крупного рогатого скота не разработано и запрещено. Всех больных и подозрительных по заболеванию чумой животных немедленно убивают бескровными методами, трупы вместе с кожей сжигают. |