Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 84. Разделение энантиомеров гексабарбитала в капилляре с покрытием (А) и без покрытия (В). Условия разделения: 0.1 М TEE, рН 8.3, детектирование при 214 нм; ввод пробы: 1 с, 2 кВ, об. 1.56%р- ЦД, t=25°C. А) Покрытие капилляра: 4% линейный полиакриламид, Е=710 В/см (выход заземлен), L=7/27 см. В) Капилляр без покрытия, Е=400В/см. Ь=50/57см. 11.5. Оптимизация концентрации ЦД Следующая важная составная часть оптимизации состоит в установлении подходящей концентрации ЦД. В зависимости от типа анализируемых веществ с ростом концентрации ЦД могут наблюдаться улучшение разрешения, потеря или даже инверсия разрешения. Это может приводить к неправильным выводам о различных 92 механизмах разделения энантиомеров с помощью ЦД. На рис. 86 показано влияние концентрации ЦД на разделение энантиомеров. Рис. 85. Разделительный потенциал различных типов ЦД. Условия разделения: L=50/57 см, Е= 350 В/см, буфер: 0.1 М ТВЕ, рН 8.3; детектирование при 214 нм, об. 1.5% ЦД; пробы: 1 - d,1- гексабарбитал, 2 - (!,1-дансил- фенидалании; А) α -ЦД, В) гидроксилропил - α -ЦД, С) метил - β -ЦД, D) гидроксипропил- β -ЦД. В немодифицированной с помощью ЦД буферной системе отрицательно заряженные энантиомеры обладают высокой подвижностью относительно ЭОП, так как они без сопротивления могут проходить сквозь буфер (нижняя электрофореграмма).. Уже небольшие добавки хирального селектора вызывают сильное уменьшение подвижности анализируемых веществ, причем в этом случае наблюдается вполне Достаточная селективность. Разделение при очень низких концентрациях ЦД объясняется различным временем пребывания D- и L-форм в ЦД. Энантиомер с большим временем пребывания в ЦД проявляет меньшую подвижность и детектируется ближе к ЭОП. Дальнейший рост концентрации хирального селектора может резко ограничить подвижность анализируемых веществ, так что они ; Детектируются очень близко к ЭОП. В этом случае из-за слишком малой зоны движения разделение энантиомеров может стать невозможным. Кроме того, при повышении концентрации ЦД растет вязкость буфера, что замедляет ЭОП и увеличивает время анализов. В капиллярах с заторможенным ЭОП рост концентрации ЦД также приводит к уменьшению подвижности анализируемых веществ, повышению вязкости буферной системы и, вследствие этого, к увеличению времени анализов. Наряду с уменьшением разрешения вследствие небольшого времени пребывания в капилляре при высоких концентрациях ЦД могут наблюдаться также и другие эффекты. В некоторых случаях оказывается, что уже при очень низких концентрациях ЦД наблюдается хорошее разделение пар энантиомеров (разрешение больше 1.5). Однако, при более высоких концентрациях хирального селектора (об. 4 - 10 %) разрешение снова падает. При более высоких концентрациях ЦД время пребывания D- и L-форм анализируемых веществ в ЦД увеличивается, однако разность этих времен постоянно уменьшается. Тем самым, разрешение пиков при разделении в этой системе уменьшается или даже совершенно исчезает. Экстремальный случай оптимизации концентрации ЦД приведен на рис. 87. При очень низких концентрациях хирального селектора в системе достигается хорошая селективность. Если повысить концентрацию, разрешение полностью исчезает и снова появляется при очень высоких концентрациях ЦД. Это показано на рис. 88, где представлены зависимости относительных времен миграции от концентрации ЦД. Хорошо видно, что относительная миграция с ростом концентрации ЦД резко падает и примерно при об. 6% достигает минимума. В этой области разрешение зависит только от различия времен нахождения D- и L-форм в ЦД. При концентрациях больше об. 6% подвижность анализируемых веществ практически не изменяется. Следует отметить, 93 что разрешение снова возрастает при концентрациях ЦД больше об. 12%. Это можно объяснить только тем, что при высоких концентрациях образуются диастереомерные комплексы между ЦД и анализируемым веществом. Диастереомеры по своей природе проявляют различные физические свойства, и поэтому их можно разделить. Из-за различия механизмов разделения в начале и конце кривых последовательность выхода энантиомеров неизбежно обращается. 11.6. Оптимизация значений рН Значение рН в КЭ является одним из важнейших параметров оптимизации. С помощью значений рН можно не только воздействовать на ЭОП, но и перевести анализируемые вещества в определенную ионную форму. Из этого вытекают различные электрофоретические подвижности, которые приводят затем к разделению анализируемых веществ. Если используются незаряженные ЦД, пара энантиомеров при определенном рН должна иметь такую собственную подвижность, чтобы смогла пройти сквозь псевдостационарную фазу (в данном случае - ЦД). Рис. 86. Влияние концентрации гидроксипропил - р-ЦЦ на разрешение пиков при разделении производных дигидропириди-на. Условия разделения: L=50/57 см, Е=350 В/см; буфер: 0.1 М Т BE, рН 8.3, различные концентрации ЦД, детектирование при 214 нм. На рис. 89 в качестве примера представлена зависимость разделения рацемированной смеси от значения рН. При низких значениях рН анализируемые вещества практически не обладают собственной подвижностью и проходят через детектор со скоростями, близкими к ЭОП, не разделяясь. Из рис. 89 также видно, что при низких значениях рН ЭОП очень мал. Рис. 87. Изменение последовательности выхода энантиомеров при различных концентрациях ЦД. Условия разделения (слева): L=50/57 см, Е=350 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, рН 7.7 с об. 0.5 % гидроксипропил- β - ЦД. (Справа): L=80/87см, Е=30 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, рН 7.0 с об. 15% гидроксипропил- β -ЦД; детектирование при 214 нм. 94 При средних значениях рН анализируемые вещества обладают достаточно высокой собственной подвижностью, так что в этом случае различие в подвижности между D- и L-формами может привести к переносу. Анализируемые вещества в данном случае должны пройти достаточно большой эффективный участок пути в капилляре. Потеря разрешения при высоких значениях рН часто объясняется тем, что очень высокий ЭОП не дает достаточно времени анализируемым веществам для разделения в капилляре. Высокий ЭОП приводит к слишком коротким временам пребывания анализируемых веществ в капилляре. При очень высоких значениях рН ЦД сами могут депротонироватъся, из-за чего селективность снова изменяется. Если ЦД имеет одинаковый заряд с анализируемыми веществами, из-за электростатического отталкивания хиральные отличительные черты теряются. Рис. 88. Зависимость относительных времен миграции D- и L-дансил- фенилаланина от концентрации гидроксипропил - р-ЦД. 11.7. Оптимизация фоновых электролитов После выбора подходящего хирального селектора и оптимального значения рН следует оптимизировать также ионный состав разделяющего буфера. Как показано на рис. 90, подвижность буферных ионов влияет на форму пика и разрешение анализируемых веществ. Во всех трех случаях выдерживались одинаковые условия ввода пробы, и все условия разделения, за исключением буферных ионов, поддерживались одинаковыми. Ясно видно, что в случае применения в качестве буфера лимонной кислоты получается лучшее разрешение и, как следствие, более высокая эффективность разделения. Это приводит также к большей чувствительности системы. Этот пример показывает, что и при низких значениях а путем улучшения эффективности можно достичь достаточного хорошего разрешения анализируемых веществ. Рис. 89. Влияние значений рН на разделение производных дигидро-пиридииа. Условия разделения: L=50/57см, Е=440 В/см, буфер: 20 мМ фосфат, об. 0.4 % гидроксипропил- β -ЦД, раз- 95 личные значения рН; детектирование при 214 нм. 11.8. Буферные добавки Наряду с уже описанными параметрами определяющее влияние на разделительную способность хирального селектора могут оказывать многие добавки к разделяющему буферу. Однако заранее невозможно предсказать, может ли добавка таких компонентов, как органические растворители, комплексообразующие средства, детергенты и т.д., привести к улучшению или исчезновению разделения. В некоторых публикациях предпринята попытка представить модель такого поведения. В нижеописанном уравнении приведены основные факторы, влияющие на различия подвижностей. Рис. 90. Влияние фонового электролита на форму и разрешение пиков. Условия разделения: L=20/27 см, покрытие полиакриламидное, Е=370 В/см (выход заземлен), об. 0.3% гидроксипропил- β -ЦД, детектирование при 214 нм, пробы: дансил-фенилаланин (1), производное дигидропиридина (2).А) 10 мМ лимонная кислота, рН 6.0. В) 25 мМ MES/Трис, рН 6.0. С) 20 мМ фосфатный буфер, рН 6.0. [ ] ( )( ) [ ] [ ] ( ) 2 2 1 1 C K K K K C K K С B A B A A B + + + − − = ∆ µ µ µ Здесь ∆µ - разность подвижностей энантиомеров, µ 1 - подвижности энантаомера 1 или 2 в свободном растворе, µ 2 - подвижности комплексов "энантиомер-ЦД", [С] - коцентрация хирального детектора, Ка, Кв - констаны равновесия между энантиомером А или В и ЦД. Разность подвижностей и, соответственно, селективность зависят в основном от концентрации ЦД, констант равновесия между анализируемыми веществами и хиральным селектором и разности подвижностей в комплексном и некомплексном состояниях анализируемых веществ. Из вышесказанного следует, что при постоянной концентрации ЦД добавка органического компонента к буферу может изменить константу равновесия в положительную (улучшение разрешения) или отрицательную (потеря разрешения) сторону. Характер изменения зависит в основном от концентрации ЦД. На рис.91 представлено влияние мочевины, метанола и ДДСН на время миграции, проявление пика и разрешение. Для буферного раствора, насыщенного β -ЦД (об. 1.56%), в данном примере наблюдается наиболее быстрое время миграции (А). 96 Рис. 91. Влияние буферных добавок на разделение энантиомеpoв. Условия разделения: L ::: 40/47 см, Е=232 В/см, (анод на стороне детектора), капилляр с покрытием (4% линейный полиакриламид), детектирование при 214 нм; буфер: 0,1 M ТВЕ, рН 8.3, добавки-.А) об. 1.56% β -ЦД.В) об. 12% β - ЦД, 7 М мочевина, 0.1% ДДСН.С) об. 12% β -ЦД , 7 М мочевина, 10% метанол, 0.1 М ДДСН,D) об. 12% β -ЦД, 7 М мочевина.Е) об. 12% β -ЦД, 7 М мочевина, 10% метанол. С помощью добавки раствора 7 М мочевины можно поднять концентрацию ЦД (случай D). Однако, в данном случае время анализов заметно растет вследствие увеличения вязкости буфера и низкой подвижности анализируемых веществ, обусловленной высокой концентрацией хирального селектора. При этом улучшения разрешения не наблюдается. В данном случае положительное влияние оказывает добавка метанола (Е). Время миграции при этом несколько возрастает, однако достигается лучшее разрешение. Если использовать буфер, соответствующий случаю D, вместе с 0.1 М ДДСН, время миграции резко уменьшается (случай В). Это объясняется тем, что в данных условиях ДДСН и анализируемые вещества движутся в одном направлении (оба анионные), тем самым создается синергический эффект. Разрешение по сравнению со случаем (D) резко улучшается, а время анализов уменьшается. И в этом случае добавка метанола в буферную систему приводит к увеличению времени анализов, однако улучшения разрешения не наблюдается (случай С). В рассматриваемых здесь случаях улучшение разрешения определяется в основном более высокой эффективностью конкретной разделяющей среды. Значения а в этих примерах практически не изменяются. 12. Капиллярный гепь-эпектрофорез Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор. Применение гелей в электрофорезе основано на том, что биополимеры с точки зрения зарядов являются полианионами или поликатионами с одинаковыми поверхностями, поэтому разделение в постоянном электрическом поле без дополнительных вспомогательных средств становится невозможным. Поскольку эти биополимеры в самом деле резко различаются по своим размерам, добавка некоторого геля может сильнее влиять на подвижность полимера с большими размерами молекул. Это приводит впоследствии к разделению молекул по размерам, т.е. по растущим ММ. Основной областью применения гелевого электрофореза является разделение молекул ДНК, а также разделение белков, которые подвергаются денатурированию в растворе ДДСН. Кроме того, гели в классическом электрофорезе применяются обычно в качестве стабилизаторов, хотя и не дающих вклад в разделение. Ниже будут рассмотрены некоторые типы гелей и показаны основные области их применения в КЭ. 12.1. Гели на основе акриламида В общем случае различаются гели, обладающие определенной степенью 97 поперечной сшивки (поперечносшитые гели), состоящие из двух мономеров, и гели, состоящие только из одного мономера (линейные гели). Последние сплетены только из линейных полимерных цепочек, и их связи основаны только на физическом взаимодействии (физические гели). Поперечносшитые гели, в отличие от линейных, состоят из отдельных полимерных цепочек, поперечно связанных друг с другом и, тем самым, обладают более жесткой структурой (химические гели), поскольку между волокнами существуют ковалент-ные связи. К тому же эти гели содержат в достаточном количестве поры определенного размера, что обеспечивает их высокую раздели- тельную способность. На рис. 92 представлены структуры применяемых радикалов-стартеров и мономеров, а также схематический разрез гелевой структуры. Сравнение "линейного" и "сшитого" полиакриламидов представлено на рис. 93. 12.1.1. Поперечносшитые полиакрипамидные гепи Важнейшей предпосылкой применения геля (в классическом смысле) в капилляре является полное исключение ЭОП. Если это условие не выполняется в достаточной степени, гель вымывается из капилляра наружу, и разделение ставновится невозможным. Регулирование ЭОП достигается нанесением слоя или химическим модифицированием капилляра, которые уже подробно рассматривались в разделе о способах нанесения покрытий капилляров. За то время, когда раствор мономера смешивают с радикалом-стартером и катализатором и быстро заполняют капилляр, гель в капилляре полимеризуется. В некоторых случаях покрытия стенок капилляра, например, виниловыми группировками, гель при полимеризации в капилляре может сшиваться с нанесенным поверхностным слоем. Этот способ дает высокую целостность покрытия капилляра и, как следствие, приводит к очень высокой эффективности. Используя этот метод с применением поперечносшитых и связанных со стенкой капилляра ковалентными сила- ми гелей, удалось получить наивысшие эффективности в КЭ (30 млн. теоретических тарелок на метр). Рис. 92. Структура мономера - акриламидного геля с разрезом гелевой структуры. Показаны также структуры радикалов-стартеров. Рис. 93. Схема структуры линейного и поперечносшитого полиакриламидов. 98 Селективность гелей можно изменять с помощью выбора отношения концентрации наносимого мономера (%Т) к концентрации сшивающего агента (% С). Свойства поперечносшитых гелей на полиамидной основе приведены в таблице 28. Таблица 28. Области применения поперечносшитых полиакриламидных гелей. Концентрация мономера Свойства Область применения Жесткий гель, нетекучий, замена невозможна Реакции определения последовательности нуклеотидов в ДНК Чувствителен к температуре Анализ олигонуклеотидов Стационарно связан в капилляре Гиалуроновые кислоты Олигосахариды Различные соотношения % Т и % С в геле для управления селективностью Высокая целостность покрытия капилляра ДДСН-белковые комплексы Однако, перечисленные гели имеют некоторые недостатки: - во время хранения капилляров, заполненных такими гелями (в отсутствие смачивания концов капилляра буфером) гель на концах капилляра может высохнуть, и, таким образом, капилляр становится непригодным для дальнейшей работы, - обмен в среде буфера в капилляре невозможен или требует длительного времени, - термостабильность такого рода гелей недостаточна. Растворенные газообразные компоненты буфера при высоких температурах образуют пузыри в капилляре. Похожий эффект наблюдается также в сильных полях (>500 В/см). Образование воздушных пузырей в капилляре, заполненном гелем, всегда приводит к локальным нарушениям геля и непригодности капилляра, - поскольку для разделения применяют всегда один и тот же гель, неизбежны явления старения, вызванные "обескровливанием" геля. По сравнению с этим в классическом гелевом электрофорезе применяют всегда только одну зарядку гелем на один анализ, что может устранить этот эффект, - изготовление самодельных капилляров (как было принято) требовало многих "ноу- хау" при модифицировании поверхности и, особенно, при проведении полимеризации в капилляре. Эти проблемы стали причиной того, что попытки промышленного выпуска таких капилляров потерпели неудачу. На рис. 94 в качестве примера показана огромная производительность при разделении олигонуклеотидов таким поперечносшитым полиакриламидным гелем. |