Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 73. А) Соотношение между временем миграции и зна чением k'. В) Разделение методом МЭКХ ароматических соединений: буфер: 110 мМ ДДСН в 25 мМ борате, рН 8.5: капилляр 75 мкм, 50/70 см; напряжение 20 кВ, детектирование 200 нм; ! - формамид (to), 2 - анилин, 3 - фенол, 4 - бензиловый спирт, 5 - бензойная кислота, 6 - бензальдегид, 7 - нитробензол, 8 -фенилацетон, бензилцианид, 9 - ацетофенон, 10 - толуол, 11 -хлорбензол, 12 - этилбензол+о-ксилол, 13 - нафталин, 14 -суданIII (1мс). Таблица 26 ККМ и числа агрегирования (n агр ) некоторых детвргенгов. Детергент ККМ (мМ) N агр Децилсульфат натрия 33 41 Додецилсульфат натрия 8.2 64 Тетрадецилсульфат натрия 2.05 80 Гексадецилсульфат натрия 0.45 100 Лаурилметилсульфат натрия 8.7 - Хелат натрия 13 - Дегидрохелат натрия 10 - Таурохелат натрия 10 - Тауродегидрохелат натрия 6 - Децилтриметиламмонийбромид 65 - Додецилтриметиламмонийбромид 15 50 Тетрадецилтриметиламмонийбромид 3.5 75 Гексадецилтриметиламмонийбромид 0.92 61 Адсорбция молекул детергента на стенках капилляра приводит к обращению направления ЭОП уже при концентрациях несколько ниже ККМ. Вследствие этого анализируемые вещества движутся к аноду. Электрическое поле в данном случае должно налагаться таким образом, чтобы анод находился со стороны детектора. Противоион ионного детергента при данной температуре оказывает определенное влияние на ККМ. Например, ДДСН более растворим в воде, чем додецилсульфат калия. Если в буфере присутствуют ионы калия, это может привести к обмену противоионов, в результате чего растворимость детергента может уменьшиться настолько, что ККМ не будет достигаться. Разрешающая способность в методе МЭКХ определяется аналогично хроматографическому методу: С учетом подвижности мицелл получим соотношение для разрешающей 83 способности: Уравнение описывает зависимость разрешающей способности от факторов N, a, k', to/two. Разрешение растет пропорционально квадратному корню из числа тарелок. Чем больше наложенная разность потенциалов, тем число теоретических тарелок больше до тех пор, пока с увеличением переноса вещества в потоке джоулево тепло вырастет не слишком сильно. Среднее число теоретических тарелок для большинства веществ пробы лежит в пределах от 100 до 200 тысяч. Если эффективность заметно ниже, то это означает, что молекулы пробы адсорбируются на стенках капилляра. В этом случае капилляр следует промыть и условия опыта оптимизировать, например, с помощью изменения рН. Гидрофобные вещества пробы или анализируемые вещества с большими временами миграции дают, как правило, большее число теоретических тарелок вследствие того, что коэффициент диффузии мицелл меньше, чем для анализируемых веществ в буфере. Число теоретических тарелок несущественно зависит от длины капилляра, однако все же при использовании коротких капилляров вводимый объем должен уменьшаться для того, чтобы избежать уширения пиков, вызванного перегрузкой объема. Селективность а - важнейший фактор, т.к. за счет селективности можно достичь большого улучшения разрешающей способности. Селективность определяется коэффициентами распределения между подвижной и стационарной фазами и, следовательно, зависит от химических свойств разделяемой системы. На разрешающую способность можно воздействовать как изменением состава буфера, так и выбором другого детергента. Методом МЭКХ без труда можно разделить два вещества пробы, обладающие селективностью 1.02. С ростом величины к' разрешающая способность, обусловленная подвижностью стационарной фазы, растет не постоянно, а проходит через максимум. Эта характерная для МЭКХ зависимость представлена на рис. 74. При постоянной селективности расстояния межу максимумами пиков уменьшаются для маленьких и больших значений k'. С помощью расчетов можно показать, что оптимальное значение k' составляет (tмc/to) 1/2 Рис. 74. Зависимость между селективностью и значением k'. Как и в хроматографии, в МЭКХ значение k' зависит от коэффициента распределения через соотношение фаз' k'=KV MC /Vaq k- коэффициент распределения, V MC - объем мицеллы, Vaq - оставшийся объем буфера и УмсЛ/aq - представляет собой соотношение фаз. В отличие от хроматографии, соотношение фаз в методе МЭКХ зависит от объема мицелл и, тем самым, от концентрации детергента. Зависимость между k' и концентрацией детергента линейна. Таким образом, если известна величина ККМ, величиной k' можно управлять с помощью концентрации детерегента. В большинстве случаев во избежание слишком 84 больших потоков концентрация детергента лежит в интервале между 20 и 200 мМ. Линейная зависимость между k' и концентрацией детергента при разделении ароматических соединений показана на рис. 75. Влияние соотношения фаз на разрешение показано на рис. 76. Рост соотношения фаз приводит сначала к улучшению разрешающей способности, которая однако при дальнейшем увеличении соотношения фаз ухудшается. В представленных хроматограммах речь идет о расчетных величинах, которые делают этот эффект более наглядным. Вследствие того, что повышение концентрации детергента влияет также на ЭОП, вязкость и ионную силу буфера, на практике хроматограммы выглядят иначе. Рис. 75. Линейная зависимость между k' и концентрацией детергента. Капилляр 75 мкм, 50/57 см, буфер ДДСН в 50 мМ борате, рН 8.5, напряжение 20 кВ. Интервал времен миграции молекул пробы дается величинами to и tмс. Чем меньше отношение времен миграции tо/tмс, тем больше интервал времен миграции и, тем самым, разрешение. Влияние ЭОП на интервал времен элюирования показан на рис. 77. Уменьшение ЭОП приводит к росту интервала времен элюирования и, тем самым, к росту разрешения пиков. Недостатком, однако, является то, что при уменьшении ЭОП резко возрастает время анализа. На практике уменьшение ЭОП достигается добавлением некоторых органических растворителей, например, метанола или изопропанола (< 20%). Другая возможность уменьшения ЭОП состоит в снижении рН буфера. Изменение поверхности капилляра, например при нанесении покрытия, представляет собой еще одну возможность влияния на ЭОП. Некоторые добавки, такие как производные метилцеллюлозы или этиленгликоль, применяются в КЭ для увеличения вязкости буфера. Увеличение вязкости приводит не только к уменьшению ЭОП, но влияет в одинаковой степени и на электрофоретическую подвижность. Следовательно, увеличением вязкости невозможно улучшить разрешающую способность. Рис. 76. Влияние соотношения фаз на разрешение пиков. 85 Рис. 77. Влияние ЭОП на разделение. Увеличение электрофоретической подвижности также может приводить к увеличению интервала времен миграции. Однако этот метод не имеет большого практического значения, т.к. выбором другого детергента можно влиять на селективность. Небольшие изменения селективности могут, особенно при малых а, вызвать большие изменения разрешающей способности. Это, в свою очередь, может свести к нулю и даже обратить эффект повышения разрешения за счет увеличения электрофорети ческой подвижности мицелл. Ниже более подробно будут рассмотрены факторы, влияющие на селективность. Рост температуры приводит к уменьшению времени миграции, поскольку как коэффициент распределения, так и вязкость при этом уменьшаются. Вследствие того, что температурные зависимости коэффициентов распределения для каждого компонента пробы различаются, селективность изменяется. Несмотря на то, что изменение температуры не очень сильно влияет на селективность, для воспроизводимости анализов и из-за колебаний времени миграции температура должна поддерживаться постоянной. Условий разделения, вызывающих большие потоки, следует избегать, поскольку большие потоки приводят к нагреванию буфера и капилляра. Поэтому выгодно эффективно охлаждать капилляр. Молекула детергента состоит из гидрофильной и гидрофобной частей. Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуют с поверхностью мицеллы, гидрофильная группировка (ионная часть) оказывает большее влияние на селективность мицелл. Так, например, ДДСН и тетрадецилсульфат натрия имеют аналогичные свойства, в то время как селективность при переходе от ДДСН к натрий-М-лаурил-М-метилтаурату (НЛМТ) резко изменяется. Предположительно здесь речь идет о полярных веществах пробы. Изменения селективности могут быть легко достигнуты добавками других детергентов. Несмотря на то, что МЭКХ обычно применяется для разделения нейтральных со- единений, этим методом можно разделять также ионные соединения. В случае ионных соединений МЭКХ в основном применяют там, где разделение не может быть проведено методом КЗЭ. Так как мицеллы заряжены снаружи, на молекулы пробы с тем же знаком заряда, что и мицеллы, будут действовать более сильные силы 86 отталкивания, чем на молекулы пробы с противоположным зарядом. Следовательно, в случае ионных молекул пробы гидрофобность и эффекты заряженности оказывают влияние на коэффициент распределения. Изменение селективности можно вызвать не только полной заменой детергента, но и модифицированием мицелл. При добавлении второго детергента образуется смешанная мицелла. Мицелла, состоящая из одного ионного и одного неионного детергента, имеет меньший эффективный заряд и больше по размерам. Тем самым оказывается влияние не только на коэффициент распределения – смешанная мицелла имеет меньшую подвижность, чем мицелла, состоящая только из ионного детергента. Добавление нейтральных веществ к водной фазе также является очень эффективным средством влияния на селективность. Добавки циклодекстринов (ЦД) повышают вероятность нахождения вещества пробы в подвижной фазе, поскольку молекулы пробы могут диффундировать в полости ЦД. Если добавлять к подвижной фазе вещества-образователи ионных пар, можно очень сильно влиять на селективность, особенно по ионным соединениям. Если, например, к раствору ДДСН добавить тетраалкиламмонийную соль, вследствие образования ионных пар увеличивается время миграции анионных молекул пробы. Кроме того, уменьшается электростатическое отталкивание от мицелл. Напротив, времена миграции катионных компонентов пробы уменьшаются, т.к. образователь ионных пар проявляет себя как кон- курент во взаимодействии с мицеллами. Высокие концентрации мочевины могут увеличить растворимость гидрофобных веществ пробы в воде. В МЭКХ можно добавлением мочевины влиять на коэффициент распределения и, как следствие, на селективность. Аналогичные эффекты можно получить добавлением органических модификаторов к водной фазе. Речь идет об органических растворителях, смешиваемых с соответствующим буфером. Однако добавками модификаторов можно влиять не только на полярность подвижной фазы. Это приводит также к изменениям ЭОП и свойств мицелл. Влияние органических модификаторов в МЭКХ представлено на рис. 78. Рис. 78. Влияние органических модификаторов в МЭКХ. Селективность можно также улучшить добавлением солей и образованием, тем самым, комплексных соединений. На примере разделения смеси производных аминокислот - флуоренилметилоксикарбонилов (ФМОК) можно показать возможности оптимизирования в методе МЭКХ. На рис. 79 показано разделение 11 ФМОК- аминокислот. Из-за относительно большого и одинакового для всех проб вклада нейтральных производных электрофоретическая подвижность производных очень схожа и поэтому их полное разделение вряд ли возможно. 87 Рис. 79. Разделение смеси 11 ФМОК-аминокислот методом КЗЭ. Капилляр: 50мкм х 50/75 см, буфер: бора г 50 мМ, рН 9.5: УФ-детектирование 200 нм; поле 330 В/см. Добавлением ДДСН к буферу при прочих равных условиях, как показано на рис. 80, достигается лучшее разделение. Добавлением органических компонентов к буферу можно еще лучше оптимизировать разделение. На рис. 81 показано разделение проб при идентичных условиях за исключением того, что в данном случае к буферу добавлен метанол. Эта добавка влияет на равновесное распределение пробы между буфером и мицеллой, при этом изменяется также ЭОП и растворимость пробы в буфере. Рис. 80. Разделение 16 ФМОК- аминокислот методом МЭКХ. Иден- тификация пиков - в буквенном коде для аминокислот. Буфер: 50 мМ борат, 50мМДДСН, рН 9.5. Принцип разделения МЭКХ может применяться также в хроматографическом методе с обращением фаз. В качестве примера на рис. 82 показано разделение смеси компонентов взрывчатых веществ, в состав которых обычно входят незаряженные производные нитробензола. 88 Рис. 81. Разделение 16 ФМОК- аминокисдот методом МЭКХ с добавлением метанола к буферу. Буфер: 50мМ борат, 50мМ ДДСН, рН 9.5, об. 10% метанола. Рис. 82. Разделение компонентов взрывчатых веществ (ароматических нитросоединений). Условия - прибор КЭ типа HP 3D СЕ; капилляр: 50 мкм, 47/55 см, поле: 363 В/ см; буфер: 2.5 мМ борат, 50 мМ ДДСН, рН 8.7; ввод пробы - электрокинетический 5 кВ, 2 с; детектирование: ячейка де- тектора 150 мкм, 250±20 им; проба: 2-амино-б-нитротолуол, 2- амино-2,6-нитротолуод, 2- нитротолуол, 3-нитротолуол, 4- нитротолуол, 1,3-динитробензол, 1,2-динитробензол, 2,6- динитротолуол, 2,4- динитротолуол, нитробензол, 2,4,6-тринитротолуол. 11. Разделение энантиомеров Разделение энамтиомеров представляет собой одну из важнейших областей аналитической химии. Хотя энантиомеры и относятся друг к другу как изображение и его зеркальное отражение и не различаются по своим физико-химическом свойствам, один из энантиомеров вращает поляризованный свет направо, в то время как его зеркальное отражение - налево (т.е. они проявляют оптическую активность). Смесь эквимолярных количеств пары энантиомеров не проявляет оптической активности, поскольку направления вращения света противоположны. Если смесь энантиомеров, которую необходимо разделить, добавить к оптически активной среде, состоящей из чистого энантиомера, то в разделяющей системе поведение анализируемых веществ будет очень различным, что позволяет осуществить их разделение. Различное поведение можно объяснить тем, что в оптически активной среде с оптически активным окружением взаимодействует только один из энамтиомеров, в то время как его зеркальное отражение не взаимодействует. Если различие во взаимодействиях достаточно велико, смесь энамтиомеров разделяется на чистые компоненты. 89 Поэтому при разделении эмантиомеров основное внимание следует уделять выбору подходящей оптически активной среды - так называемого хиральмого селектора (см. таблицу 27). Поскольку универсальных хиральных селекторов не существует и проблемы разделения каждый раз необходимо оптимизировать по-новому, основная задача разделения эмантиомеров заключается в выборе подходящего селектора. В КЭ оптически активная среда обычно создается добавками оптически активных веществ к разделяющему буферу. Этот простой способ обладает большим преимуществом, поскольку в этом случае отпадает необходимость в длительных и требующих интенсивной работы стадиях иммобилизации хиральмых селекторов на различных носителях. Поиск хирального селектора происходит, как и в ВЭЖХ, методом "проб и ошибок". Основным недостатком КЭ в разделении эмантиомеров является чисто аналитическая направленность. Для решения препаративных задач метод малопригоден. Рис. 83. Схемы замещения на центре хиральности. А, В, X, Y: различные замещения на одном центре хиральности (асимметричный атом углерода). Таблица 27 Хиральные селекторы, применяемые в настоящее время в КЭ Классы селекторов Хиральные селекторы Проблемы ЦД а-,Ь-,g-ЦД, метилированные ЦД Гидроксипропилирован-ныеЦД Карбоксиметилирован-ные ЦД Карбоксиэтилирован-ные ЦД Суцилинированные ЦД Фосфатированные ЦД Сульфобутилэфирные ЦД Добавляются пре- имущественно к ароматическим или частично гидрофобным пробам Хиральный мицеллообразователь (часто добавляется вместе с ДДСН в ДДСН- дигитонин ДДСН-SDVal ДДСН-SDAIa Тауродезоксихолат До настоящего времени имеет ограниченное применение Дезоксихолат Хиральные металлические комплексы Медно-Ь-гистидимовые комплексы Медyо-аспартамовые комплексы До настоящего времени применяли только для дансиламинокислот; флуоресцентное детектирование Хиральный краун- эфир 18-краун-б-тетракарбоксиловые кислоты Высокая цена, имеет ограниченное применение 90 Чистые энантиомеры L-винная кислота До настоящего времени использовалась только для разделения хиральных комплексов Белки и глюкобелки Альбумин, полученный из крупного рогатого скота Проблемы с детектированием, связанные с собственной адсорбцией 11.2. Смешанные химические разделяющие системы Вышеназванные хиральмые селекторы часто применяются не сами по себе, а вместе с другими буферными добавками. Используются в основном такие мицеллообразователи, как ДДСН, который наряду с хиральным селектором образует вторую разделяющую систему. Ниже приводится краткий анализ некоторых таких комбинаций. 1) ДДСН-ЦД. Из смешанных методов этот вариант наиболее распространен. Мицеллярная система в данном случае отвечает за разделение отдельных компонентов пробы, а ЦД в качестве хирального селектора - за разделение компонентов пробы в чистых онантиомерах. Однако, при применении детергентов вместе с ЦД часто наблюдается их отрицательное влияние. Детергенты с длинными алкановыми це- почками могут внедряться внутрь ЦД-колец и препятствовать воздействию хирального селектора. 2) Добавка второго хирального селектора, В этом методе в буферной системе находятся два различных хиральных селектора. Однако этот способ до настоящего времени только в отдельных случаях приводил к улучшению разрешения при разделении энантиомеров. Например, комбинация хирального краун-эфира с ЦД для некоторых проб проявляет синергический эффект. Иногда к улучшению селективности приводит также использование двух различных ЦД в одной буферной системе. Однако, в общем случае введение второго селектора и, таким образом, второй равновесной системы в буфер приводит к потере селективности. 3) Смешанные мицеллообразующие системы. Использование чистых хиральных детергентов в качестве мицеллобразователей во многих случаях приводит к плохому разрешению из-за несимметричности пиков и плохой эффективности. Добавление ДДСН как добавочного мицеллообразователя в некоторых случаях разделения приводило к улучшению формы пика и, тем самым, к лучшему разрешению. Смешанные мицеллы, образующиеся при добавлении ДДСН, сами ускоряют обменные процессы в мицеллах и уменьшают взаимодействия с хиральным селектором (эффект разбавления). Поскольку в настоящее время ЦД и их производные обладают наиболее широким спектром применения в качестве хиральных селекторов, а также наибольшими перспективами в КЭ, остановимся на них более подробно. Реакции, в результате которых получаются производные ЦД, позволяют проводить синтез множества новых хиральных селекторов с существенно разным воздействием на хиральные различия между селектором и анализируемым веществом. В общем случае за хиральные отличительные свойства отвечают гидрофобные и ионные взаимодей- ствия, а также стерические эффекты и образование мостиковых водородных связей. Было показано, что при разделении энантиомеров важную роль наряду с выбором подходящего хирального селектора играют и другие параметры электрофоретической системы, которые требуют дальнейшей оптимизации. Например, на процесс оптимизации разделения энантиомеров решающее влияние оказывает величина рН. Вследствие того, что разделение энантиомеров методом КЭ основано на различии в подвижностях между D- и L-формами, анализируемые вещества необходимо перевести в ионную форму, что обеспечивается подходящим значением рН. При электрофоретическом движении анализируемых веществ через "квазистациомарную" фазу (в данном случае - ЦД) происходит разделение пары энантиомеров. Важнейшими оптимизирующими параметрами в данном случае являются концентрация хирального селектора в используемой буферной системе, сама буферная система (вид фонового электролита), а также другие буферные добавки, такие как ДДСН, метанол и др. Их 91 действие на разделение энантиомеров будет рассмотрено ниже. 11.3. Капилляры с ЭОП и без него Как правило, проблемой в разделении энантиомеров является невысокая селективность и, вследствие этого, длительные времена анализов, даже в случае, когда найдем подходящий хиральный селектор для разделения. Причиной этого являются небольшие различия в подвижностях D- и L-форм анализируемых веществ, а также наличие сильного ЭОП, который перекрывает эффект разделения в немоди- фицированных капиллярах. Небольшие различия в подвижностях приводят к разделению только в тех случаях, когда эффективные участки движения максимальны. Это означает, что анализируемое вещество в электрическом поле должно двигаться от точки ввода до детектора самостоятельно. Наличие ЭОП в данном случае мешает разрешению. Для достижения максимального разрешения по возможности за короткое время покрытые (модифицированные) капилляры используются при сильно заторможенном ЭОП. При этом можно использовать очень короткие капилляры (7-20 см) и сильные электрические поля (до 1000 В/см). При использовании подходящего хирального селектора это приводит к очень малым временам анализа при высоком разрешении. Различие между немодифицированным и покрытым капилляром про- демонстрировано на рис. 84. Заметно более высокая эффективность для непокрытого капилляра основана на том, что ЭОП перекрывает подвижность анализируемых веществ, и они очень быстро проходят через детектор. Здесь ясно видно, что более высокая производительность за более короткое время при разделении достигается при применении покрытого капил- ляра. Использование покрытого капилляра в выборе подходящего хирального селектора играет большую роль, так как в данном случае можно много быстрее определить применимость данного селектора, т.е. его селективность. 11.4. Выбор подходящего LLQ При использовании ЦД в качестве хиральных селекторов решающее влияние на селективность оказывает не только тип ЦД, но и тип заместителя в производных ЦД. Растворимость ЦД в воде также может резко увеличиться при применении производных. Это показано для тестовой смеси различных типов ЦД и их производных на рис. 85. |