)
Проблемы, связанные с воспризводимостью ввода пробы при КЭ, обусловлены, кроме всего прочего, небольшой разницей в давлении и коротким временем ввода пробы. Большие вводимые объемы при нормальных условиях очень быстро уменьшают эффективность разделения за счет перегрузки по объему. Поэтому пытаются вводить большие объемы и концентрировать зоны перед разделением. Это удается за счет использования различных эффектов перед собственно разделением с помощью КЗЭ.
Эффекты концентрирования получаются, если работают с негомогенными буферными системами. В простейшем случае проба вводится из чистого водного раствора. Из-за различия в электропроводности между раствором пробы и буфером проба сначала ускоряется в сильном поле до границы между буфером и раствором пробы, но затем замедляется после входа в область буфера с пониженнной напряженностью поля. Этот эффект уже был показан на рис. 21 и при электрокинетическом вводе пробы описан как "электростэкинг".
Рис. 22. Схематическое
представление
электрического
разделения
пробы. I
1
, I
2
, I
3
соответствуют потокам в различных
частях капилляра; n
1
соответствует
количеству пробы перед ее разделением;
n
2
-
введенное
и
n
3
-
оставшееся
количества пробы.
В качестве альтернативы раствору пробы с высоким сопротивлением непосредственно перед вводом пробы в капилляр вводится "водяная пробка". Падение напряжения в непроводящей электричество воде так велико, что следующая зона пробы концентрируется при имеющемся там существенно более высоком напряжении.
При этом степень концентрирования доходит до 100 (см. рис.23).
При "электростэкинге", однако, концентрация молекул пробы во время процесса ввода падает на входе в капилляр до достижения равновесного состояния. Это будет представлять проблему для ионов с малой подвижностью, поскольку в этом случае допустимая длина вводимой зоны пробы будет превышена прежде, чем будет достигнуто равновесное состояние. В этом случае достигается очень незначительное концентрированно пробы. ЭОП также играет при "электростэкинге" важную роль. Если
ЭОП и направление перемещения ионов ориентированы одинаково, это также будет мешать концентрированию пробы. При вводе пробы на входе в капилляр образуется зона, которая обладает очень малой электропроводностью. При увеличении подвижности ЭОП она будет формироваться быстрее и возможность "электростэкинга" сужается.
При миграции пробы против ЭОП нужно различать два случая: если
µ
el
>>µ
ЭОП
, то возможно получение хороших результатов; при
µ
el
>µ
ЭОП
проба не может быть введена.
Резюмируя, можно сказать, что при нормальной полярности прибора КЭ (выход
33 заземлен) и направленном к катоду ЭОП могут концентрироваться положительно заряженные молекулы пробы, в то время как при противоположном поле при вводе пробы концентрируются анионы.
Еще эффективнее может концентрироваться проба, если поле после гидродинамического ввода прикладывается на короткое время в противоположном направлении. При условии, что ионы, которые нужно определять, перемещаются в направлении против ЭОП, капилляр может заполняться раствором пробы почти до детектора (гидродинамический ввод), и раствор пробы может удаляться из капилляра исключительно за счет инверсии полярности. Одновременно ионы, перемещающиеся против ЭОП, могут концентрироваться в пограничном слое между раствором пробы и разделительным буфером. Прежде, чем этот пограничный слой достигнет входа в капилляр, с помощью переполюсовки источника напряжения может начинаться собственно разделение. Точный момент времени для переполюсовки можно установить, следя за изменением тока, так как ток в процессе концентрирования постоянно увеличивается. Причина этого в том, что зона раствора пробы (с высоким сопротивлением) удаляется из капилляра, Когда сила тока достигает примерно 90% от максимального значения (капилляр заполнен только разделительным буфером), то источник напряжения может переполюсовываться и молекулы пробы, удерживаемые в узкой зоне вблизи входа капилляра, разделяются. На рис. 24 показаны отдельные стадии этого способа ввода, который в целом называется "стэкинг" с обращением поля.
Из-за большого вводимого объема ионы пробы концентрируются примерно тысячекратно. Недостатком метода является то, что при слишком поздней переполюсовке часть ионов пробы выходит из капилляра, и что могут анализироваться только либо анионы, либо катионы.
Рис. 23. Разделение РТН-аргинина и
РТН-гистидина. А) электрокинетический
ввод из буфера; В) электрокинетический
ввод из воды; С) электрокинетический ввод
из воды с "водяной пробкой" между пробой и
буфером.
Другая возможность использовать негомогенность буфера для концентрирования молекул пробы состоит в выборе буфера и (или) растворов пробы с различными значениями рН. При этом подвижность ионов при прохождении скачка рН на приграничной поверхности между буфером и раствором пробы изменяется и
34 происходит концентрирование. Например, белки вводятся из раствора при высоком значении рН и разделяются в буфере с низким значением рН, поэтому молекулы пробы перемещаются в щелочной среде из-за их отрицательного заряда сначала в направление анода, протонируются в приграничном слое буфера и прекращают свое перемещение (отсутствие эффективного заряда). Благодаря диффузии и миграции протонов и гидроксид-ионов ступенька рН исчезает, что приводит к разделению пробы с помощью КЗЭ. Аналогично концентрируются пробы с помощью ИЭФ. ИТФ может также использоваться как "стэкинг" в режиме реального времени. Сам принцип разделения будет описан позже Для проведения "стэкинг"-процесса необходимо использовать веду- щий и конечный электролиты, чьи подвижности несколько больше (ведущий электролит) или несколько меньше (конечный) чем подвижности ионов пробы. При этом в большинстве случаев в качестве разделительного буфера будет применяться ведущий электролит и после ввода пробы часть капилляра будет заполнена конечным элект- ролитом. Вначале, после включения напряжения, компоненты пробы подвижность которых находится между подвижностью ведущего и конечного электролитов, за счет
ИТФ концентрируются в узкие полосы через некоторое время зона конечного электролита из-за диффузии и миграции ионов расплывается и это приводит к зонно- электрофоретическому разделению ионов. При этом методе порог обнаружения снижается примерно в 500 раз. В этой форме можно проводить ИТФ-обогащение компонентов пробы с помощью коммерческой аппаратуры. Более эффективного обогащения можно достичь применяя два разделительных капилляра. Сначала ИТФ проводится в относительно толстом капилляре, снабженном на конце детектором по электропроводности. С помощью измеренного там сигнала можно точно определить, когда сконцентрированная проба может переводиться в разделительный капилляр, установленный также на конце этого капилляра. При этом достигалось примерно 10000- кратное обогащение. Другой метод совмещает хроматографическое обогащение с последующим КЗЭ. Для этого предлагаются специальные капилляры, которые со стороны
«входа» имеют зону несколько миллиметров заполненную хроматографической фазой (в основном С18).
Обогащение осуществляется при прокачивании раствора пробы через капилляр, при этом гидрофильные молекулы пробы адсорбируются в режиме обращенной фазы и могут быть десорбированы после ввода пробы с помощью метанола или ацетонитрила.
При этом растворитель может переноситься к стационарной фазе как с помощью давления, так и с помощью ЭОП При этом, однако, важно, чтобы пространство между стационарной фазой и детектором заполнялось разделительным буфером.
Преимуществом этого метода является его пригодность для неионной гидрофобной пробы. Эта техника, однако, из-за плохой воспроизводимости, а также из-за высокой стоимости разделительного капилляра мало распространена. Обзор методов снижения порога обнаружения при КЭ за счет концентрирования пробы в режиме реального времени дан в таблице 11.
6.4. Термостатирование Термостатирование служит главным образом отведению джоулева тепла.
Воздушные и жидкостные термостаты
находят применение в коммерческих приборах, где температура может изменяться от 15 °С до 60 °С. Помимо охлаждения капилляра за счет окружающего воздуха, имеются также хорошо разработанные методы отвода джоулева тепла от капилляра. В большинстве случаев отвод тепла достигается за счет сильного воздушного охлаждения, при котором капилляр обдувается воздухом со скоростью до 20 см/с. Еще эффективней отвод тепла с помощью охлаждающей жидкости (тепловое сопротивление 2.5*10
-4
В/см*К) вместо воздуха. Она будет омывать кроме этого "вход" около детектора и "выход" около капилляра. При этом с водой можно
35 работать до разделительного напряжения 15 кВ, для более высокого напряжения применяют дорогостоящие фторуглеводороды.
Влияние температуры на эффективность и селективность разделения в настоящее время еще обсуждается. По этой причине в случае коммерческих приборов термостатируются только капилляры
(или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. Для разделения фрагментов ДНК в заполненных гелем капиллярах было показано, что хотя с повышением температуры производительность разделения снижается, относительная миграция, т.е. селективность разделения, может улучшиться.
Дополнительно к термостатированию капилляра в некоторых приборах имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы. Это особенно полезно при анализе термолабильных проб. Недостатком этих конструкций является то, что помимо пробы охлаждается также разделительный буфер и поэтому существует разность между температурой разделительного буфера и выбранной температурой раздели- тельного капилляра.
6.5. Детектирование
При детектировании в КЭ компоненты пробы проходят через часть капилляра, в которой происходит детектирование в режиме реального времени или детектируются на конце капилляра в режиме с разделением времени. При этом, в отличие от хроматографии, необходимо обратить внимание на то, что через детектор пробы движутся с различными скоростями.
6.5.1. Уф-детектирование
Большинство аппаратурных требований не в последнюю очередь относятся к детектированию, так как при детектировании непосредственно в колонке УФ- поглощение происходит в слое очень малой толщины. Несмотря на это, наиболее часто применяемыми детекторами для измерения УФ-поглощения являются детекторы, применяемые в ВЭЖХ. Из-за очень малой толщины слоя (средняя величина внутреннего диаметра капилляра) к детекторам предъявляются высокие требования, касающиеся чувствительности, шумов, влияния светорассеяния и т.д. Для того, чтобы избежать потери эффективности из-за смешивания вне капилляра, детектирование осуществляют прямо в капилляре.
Типичная ширина зоны в капилляре находится в пределах 5 мм (N= 500000), что соответствует объему 10 нл (капилляр диаметром 50 мкм). Этот крайне малый объем является также причиной очень высокой чувствительности по массе, часто встречающейся в рекламе. Мировым рекордом является в настоящее время порог обнаружения в 300 молекул при отношении сигнал/шум три к одному для аминокислот и индуцируемой лазером флуоресценции. Для рутинного применения, однако, более важна концентрационная чувствительность. Она более чем скромна из-за короткого пути поглощения (средний диаметр капилляра).
При УФ-детектировании в КЭ концентрационная чувствительность в 30-100 раз ниже, чем в ВЭЖХ. Это зависит для поперечно облучаемых капилляров от шумов детектора и эффективной толщины слоя, которая отличается от номинальной (равной диаметру капилляра) в сторону уменьшения. Заметно мешает также частичное свето- рассеяние из-за несовершенной фокусировки (свет стенок капилляра) и неидеальной цилиндрической формы капилляра. Оптимизацией оптики (щель, линза и т.д.) можно в основном исключить эти эффекты. Очень трудной оптимизацию оптики УФ-детекторов для КЭ делает также полное внутреннее отражение. На рис 25 показаны рассчитанные
36 световые пути для различных апертур диафрагмы и капилляров. Большинство фирм- производителей применяют поэтому или фокусирующие системы линз, которые освещают область капилляра примерно в 0.5 нм и меньше, или щели, которые имеют ширину от 50 до 200 мкм и длину от 100 до 300 мкм.
Рис. 24. Обогащение
пробы
с
помощью
изменения
направления
поля.
Существует много примеров улучшения чувствительности при УФ-опредёлении в КЭ за счет увеличения толщины слоя детектирования Чтобы увеличить толщину слоя и снизить границу обнаружения, были протестированы различные экспериментальные разработки
Помимо применения капилляров прямоугольной формы, было также изучено применение в КЭ известных из микро-ВЭЖХ Z-ячеек.
Таблица 11.
Методы концентрирования («стэкинг»-мвтоды) в КЭ
Метод
Снижение порога обнаружения
Применимость
Примечание "Электростэкинг"
10-100 прямая
Быстро развивающийся метод
Результат зависит от электропроводности раствора пробы и подвижности ионов пробы
Обращение поля
50-1000 прямая
Развитие методов для катионов и анионов различно
ИЭФ
10-100 прямая
Хорошо применимо для слабых кислот и оснований
37
ИТФ
100-1000 условная
Необходима адаптация метода для каждой новой молекулы пробы
Хроматографичес кое обогащение
100-500 только со спе- циальным ка- пилляром
Необходим дорогой и трудно устанавливаемый капилляр
Применение прямоугольных капилляров улучшает детектирование примерно в 10 раз. Практическая польза этого улучшения может не реализоваться из-за больших проблем при вводе пробы.
Применение Z-ячейки в КЭ не повышает чувствительность определения, так как помимо сигнала за счет светорассеяния также сильно увеличиваются шумы. Новейшие разработки этих систем показывают, что за счет сферической линзы на стороне источника света непосредственно перед изломом капилляра светорассеяние может быть минимизированно.
Благодаря этому можно достигнуть улучшения чувствительности примерно в 11 раз для Z-ячейки с длиной светового пути 3 мм. При выбранной длине пути 3 мм отсутствия влияния или очень малое влияние на эффек- тивность следует ожидать только для "широких" пиков. Из ВЭЖХ известно, что объем пика должен быть в 5 раз больше, чем объем ячейки детектора. Это означало бы для ячейки длиной 3 мм в КЭ, что пик должен иметь в капилляре ширину 1.5 см. Однако, поскольку в капиллярном электрофорезе происходит детектирование в режиме реального времени, и благодаря малому объему ячейки детектора и отсутствию соединительных элементов размывания зон не происходит, это правило, конечно, не вполне применимо.
Удлинение участка детектирования, как в случае описанной Z-ячейки со световым путем 3 мм, имеет определенное влияние на эффективность и, как следствие, на разделение зон пробы, особенно, если в течение короткого времени анализа достигается высокая эффективность. При эффективности анализа 500 тыс. теоретических тарелок и времени миграции 5 минут от начала колонки до ячейки де- тектора ширина пика составляет 1.0 мм.
Это отчетливо указывает на несоответствие между объемами детектирования и пика в Z-ячейках, Такие проблемы менее существенны в капиллярах с ячейкой детектирования, имеющей форму пузырька, так как объем пика при прохождении ячейки детектирования остается приблизительно постоянным, и длина пика в капилляре будет сокращаться. Поэтому с увеличением внутреннего диаметра длина пика автоматически сокращается. Это относится не только к
прохождению зон веществ через ячейку детектора, но также и к электрофоретическому перемещению веществ, так как они перемещаются вдоль линий поля через весь объем ячейки детектирования.
Рис. 26 показывает структуру и расположение стандартных блоков детекторов с одной длиной волны, сканирующих детекторов, а также ДМД. Наиболее часто используемым является УФ-детектор с постоянной или изменяемой длиной волны. Для этого в качестве источника света должен использоваться непрерывный излучатель.
Даже если энергия света из-за этого значительно снижена, возможна работа в области длин волн от 190 до 320 нм.
Еще большие длины волн вряд ли можно использовать, так как только очень немногие молекулы обладают поглощением в этой области. Рис. 27 показывает сравнение интенсивности света дейтериевой лампы и некоторых других дискретных излучателей. При этом интенсивность света дискретных излучателей выше, чем у дейтериевой лампы. Это наглядно показывает возможности оптимизации УФ-
38 детектирования за счет повышения количества испускаемого света. Ртутную (185 нм и
254 нм) или цинковую (214 нм) лампы удается использовать только в одноволновых детекторах. Количество света, производимого этими лампами, может быть примерно в
50 раз больше, чем в случае употребляемых обычно дейтериевых ламп, так как в дан- ном случае не возникают потери, связанные с дифракцией на решетке.
Рис. 25. А) апертурная диафрап-ta
шириной 50 мкм, капилляр с внутренним
диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350
мкм;
В) апертурная диафрагма шириной 145 мкм,
капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и
внешним диаметром 350 мкм; С) апертурная
.циафрагмл шириной 350 мкм, капилляр с
внутренним диаметром 50 мкм и внешним
диаметром 350 мкм; D) с линзой, капилляр с
внутренним диаметром 75 мкм и внешним диа-
метром 275 мкм; Е) с линзой, капилляр с
внутренним диаметром SO мкм и внешним
диаметром 350 мкм.
Рис. 26. Путь свети
различных.
УФ-
детекторов для КЭ. А -
детектор одной длины
волны с ртутной лампой
(1), фильтр (5); В -
многоволновой
детектор
с
дейтериевой
и
вольфрамовыми лампами
(2),
поворачиваемое
зеркало (3) и
решеточный
мо-
нохроматор (6); С—
быстросканирующий
детектор
с
враща-
ющимся
решеточным
монохроматором; D -
ДМД (8).
Несмотря на незначительную толщину слоя, запись УФ-спектров возможна с помощью чувствительных быстрых сканирующих детекторов или ДМД.
Применением многоволнового детектора в КЭ могут быть привнесены известные из
ВЭЖХ преимущества. К ним относятся облегчение оптимизации буфера за счет
39 автоматического распознавания пика, контроль гомогенности пика за счет сравнения спектров в пределах пика, а также оптимизация чувствительности для веществ с сильно различающимися УФ-спектрами за счет интегрирования сигналов при различных длинах волн.
Вставить рис 27 стр 63
Рис. 27. Сравнение полезной интенсивности светя дейтериевой, ртутной и
цинковой ламп, измеренной с помощью фотоэлемента.
Из-за осложнений в процессе записи данных в случае быотросканирующего детектора измеряется только ограниченное количество точек
Б секунду. Поэтому шумы детектора при приеме спектральной информации при переходе от одноволнового режима к режиму быстрого сканирования увеличиваются примерно в 10 раз. Кроме того, спектральные данные из-за медленной записи при появлении пика с очень крутыми краями могут быть представлены искаженно. Диодная матрица, напротив, позволяет записывать многоволновой спектр в режиме реального времени. При этом УФ-спектры не могут искажаться за счет медленной записи данных. Так как именно при КЭ, когда из- за высокой эффективности пиков и короткого времени анализа возникают очень резкие края пиков и может реализоваться ширина пиков в несколько секунд, особенно важна быстрая запись спектров.
Пробы, не обладающие поглощением в УФ-области, можно обнаружить с хорошей чувствительностью на коммерческих УФ-детекторах с помощью непрямого УФ- детектирования. Для этого к буферу добавляют электролит, обладающий УФ- поглощением, подвижность которого близка к подвижности разделяемой пробы.
Количество добавленного вместо пробы электролита (механизм вытеснения) должно быть чрезвычайно мало из-за соблюдения условия необходимой электронейтральности, так что буфер в данном случае будет обладать более высокой прозрачностью, что выражается в появлении отрицательного пика. Это схематично представлено на рис.
28. Примеры применения даются в разделе, посвященном анализу ионов.
Чувствительность обнаружения при непрямом УФ-детектировании зависит от молярного коэффициента экстинкции добавляемого фонового электролита, поглощающего в УФ- области, и соответствует чувствительности обнаружения нормального УФ-поглощения.
Рис. 28. Принцип непрямого УФ-
детектироваиия.
6.5.2. Фпуоресцентное детектирование
Помимо УФ-детекторов, с недавнего времени выпускаются также флуоресцентные детекторы. Отличия от детекторов ВЭЖХ заключаются в основном в длинах волн источников света. Кроме обычно используемых дейтериевой и импульсной ксеноновой ламп предлагаются также существенно более дорогие лазерные системы, причем
40 возбуждение в них происходит в видимой области длин волн, так что должны применяться соответствующие производные проб.
Возможно также непрямое флуоресцентное детектирование, при этом речь может идти об универсальной методике детектирования, если имеется в распоряжении подходящий флуорофор без эффекта тушения.
6.5.3. Прочие методы детектирования
Предлагаются методы электропроводности, а также другие электрохимические детекторы. Однако в настоящее время они еще коммерчески недоступны. В качестве примера здесь можно упомянуть определение следов щелочных и щелочно-земельных металлов с помощью микроэлектродов непосредственно в капилляре.
При детектировании по электропроводности возникает проблема, которая заключается в том, что помимо фоновой электропроводности электролита обнаруживается и некоторая электропроводность в зоне вещества. Техника подавления этого нежелательного явления, используемая в ВЭЖХ, здесь не применима. Успешное использование детектора по электропроводности в КЭ описано много раз. С помощью амперометрического детектирования удается прямое обнаружение мейромедиаторов в нервных клетках, причем толщина капилляров, которые применяются для разделения, составляют 5 мкм.
Низкие скорости потока (100 нл/мин) делают возможным сочетание КЭ с масс- спектрометрией (МС). Главная проблема при таком сочетании состоит, однако, в том, что в переходнике из капилляра в источник ионов элюент не будет всасываться из капилляра за счет существующего там вакуума. При падении давления 1 бар в капилля- ре длимой 1 м (внутренний диаметр 50 мкм) линейная скорость потока составляет 1 см/с. Возникающий в результате этого ламинарный параболический профиль потока привел бы к заметной потере эффективности. По этой причине перед ионизацией нужно проводить "улучшение" потока в капилляре. Ионизация электрораспылением позволяет осуществлять МС-детектирование биополимеров в результате образования множества заряженных частиц. В качестве примера показано разделение четырех фосфониевых ионов. Если записать общий ионный ток, то получим только два пика. Селективное детектирование отдельных соединений возможно при определенном соотношении масса/заряд (правая часть рис. 30).
Рассматривались также другие методы детектирования (спектроскопия комбинационного рассеяния, измерение
радиоактивности в режиме реального времени, круговой дихроизм, коэффициенты преломления света, капиллярная вибрация). Их возможности для рутинного использования в настоящее время еще не определены.
Само собой разумеется, что могут использоваться
УФ-неактивные и нефлуоресцирующие пробы, если применять реагенты, употребляемые обычно для получения соответствующих производных перед разделением хромофоров и флуорофоров. В результате этого, однако проявляют себя недостатки предколоночного происхождения, известные из ВЭЖХ. Специальные реагенты для электрофореза, имеющие помимо хромофора еще и соответствующий заряд, являются темой для обсуждения.
41
Рис. 29 Конструкция интерфейса соединения КЭ-МС.
При детектировании на основе лазерной флуоресценции для определения с помощью возбуждения на длине волны около 380 нм в большинстве случаев пробу перед разделением необходимо подвергнуть воздействию флуоресцентной метки. В качестве примера назовем разделение 3-(4-карбоксибензоил)-2-хинолин- карбоксиальдегид (КБХКА)- производных аминокислот.
Описаны первые экспериментальные разработки для получения производных после прохождения колонки, однако они пока еще не пригодны для использования вне стен исследовательских лабораторий.
В таблице 12 представлены достижимые границы обнаружения наиболее часто встречающихся систем детектирования. Из таблицы видно, что благодаря небольшому объему может достигаться высокая чувствительность по массе. Концентрационная чувствительность находится в пределах ВЭЖХ.
Рис. 30. МС-дегектирование при КЭ: а) универсально!,- дстсктчрона-ние при
регистрации полного ионного тока; и) tV.7i.-A 7 ивное детектирование при
регистрации отдельных читнчтенпи массы к заряду.
42
6.6. Количественный анализ
На воспризводимость получаемых результатов влияет множество факторов: разница в электропроводности между разделительным электролитом и раствором пробы, большое различие в концентрации компонентов пробы и их электрофоретическая подвижность, различие в составе пробы. С другой стороны, преимущества КЭ проявляются тогда, когда не- обходимо проанализировать очень малые объемы проб; например, при 5 анализе ионов в дождевых каплях или в биологических пробах.
Рис. 31 Некоторые часто используемые реакции получения производных.
Таблица 12
Методы детектирования в КЭ
Принцип детектирования
Граница обнару- жения.
Абсолют- ное коли- чество
[моль]
Граница обнаруже- ния. Кон- центрация
[моль/л]
Типовое при- менение
Примечание
43
УФ-поглощение
10
-15
-10
-13 10
-7
-10
-4
Ароматические соединения, белки, нуклеиновые кислоты
В настоящее время стандартное детектирование в
КЭ, имеется во всех коммерческих приборах
Непрямое
УФ- детектирование
10
-16
-10
-13 10
-8
-10
-4
Ионы метал- лов, амины, органические и неоганичес-кие ионы, сахара
Имеются в коммерческих приборах
Флуоресценция
10
-18
-10
-13 10
-9
-10
-4
Производные аминокислот,
ДНК, пептиды, белки
Для большинства проб необходимо получение производных
Лазерная флуоресценция
10
-21
-10
-17 10
-13
-10
-7
Фрагменты ДНК, производные аминокислот
Лазер еще очень дорог, в основном применима только в видимой и УФ-об- ластях
Непрямая флуоресценция
10
-16
-10
-14 10
-7
-10
-5
Спирты, амины, анионы, катионы, сахара
Известно только немного приложений
Амперометрия
10
-16
-10
-14 10
-8
-10
-6
Легко окисляе- мые и вос- станавливаемые вещества, например, нейромедиаторы
Пригоден для капилляров с внутренним диаметром до 2 мкм
Кондуктометрия
10
-18
-10
-16 10
-7
-10
-5
Ионные пробы, например, ионы металлов, амины, карбо-новые
Недостаток: трудное манипулирование при за- мене капилляра
Потенциометрия
10
-19 10
-8
Щелочные и щелочноземе- льные ионы, селективное определение за счет ионоселективных микроэлектродов
Недостаток: трудное манипулирование и по- лучение микроэлектродов
МС
10
-17 10
-10
-10
-8
Белки, пептиды, мониторинг лекарств
Отсутствуют проблемы совмещения, доступны коммерческие интерфейсы
44
Радиоактивные измерения
10
-18
-10
-16 10
-15
-10
-13 32
Р и
14
С в био- химических объектах
Хорошая чувствительность определения с помощью системы остановки потока
Миниатюризация ввода пробы в коммерческих приборах, между тем, прогрессирует так сильно, что из общего объема пробы 3 мкл в автоматизированных приборах можно сделать множество вводов. При этом, однако, не исключено, что состав пробы во время ввода изменится. Причина заключается в занесении буфера в пробу или в селективном вводе определенных компонентов пробы при электрокинетическом вводе. Работа со столь малыми объемами затруднена, если объем пробы в автозагрузчике может изменяться за счет испарения. Эти эффекты можно уменьшить при помощи охлаждения пробы или использования герметичного затвора в сосуде для пробы. Если нео- бработанные данные анализа представлены в форме хроматограмм или фореграмм, то количественные результаты анализа получают или определением высоты пиков, или после интегрирования в виде площади пиков. Только в области определения примесей количественное выражение их концентрации через высоту более надежно, чем через площадь пика. Этому есть две причины: первая заключается в том, что при анализе примесей высота пика пропорциональна их концентрации, так как эффекты насыщения и перегрузки можно исключить, а вторая заключается в том, что ошибка автоматизированного определения высоты в этом случае меньше, чем при интегрировании пиков. Как только высота пиков возрастает, интегрирование становится рациональным и необходимым.
Это будет показано на примере калибровочной кривой натрия при определении ионов металла с применением непрямого УФ-детектирования. В то время, как линейная область при использовании высоты пика для количественного определения очень мала, и кривая уже при 4 ppm выходит в область насыщения, при представлении зависимости площади пика от концентрации корреляционная зависимость линейна. Причиной нелинейности
калибровочной кривой с высотами пиков является, кроме всего прочего, треугольная форма пиков. Как можно показать теоретически, только при гауссовой форме пиков концентрация пропорциональна как площади пика, так и его высоте. При других формах пика интегрирование обязательно для того, чтобы получить линейную калибровочную кривую.
Рис. 32 показывает полученную калибровочную кривую в области концентраций от 1 до 10 ppm.
При КЭ, в отличие от ВЭЖХ, пробы перемещаются мимо детектора не с одинаковыми скоростями. По этой причине компоненты пробы с одинаковыми молярными коэффициентами экстинкции при одинаковом вводимом количестве проявляются в виде пиков различной площади.
В простейшем случае УФ-детектора это можно легко показать, если рассчитать время, за которое движущиеся объекты с различными скоростями проходят область УФ- детектирования.
Аналогичные явления встречаются при каждом разделении в КЭ. Компоненты пробы, которые первыми движутся мимо детектора, обладают высокой скоростью, поэтому ширина их пиков на самописце меньше. Табл. 13 показывает зависимость изменения ширины пика (в сив мм при записи на самописце) стандартного прямоугольного пика шириной 0.5 см. Если бы в КЭ отсутствовало уширение полос, то первые пики были бы самыми узкими, так как они перемещаются мимо детектора быстрее других.
45
Рис. 32. Калибровочные
кривые, построенные по высоте
пика (А) и плотили пикя (В).
Условия: прибор для КЭ - Millipore
Waters Quanta 4000; капилляр - 75
мкм, 50/56 см; поле - 446 В/см;
буфер: S мМ имидазол/серная
кислота, рН 5.3; ввод пробы
гидростатический, 30 с,
детектирование непрямое. 214 им;
проба - калий, натрий, барии,
кальций,
магний
и
литии
с
концентрациями 4, 6, 8 и lOppm.
Таблица 13
Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от
скорости миграиии
Скорость пика [мм/с]
Время пика в "окне" [с]
Ширина пика на самописце [мм]
0.1 10 16 0.5 2.0 3.2 1.0 1.0 1.6 5.0 0.2 0.3 10 0.1 0.2
Скорость движения самописца: 60 см/мин.
Таблица 14
Зависимость площади и ширины пика от времени миграции.
Время миграции
Скорость перемещения
[мм/с]
Время в де- текторе [с]
Ширина пика на са- мописце [см]
Площадь пика сигнала с h=10см
[см
2
]
90 0.58 0.87 0.144 1.44 120 0.43 1.16 0.192 1.92 150 0.35 1.44 0.239 2.39
Если привести полученные площади пиков к времени миграции, то получим сигнал пробы, независящий от скорости перемещения. С помощью такого нормирования удается в некоторых случаях сгладить колебания времени миграции.
46
Колебания ЭОП являются тем фактором, который через скорость миграции непосредственно влияет на площадь пика. На рис. 33 для некоторых тестовых соединений представлены времена миграции, соответствующие первым 27 вводам пробы. После первых 4 вводов (нестационарный период) достигается первое постоянное значение, при котором время миграции колеблется весьма слабо. После 9 вводов пробы капилляр был помещен на 48 часов в разделительный буфер и после этого использовался вновь. При этом уже после короткой переходной фазы появляется большой ЭОП. Это плато остается постоянным при последующих 20 вводах.
Рис.33. Воспроизводимость времени миграции.
Эти эксперименты ясно показывают, что после короткого времени установления равновесия могут быть получены воспроизводимые условия анализа. При замене буфера необходимо, однако, менять и капилляры или, по крайней мере, промывать их новым буфером от 10 до 15 минут. Так как ЭОП существенно более эффективно изменяет слой буфера на внутренней поверхности капилляра, чем приводимый в движение давлением поток, можно сильно сократить время установления равновесия, если промывать капилляр новым буфером и затем подвергать его действию электрического напряжения в течение 5-10 мин. Точное время уравновешивания капилляра нельзя привести, так как эта величина сильно зависит как от буфера, так и от конкретных стадий кондиционирования.
Кроме того, на воспроизводимость результатов сильно влияет количество вводимой пробы. Рис. 34 показывает воспризводимостъ системы и точность количественного анализа в зависимости от количества введенной пробы. В этом ряду измерений каждый из 12 анализов был проведен при различных концентрациях пробы, и определялись площади пиков. Для каждой новой концентрации пробы разделительный буфер в сосуде обновлялся. Статистическая обработка отчетливо показала, что при концентрации, которая превышает границу обнаружения от 20 до 50 раз, интегрирование пиков приводит к хорошим результатам. Воспроизводимость находится в пределах от 2 до 3%.
Ошибка очень быстро возрастает до 7% при интегрировании вблизи границы обнаружения. В этом случае эффективность, а поэтому и возможности разделения соседних пиков улучшаются. Эффективность падает с увеличением коцентрации, и при перегрузке системы (при использовании пробы с концентрацией 100 мМ) значение Н составляет 140 мкм.
При оптимизации анализа необходимо находить компромисс между воспризводимостью и эффективностью.
Если требуется количественно проанализировать пробу, то для получения надежных результатов следует работать с коцентрациями, превышающими границу обнаружения по крайней мере от 10 до 20 раз.
Только при оптимальных условиях удается получить хорошую эффективность и высо- кую воспроизводимость площадей пиков в пределах от 1.5 до 3%.
47
Рис.34.
Воспроизводимость (площади пиков каждых 12 измерений) и уширение полос в зависимости от концентрации пробы.
Эти опытные данные хорошо совпадают с характеристиками, приводимыми фирмами-производителями и опубликованными результатами.
Воспроизводимость, таким образом, зависит от многих индивидуальных факторов.
Сравнительные измерения на различных приборах КЭ в разных лабораториях показывают, что методы являются принципиально переносимыми, однако точность анализа колеблется от 1 до 2.5%. Эти испытания отчетливо показывают, что при оценке индивидуальных ошибок большее внимание следует обращать на те из них, которые вызваны аппаратурой и методом.
Таблица. 15
Сравнение воспроизводимости в различных лабораториях
Значение
ОСО
(п=10)
Лаборатория
1 2 3 4 5 6 7
Время миграции 1.3 0.3 0.8 0.4 0.6 0.5 0.2
Высота пика
1.0 2.3 2.1 . 1.7 1.4 1.7
Площадь пика
1.2 2.6 0,6 1.3 2.2 2.5 1.7
Нормированная площадь пика
0.8 2.5 1.0 1.2 2.1 1.1 1.7
Линейность калибровочной
0.999 0.997 0.999 0.992 0.996 0.990 0.994
Измерение: Beckman P/ACE в лабораториях 1,2,3 и 6; ABI в лабораториях 5 и 7;
SpectraPhysics в лаборатории 4.
Таблица 16
Факторы, влияющие на воспроизводимость
площадей пиков
Фактор
Причина, эффект
Улучшение за счет:
Колебания температуры
Различие в вязкости Вводятся различные количества пробы
Термостатирования капилляра и буфера
Испарение раствора пробы
Повышенная температура в автозагрузчике
Повышение концентрации пробы
Герметичного затвора у сосуда или охлаждения сосуда для пробы
48
Неточности при обслуживании системы
Детектор: увеличить время или понизить частоту данных
Неточный ввод пробы по давлению или времени
Применения больших времен ввода пробы
Пики становятся больше/меньше
Плохая система ввода пробы
Применения капилляров с плоской поверхностью среза
Удаления полиамида(2 мм) на "входе"
Плохая форма пика
Адсорбция на стенках
Покрытия или высоко- концентрированных буферов
Малое отношение сигнал/шум
Ошибка при интегрировании
Оптимизации параметров интегрирования
Повышения концентрации пробы "Стэкинга" образца
Изменение времени миграции
Значение рН буфера не постоянно
Проба адсорбируется на стенках
Изменяется уровень буфера
Более частой смены разделительного буфера
Кондиционирования капилляра с помощью NaOH
Электрокинетиче- ский ввод пробы
Площадь пика зависит от пробы
Гидродинамического ввода пробы
7. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ)
Зонный электрофорез является самым простым из описанных здесь способов разделения. Так как многие методы анализа, которые будут обсуждаться ниже, основаны на КЗЭ, необходимо детально рассмотреть его основные принципы. При зонном электрофорезе буфер, значение рН, а также напряженность поля во всем пространстве разделения остаются постоянными. Пробы разделяются за счет их различных подвижностей. Они вводятся в виде отдельной зоны на входе в капилляр и обнаруживаются в виде дискретных, отделенных друг от друга зон на конце детектора.
Назначение буфера при этой технике разделения - поддерживать постоянное значение рН и обеспечивать транспортный поток. Выбор рН буфера определяет заряд ионов пробы. Концентрация буфера влияет на ЭОП. Для дальнейшей оптимизации могут использоваться добавки к буферу.
49
Рис. 35. Схема КЗЭ: а) начальное
состояние, б) различная миграция отдельных
зон образцов, в) профиль напряженности поля
(сплошная линия) и рН (пунктирная линия) в
сечении разделительной камеры.
7.1. Влияние рН
Влияние рН на перенос пробы к детектору объясняется двумя причинами. Как уже отмечалось, на разделение, основанное на электрофоретической миграции, в большей или меньшей степени накладывается ЭОП, на величину которого влияет диссоциация поверхностных силанольных групп. Кроме того, подвижность ионов определяется их степенью диссоциации в несущем электролите и, следовательно, его значением рН.
Поэтому можно оптимизировать разделение изменением величины рН и вида буфера.
Наибольшее различие в способности к перемещению для слабых электролитов, т.е. наивысшую селективность получают тогда, когда значение рН буфера лежит между значением pKs компонентов пробы (Ks - константа диссоциации). Это поведение аналогично разделению в ионнообменной хроматографии.
Рис. 36. Зависимость
подвижности двух слабых кислот
от значения рН.
Достижимое разрешение двух пиков можно рассчитать по соотношению:
(
) (
)
2 1
1 2
/
2
w
w
t
t
R
+
−
=
где t- время миграции и w-ширина пика у его основания.
Переходя к уравнению и рассчитывая время миграции из подвижностей, получим:
(
)
(
)
ЭОП
D
V
R
µ
µ
µ
µ
−
−
=
/
177 0
1 2
Наилучшее разрешение получается, когда ионы движутся против ЭОП. Высокое напряжение также приводит к улучшению разрешения. Рис. 37 показывает рассчитанное разрешение пары пиков. Пик 2 перемещается при этом с подвижностью
0.5 см
2
/кВс, а пик 1 - с подвижностью, составляющей от 0 до 30 % от минимальной, в поле 300 В/см в капилляре длиной 50 см (D=10
-5
см
2
/с
-1
).
Недиссоциированные компоненты пробы движутся через капилляр со скоростью
50
ЭОП. ЭОП зависит, как было показано, также от рН и других свойств электролита, особенно от ионной силы. Возможности, которые появляются из-за наложения электрофоретического перемещения и ЭОП, можно продемонстрировать на примере разделения нуклеотидов. Если ЭОП направляется к катоду, нуклеотиды движутся к аноду, причем наиболее быстро движется трифосфат благодаря наиболее высокому заряду.
Даже при высоком значении рН (>10) ЭОП недостаточен для того, чтобы перенести трифосфат к детектору на катоде. Если электрофоретическая подвижность моно- и дифосфата меньше, чем ЭОП, оии переносятся к детектору, которого достигают через различное время. Разделение этой пробы показано на рис 38. При таких эксперимен- тальных условиях векторного вклада ЭОП недостаточно для переноса трифосфата, который в данном случае перемещается в анодное пространство. При переполюсовке можно определить трифосфат, в то время как ди- и монофосфаты вместе с ЭОП движутся в другом направлении.
Рис. 37. Разделительная
способность R двух
пиков
в
зависимости от ЭОП и разницы
лодвижностей.
При добавлении веществ, образующих ионные пары, подвижность изменяется так, что при анализе могут разделяться все нуклео-тиды. С помощью обращения ЭОП в результате модификации поверхности и одновременного изменения направления поля возможно разделение ионов с сильно различающимися подвижностями (см.анализ ионов).
Рис. 38. Разделение некоторых
нуклеотидов с помощью КЗЭ.
51 7.2.
Влияние концентрации буфера На рис. 6 уже было показано влияние ионной силы на ЭОП. Подвижность ионов должна зависеть от концентрации буфера. Важной является также ранее описанная зависимость интенсивности пиков от концентрации буфера. С одной стороны, концентрацию буфера нужно выбирать настолько высокой, чтобы значение рН оставалось постоянным и по возможности минимизировались бы эффекты перегрузки, но, с другой стороны, чтобы ЭОП еще допускал быстрое время анализа и не появлялось бы дополнительное уширение полос из-за тепловыделения. При этом, естественно, в капиллярах с маленьким внутренним диаметром применяется высокая концентрация буфера. Для большинства применяемых капилляров с внутренним диаметром 75 мкм применяются обычно буферы с концентрациями от 10 до 50 мМ.
7.3. Выбор буфера При выборе буфера следует обращать внимание на множество факторов. Как было показано, для достижения хороших результатов разделения необходимо совпадение подвижностей ионов пробы и буфера.
Концентрация ионов буфера должна быть больше, чем концентрация ионов в растворе пробы. Это приводит к симметричным четким зонам, так как только тогда на ионы пробы не влияет электрическое поле. С другой стороны, высокая ионная сила при заданном падении напряжения означает высокую плотность тока и поэтому увеличение джоулева тепла. Этот эффект можно просто измерить как отклонение от закона Ома. Преимущество буфера на основе орга- нического цвиттериона (например, 3(-циклогексиламино)-1-пропан-сульфокислотный буфер) с его очень маленькой электропроводностью является решающим при использовании капилляров с большим внутренним диаметром.
Значение рН определяет заряд пробы и поэтому существенно изменяет селективность разделительной системы. Обзор влияния отдельных параметров на систему разделения приведен на рис. 39.
Поскольку время анализа обратно пропорционально приложенному напряжению, при низкой концентрации буфера всегда достигается более короткое время анализа.
Резюмируя, можно предъявить следующие требования к буферной системе в КЗЭ:
- селективность для разделяемых ионов,
- стабилизация значения рН, буферная емкость (воспроизводимость) ,
- малое УФ-поглощение при детектируемых длинах волн,
- соответствие между подвижностями ионов пробы и буфера,
- противоионы должны обладать очень малой подвижностью (отсутствие тока),
- воспроизводимое получение буфера.
7.4. Области применения Электрофорез в гомогенной буферной системе при унифицированной напряженности поля является стандартным методом, который особенно эффективен при разделении маленьких молекул с постоянным зарядом. Поэтому можно без больших трудностей разделить алифатические и ароматические карбоновые кислоты, сульфокисло-ты, аминокислоты, фенолы, нуклеотиды и амины. Показательные примеры разделений, имеющих важное прикладное значение, приведены в двух обзорных статьях Кура (см. список литературы).
52
Рис. 39. Факторы, влияющие
на КЗЭ.
Примером может служить разделение природной смеси танинов, представленное на рис. 40. Показаны также УФ-спектры, записанные в режиме реального времени с помощью ДМД.
Как типичное применение КЗЭ, в следующей главе будет описано разделение ионов, не имеющих собственного УФ-поглощения. С помощью КЗЭ может также осуществляться разделение белков, если подавляется обменное взаимодействие между пробой и стенками капилляра. Этому разделению также посвящена отдельная глава.
Разделение заряженных молекул с относительно большими гидрофобными остатками можно улучшить добавлением ДЦСН; возможности оптимизации разделения методом КЭ с добавлением детерген-та подробно обсуждаются в разделе, посвященном мицеллярной электрохроматографии.
Рис. 40. Разделение смеси
танинов (галловых кислот).
53 8. Непрямое Уф-детектирование в КЭ
Вещества, которые во всей УФ-области обладают небольшим коэффициентом экстинкции, часто необходимо вводить в высокой концентрации, для того, чтобы получить сигнал этого соединения в детекторе. Однако для такой пробы разделительная система часто бывает перегружена и интенсивность пиков так мала, что невозможно практическое применение такого разделения. Существенно чувстви- тельнее такие вещества могут анализироваться при использовании других принципов детектирования (детектирование по электропроводности, потенциометрическое детектирование). Но поскольку до настоящего времени нет других детекторов для рутинных исследований в коммерческих приборах КЭ, непрямое Уф-детектирование в
КЭ имеет особенное значение.
Этот вариант УФ-детектирования известен в хроматографии с начала 80-х годов и применялся для детектирования ионов в ионно-обменной хроматографии (ИОХ). С помощью традиционных УФ-детекторов могут также обнаруживаться непоглощающие в
УФ-области вещества. Недостатки этого метода заключаются в следующем: 1 - появление так называемых "системных пиков", которые необходимо разделить от зон веществ при помощи дополнительного оптимизирования разделения; 2 - необходимость работы с высокими концентрациями буфера для вымывания проб из стационарной фазы, что в случае толстых слоев покрытия капилляра в ВЭЖХ приводит к большой величине адсорбции на стенках и, тем самым, к повышению шумов и других помех.
Большого развития этот метод не получил, поскольку появление детекторов по теплопроводности в ВЭЖХ при рутинных измерениях составило ему сильную конкуренцию. Кроме того, сочетанием детектирования по теплопроводности с техникой подавления ЭОП в рутинных измерениях удается увеличивать чувствительность детектирования в 10-100 раз.
В КЭ техника непрямого УФ-детектирования описана уже давно, еще до того, как стали известны ее большие возможности. Только позднее, в работах Джандика (Jandik) и Джонса (Jones) были выяснены преимущества применения непрямого УФ- детектирования в КЭ. Наряду с короткими временами анализов для многих анионов этот метод показал чрезвычайно низкую границу обнаружения в области концентраций от 0.1 мг/л и ниже.
8.1. Непрямое Уф-детектирование анионов
Из теории следует, что для детектирования анионов, непоглощающих в УФ-области, необходимо найти такую буферную систему, которая сама хорошо поглощает в этой области. При этом подвижность ионов буфера должна быть близка к подвижности анализируемых веществ. В качестве детектора анионов с большой и средней подвижно- стью подходят хромат-ионы, вводимые в раствор серной кислоты с концентрациями от 2 до 10 мМ. Для анализа быстрых и медленных анионов в одном потоке необходимо остановить или, что лучше, обратить направление потока и поменять полярность источника напряжения. В кварцевых капиллярах и приборах КЭ с нормальной полярнос- тью (катод на выходе), как показано на рис. 41, в направлении детектора (к выходу) движутся только медленные анионы, в то время как быстрые анионы сразу после ввода пробы выходят из зоны разделения в направлении анодного сосуда с буфером.
54
Рис. 41. Направления движения анионов при разделении методом КЭ. Заполненные стрелки - здектрофоретические подвижности, незаполненные - абсолютные подвижности и ЭОП. Случай А-способ с нормальной полярностью (нормальный способ), ЭОП направлен к катоду, выход заземлен. Случай В - способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к катоду, вход заземлен. Случай С - с переключенной полярностью и с анодным потоком, ЭОП направлен к аноду, вход заземлен. Ситуация, обозначенная как случай А на рис. 41, приводит к распределению подвижностей, при котором детектируются только медленные анионы. На рис. 42 а представлено такое распределение подвижностей для некоторых часто встречающихся анионов.
При этом абсолютные подвижности недетектируемых анионов рассчитываются по подвижности ЭОП и электрофоретической подвижности анионов
(см. рис. 43).
Быстрые анионы удается детектировать только при переключении полярности источника напряжения (случай В). В этом случае они движутся "вверх по течению" против направления ЭОП. Однако медленные анионы выводятся из капилляра быстрым
ЭОП. Это явление представлено на рис. 42 а, а также е виде исходных данных - на рис.
43. В этом случае разделение тестовой смеси, включая фториды, длилось примерно 9 минут, а фосфат-ионы детектировались спустя почти 20 минут в виде очень слабого пика. Применяя аппаратуру КЭ и буфер, обращающий ЭОП и направляющий его тем самым к аноду, удается разделять быстрые и медленные анионы в одном потоке
(случай С).
Рис. 42 а. Абсолютные подвижности при разделении анионов методом КЭ. Случай А - нормальный способ, ЭОП направлен к катоду, выход заземлен. Случай В - способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к катоду, вход заземлен. Условия: прибор КЭ Millipore Quanta 4000; капилляр 75 мкм, 50/56 см. Поле в случае А 600 В/см, в случае В - 600 В/см; буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, рН 6.8; ввод пробы гидростатический 4 см, 2 с; детектирование: 214 нм. Пробы- каждая по 10 мг/л : бромид - 1, хлорид - 2, сульфат - 3, нитрит - 4, нитрат - 5, азид - 6, фторид - 7, фосфат - 8, карбонат - 9, ацетат - 10, пропионат - 11, бутират -
12, валериат- 13, Д-глюконат - 14,
55
ЭОП- 15
Рис. 42 б. Абсолютные
подвижности при разделении анионов
методом КЭ. Сйутая С - способ с
переключенной полярностью, ЭОП
направлен к аноду, вход заземлен.
Условия: буфер - 5 мМ хромат/серная
кислота, 0.5 мМ ЦТАБ, рН 6.8;
остальные условия те же, что на
рис. 42 а.
В ЭОП, направленном к аноду, анализ тестовых смесей вплоть до детектирования фторидов длится до 2 минут, анализ смесей, включающих глюконаты, обладающие малой подвижностью, длится менее 3 минут. Нейтральные вещества достигают детектора через 5.5 минут.
Обращение потока, необходимое для разделения, в этом случае достигается введением ЦТАБ. Этот катионный ПАВ положительно заряженными концами молекул адсорбируется на отрицательно заряженных силанольных группах стенки капилляра и при очень низких концентрациях (меньше 0.1 мМ) образует слой, компенсирующий за- ряд поверхностных силанольных групп.
С помощью такой обработки капилляра электроосмотический поток прекращается.
При концентрациях ЦТАБ больше 0.2 мМ на стенках капилляра образуется двойной электрический слой. Вследствие гидрофобных взаимодействий на первый слой ЦТАБ накладывается второй электрический слой, молекулы которого направлены положи- тельными зарядами внутрь капилляра.
Рис.43. Разделение смеси
анионов в случае В. Условия: 75
мкм, 42/50 см; поде: - 600 В/см,
детектирование: непрямое, 10 см,
30 с; буфер: 5 мМ хромат/серная
кислота, рН 6.8; пробы: анионный
стандарт,
детектируются
анионы с 1 до 7 (сравн. рис.42)
В данном случае ЭОП обусловлен положительными зарядами на стенках капилляра и направлен не к катоду, а к аноду. Зависимость ЭОП от значения рН и концентрации
ЦТАБ показана на рис. 45. При этом следует работать с концентрациями ЦТАБ от 0.5 до
1 мМ, т.к. при более низких концентрациях требуется большее время установления равновесного потока, а также наблюдается нерегулярность подвижности ЭОП.
Наряду с ЦТАБ можно также использовать такие соединения, как соли додецилтриметиламмония и тетрадецилтриметиламмония или гексадецилпиридинхлорид. В частности, додецилтриметиламмоний-хлорид обладает
56 двумя преимуществами по сравнению со
ЦТАБ:
1
-концентрация его мицеллообразования выше, чем у ЦТАБ, 2 - растворимость его в воде больше, так что можно использовать концентрированные исходные растворы.
Подготовленный к использованию буфер с ЦТАБ и хроматом недостаточно стабилен, поэтому его следует ежедневно менять на свежий. Через несколько часов стояния появляется мелкокристаллический осадок, проявляемый на фореграммах как пик, который делает невозможным обработку результатов. Поэтому ежедневно необ- ходимо применять свежий буфер, при этом работа с исходными растворами требует много времени. При использовании хромат-раствора с концентрацией хромата 50 мМ с
0.2 мМ серной кислоты и раствора ЦТАБ с такой же концентрацией, перед употреблением необходимо отмерить об. 10 % хромат-раствора в измерительную колбу, долить водой примерно до 2/3 объема колбы, добавить об. 1 % исходного раствора ЦТАБ и затем долить водой до метки измерительной колбы. Только при точном соблюдении такой последовательности при смешивании не образуется упомянутый осадок. Исходные растворы можно использовать в течение несколько месяцев. Концентрацию 50 мМ для раствора ЦТАБ можно получить только при температурах около 25°С, а при 18°С раствор теряет прозрачность.
Рис. 44. Разделение
тестовых смесей анионов в
случае С. Условия:
прибор КЭ: Waters Quanta
4000. Капилляр 75 мкм, 50/58
см; запись данных: 20 Гц.
Поле: -517 В/см, непрямое
детектирование 254 нм, ввод
пробы гидростатический, 10
см, 30 с; буфер: 5 мМ
хромат/серная кислота, рН
8.0 с 0.5 мМ ЦТАБ: проба:
анионный стандарт с Юррт,
см. рис. 42.
Рис. 45. Зависимость
электроосмотических
потоков от значения рН при
различных
концентрациях
ЦТАБ. Условия: прибор КЭ -
Beck-man,
Р/АСЕ 2000;
капилляр 75 мкм, 40/47 см.
Поле:-532
В/см,
детектирование: 214 им, ввод
пробы давлением 3 с, буфер -
10 мМ фосфат; нейтральный
маркер: бензиловый спирт.
Из-за очень высокой эффективности (300 - 500 тыс. тарелок на метр) и коротких времен анализа не исключены проблемы записи данных. Для ширины пиков меньше
57 нескольких секунд достигается граница возможности записи данных для большинства приборов КЭ. Например, достичь необходимых для хорошего интегрирования 20 точек для каждого пика с частотой записи данных 20 Гц в этих условиях уже не удается.
Если вместо обращения потока проводить только его остановку, разделение анионов можно провести за 10-15 минут. Эта возможность часто рекламируется, однако для разделения анионов эта методика никаких преимуществ не дает.
Вещества, останавливающие, но не обращающие поток, представлены в таблице 17 вместе с уже упоминаемыми буферными добавками. Эти вещества, хотя и нейтрализуют отрицательный поверхностный заряд капилляра, однако двойной электрический слой не образуют и, тем самым, обеспечить избыточный положительный заряд на поверхности капилляра не могут.
Таблица 17.
Возможности влияния на ЭОП.
Буферные добавки
Используемые концентрации, мМ
Влияние
Проблемы
ЦТАБ
0.2-1.0
Обращение ЭОП
Мицеллообразование, растворимость до 50 мМ
ДДТАБ
0.2-2.0
Обращение ЭОП
Мицеллообразование
ГДПХ
0.2-1.5
Обращение ЭОП
Мицеллообразование, поглощение в УФ-области
SB 14 1 -10
Очень малый ЭОП
Спермин
2-10
Очень малый ЭОП
Образование ионных пар
Диэтилентриамин 1 -5
Очень малый ЭОП
Полиэтилен-амин
0.5-2.0
Обращение ЭОП
Покрытие SAX
-
Обращение ЭОП
Низкая стабильность
ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид
ДДТАБ - додецилтриметиламмонийбромид
ГДПХ - гексадецилпиридинхлорид
SB 14 - тетрадодецилдиметиламмонийпропансульфокислота.
SAX - сильный анионообменник
Наряду с регулированием ЭОП в разделении анионов большую роль играет также подвижность анионов буфера. Ниже приведены характеристики ряда анионов, поглощающих в УФ-области (таблица 18).
Таблица 18.
Буферные вещества для непрямого УФ-детекгирования анионов.
Буферный ион
Подвижность
(см
2
/кВ.с)
Область рН
УФ-область (нм)
Проблемы
Хромат -0.8 6-
10 <220 и 250 -280 Токсичен
Молибдат
-0.7
<290
Изополикислоты, начиная от рН 6
58
Сорбиновая кислота
0.24
>3 225 - 275
N-ацетил- триптофан
0.23
>4.5
<265
Триптофан 0.23
>8.5
<265 3-индолацетат 0.20
>5 214-275
Динитробензой ная кислота
0.22
>2
<260
Тринитробензо
-сульфоновая кислота
0.20
>2 220 -275
Получается только как раствор
Дили кол и новая кислота
0.23
>5
<220 и 245-265
Комплексообразование с кальцием
Нафтол-1- сульфоновая кислота
0.16
>2 200 - 225
Низкая растворимость в воде
Галловая кис- лота
0.26
>3
<230
Нестабильна
(окисляется)
(Подвижности определены при рН 9.0 в фосфатном буфере с концентрацией 10 мМ.)
Хроматные буферные системы применяли, в частности, при определении анионов в воде озера Байкал. Разделение их представлено на рис. 46. При этом ионы с большей подвижностью - хлориды, сульфаты и карбонаты - определяются количественно методом стандартной добавки, в то время как содержание нитратов и фосфатов вследствие низких концентраций определяются путем сравнения с внешним стандартом.
Результаты сравнения для сульфат-ионов показаны на рис. 47. Данные аналогичных измерений с помощью ИОХ хорошо коррелируют с результатами, полученными методом КЭ.
Рис. 46. Определение анионов в
воде, взятой с поверхности озера
Байкал. Условия: прибор КЭ - Waters
Quanta 4000. Запись данных: 20 Гц,
капилляр 75 мкм, 50/58 см; попе: -
431
В/см,
непрямое
детектирование 254 нм, ввод
пробы гидростатический, 10 см, 30
с; буфер: 5 мМ хромат/серная
кислота, рН 8.0, 0.5мМ ЦТАБ;
порядок выхода пиков: хлорид - 1
(0.5 ppm), сульфат - 2 (12.4 ppm),
нитрат - 3 (<0.5 ppm), фосфат –4
(<0.5ppm), гидрогексакарбонат - 5
(81.1 ppm).
Преимущества КЭ по сравнению с ИОХ заключаются в крайне коротких временах анализа и в возможности определять в одном потоке наряду с другими важными анионами также и карбонаты.
8.2. Непрямое Уф-детектирование катионов
Методом непрямого УФ-детектирования можно обнаружить также и катионы.
Впервые разделение катионов этим методом описано Ф.Форетгом в 1990 году. В его статье было показано, что метод КЭ при разделении лантанидов по эффективности,
59 времени анализа и разрешению пиков превосходит ИОХ. С помощью КЭ удается разде- лить все лантаниды, что невозможно сделать даже при оптимизации ионно- хроматографических систем.
Скачать 1.48 Mb.