Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 47. Сравнение по методу стандартной добавки для определения анионов в воде озера Байкал. Условия те же, что и описанные на рис. 46; к 4000 мкл пробы были добавлены с помощью пипетки два раза по 40 мкл стандартного растворами один раз - 80 мкл стандарта с 1000 ppm сульфата. Подученные пики отложены в зависимости от концентрации. Теоретические выкладки показывают, что ЭОП и движение катионов в капиллярах из плавленного кварца имеют одинаковое направление, поэтому аппаратура КЭ для разделения катионов должна быть такой полярности, чтобы выход был заземлен. Таким образом, перенос ионов в ЭОП при КЭ налагается на движение катионов. Это дает возможность осуществить их быстрое разделение. В качестве буферной системы в этом случае хорошо подходит имидазол с концентрацией 5 мМ и значением рН ниже 6.0. Как показано на рис. 48, разделение заканчивается меньше, чем за 4 минуты. Примерно через 5.5 минут на электрофореграммах появляется большой пик, вызванный ЭОП. Он объясняется введенной водой, которая обладает меньшим УФ-поглощением, чем буферная система, и тем самым вызывает каждый раз отрицательный пик, с помощью которого можно определить ЭОП. Рис. 48. Разделение щелочных и щелочно-земельных ионов в буферной системе имидазола. Условия: прибор КЭ - Waters Quanta 4000; капилляр 75 мкм, 50/56 см. Поле: 446 В/см, буфер - 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4.0; ввод пробы гидростатический, 30 с, непрямое детектирование 214 нм; проба - катионный стандарт с 1 мг/л каждого: калия, натрия, магния, бария, кальция и 0.5 мг/л лития. Из формы пиков ясно видно, что подвижность имидазола близка к подвижности кальция. На форму пика оказывает большое влияние концентрация буфера: с ростом концентрации пики становятся более симметричными. Например, интенсивность пика калия при повышении концентрации буфера от 0.5 до 12 мМ возрастает в 4 раза. Однако такой способ оптимизации имеет определенные четкие границы, т.к. при концентрации буфера больше 8 мМ резко возрастают шумовые помехи сигналов. Этот рост связан с градиентами плотности, возникающими из-за разности температур вследствие выделения джоулева тепла в электрическом поле. В капилляре с внутренним диаметром 100 мкм, применяемом в этих опытах, можно использовать имидазольный буфер с концентрациями вплоть до 5 мМ. В обычно используемых капиллярах с внутренним диаметром 75 мкм можно работать с концентрациями до 10 мМ при величинах рН от 4 до 6. В капиллярах с внутренним диаметром 50 мкм можно 60 достичь концентрации буфера до 50 мМ. Рис. 49. Разделение тестовых ионов, оптимизированное во времени, в имидазодьной буферной системе. Условия: прибор КЭ - Millipore Waters Quanta 4000, капилляр 75 мкм, 20/26 см. Поле: 1300 В/см; буфер: 2 мМ имидазол/серная кислота, рН 6.0; ввод пробы гидростатический 10с, непрямое детектирование 214 им. Проба- катионный стандарт с I мг/л каждого: калия, натрия, бария, кальция, магнияи0.5мг/л лития. Используя низкоконцентрированный буфер (2 мМ) и значение рН 6.0, при большом напряжении электрического поля можно вызвать большой ЭОП и легко сократить время анализа. На коротком участке разделения анализы проводятся очень быстро. Как показано на рис. 49, в поле 1300 В/см (30 кВт) тестовые ионы разделяются менее, чем за 30 с, при этом проявление пиков, несмотря на высокую напряженность поля, очень хорошее. При таком разделении можно, к примеру, для пика кальция достичь 600 тыс. тарелок на метр или, нормируя на время, - 320 тыс. тарелок в минуту. Сильным полем ионы ускоряются до скорости движения 0.96 см/с без существенного изменения профиля потока и проявления пиков. Среди факторов, влияющих на детектирование, решающую роль играет прежде всего селективность разделяющих систем. Используя взаимодействие ионов с комплексообразователем, можно влиять на подвижность. В то время как добавка оксалат-ионов к буферу не оказывает никакого влияния, цитрат-ионы резко понижают подвижность ионов щелочно-земельных металлов. Например, 100 мкМ цитрата достаточно для элюирования кальция и магния после лития. Рис.50. Влияние цитрата на разделение щелочных и щелочно- земельных ионов. Условия: прибор КЭ - Millipore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 50/57 см; поле: 438 В/см. Буфер - 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4.6, динатрийцитрат в качестве добавки; ввод пробы давлением 5 с, непрямое детектирование 214 нм; проба - катионный стандарт с 1 мМ каждого: калия, натрия, бария, кальция, магния и лития. Еще меньшие концентрации буферных добавок достаточны при использовании Titriplex 3 (динатриевой соли ЭДТА). Менее 20 мкМ этой соли ЭДТА в буфере достаточны для того, чтобы комплексообразование со щелочно-земельными ионами происходило настолько сильно, что их невозможно детектировать. При этом подвижности однозарядных ионов даже при концентрациях ЭДТА 200 мМ практически не изменяются. ЭДТА оказался наиболее эффективным реагентом для маскировки 61 щелочно-земельных ионов. Как можно показать с помощью теоретических выкладок, использование ионов буфера с большими молярными коэффициентами экстинкции приводит к более чувствительному детектированию. Молярный коэффициент экстинкции в УФ-спектре имидазола в максимуме при 205 нм составляет 5000. Имидазольный буфер можно использовать в области от 190 до 220 нм для непрямого детектирования, т.е. область применения ограничена нижней УФ-областью. Вследствие того, что многие вещества также поглощают в УФ-области, при детектировании могут возникать помехи. Расширение области непрямого детектирования в сторону более высоких длин волн и/или в область более щелочных значений рН достигается 4-аминопиридином (4-АП). В максимуме поглощения при 205 нм 4-АП обладает молярным коэффициентом экстинкции 15500, при 245 нм - около 15600. При 254 нм существует еще один пик с экстинкцией около 14000. Это примерно в три раза больше, чем молярный коэффициент экстинкции имидазола при 214 нм. Подвижность 4-АП примерно такая же, что и у имидазола. Преимущество 4-АП проявляется в том, что ом применим в более широкой области длин волн - даже при 270 нм можно проводить непрямое детектирование. Кроме того, буфер 4-АП можно использовать до значений рН 10.1 без уменьшения чувствительности буферной системы вследствие исчезновения заряда 4- АП. В таблице 19 приведены другие буферные системы, применяемые для разделения катионов с непрямым детектированием. По подвижностям ионов пробы можно выбрать подходящий разделяющий буфер. Значения pKs берутся из литературы или определяются титрованием. Соответствующие УФ-спектры важнейших буферных компонентов представлены на рис. 51. Воспроизводимость разделения в ионной аналитике при применении буферных систем очень хорошая. ОСО времен миграции лежат ниже 0.5%, воспроизводимость площади пика - важнейшая величина для количественных анализов - лучше 2.3%. Наряду с точностью для количественных расчетов важной величиной является их достоверность, которая подтверждается данными других методов. В качестве альтернативных методов измерения выступают атомно-абсорбционный анализ, ИОХ, а также ионный анализ с ионно-селективными электродами. Как показывают некоторые примеры, результаты, полученные различными методами анализа, в пределах известных допустимых отклонений совпадают. Определение щелочных и щелочно- земельных катионов в байкальской воде показано на рис. 52. Для подтверждения полученных результатов эти же пробы воды изучали методами ИОХ, а также атомно-абсорбциомной спектроскопии (ААС). При этом в методе ИОХ анализ пробы проводили по циклической схеме с применением синтетического ионита с детектором по электропроводности, а анализы методом ААС - по стандартному методу Шинкеля. Между найденными концентрациями ионов наблюдалось хорошее согласие. Таблица 19. Важнейшие параметры катионных буферных веществ. Вещество Формула Подвижность (см 2 /кВ-с) Значение рKs Спектральная область использо- вания (нм) Гистамин 0.53 6.5; 10.5 <220 нм 4-амино-пиридин 0.48 8.9 <220 нм и 240-270 нм Имидазол 0.46 6.9 <220 нм 9-амино-акридин 0.42 9.2 250-265 нм Креатинин 0.37 5.3 240-270 нм 2-амино-4,6- диметилпиридин 0.32 8.1 265-280 нм Эфедрин 0.31 9.9 <220 62 4-амино-М,М- диэтиланилин 0.27 8.1 <215 нм 2-амино- бензимидазол 0.20 7.5 270-310 нм 1-амино- нафталин 0.17 3.9 <230 нм, =300нм Рис. 51. УФ-спектры буферных веществ, которые можно применять для непрямого детектирования катионов. УФ- спектры веществ, протонированша уксусной кислотой, получены на детекторе Perkia Elmer LC 480 Diodea Array. Рис. 52. Разделение катионов в воде, взятой с поверхности озера Байкал. Условия: прибор КЭ: Millipore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 54/60 см; поле: 446 В/см; буфер - 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4.5; ввод пробы гидростатический, 30 с. Непрямое детектирование, 214 им. Проба -байкальская вода: I - калий, 2 - натрий, 3 кальции, 4 - магний. Количественные результаты приведены в таблице 20. В качестве другой пробы, для которой имелись в наличии контрольные данные, полученные другими аналитическими методами, изучали воду из лесного родника. Для минеральной воды лесного источника результаты анализов, полученные всеми тремя методами, приведены в таблице 20. Дополнительно здесь же приведены концентрации ионов, имеющиеся на этикетке бутылок с этой водой. 63 Таблица 20. Количественные результаты КЭ по сравнению с данными ИОХи ААС (все концентрации приведены в ррm). Проба Метод Калий Натрий Кальций Магний ВЭЖХ 0.5 5.3 15.9 3.3 КЗЭ 0.6 3.1 14.5 2.9 Байкальская вода ААС 1.1 3.4 14.6 3.3 ВЭЖХ 1.2 3.2 4.7 0.8 КЗЭ 1.6 3.2 4.1 1.1 ААС 2.6 3.4 4.5 0.6 Лесной родник БЭ 2.0 3.6 3.8 0.7 ВЭЖХ 925 69 92 52 Яблочный уксус КЗЭ 1125 74 114 64 БЭ - данные, приведенные на бутылочной этикетке Более проблематичен анализ катионов в крови. Размеры красных кровяных шариков составляют 7:5х2 мкм и граничат с размерами частиц, которые можно вводить в КЭ без проблем. После разжижения свежей крови в 100 раз эта проба уже не в состоянии коагулировать. Красные и белые кровяные тельца крови не допускают прямого ввода пробы в методе ВЭЖХ. Содержание белков в этих разжиженных растворах всегда выше 0.7 г/л, так что белки составляют существенную часть пробы. Несмотря на это, разделение катионов методом КЭ вследствие их очень высокой подвижности по сравнению с компонентами пробы не представляет большой проблемы. Вследствие высокой чувствительности, детектирование ионов удается провести даже в таком разжиженном растворе. Значения концентраций, определенные по сравнительному методу с внешней сравнительной кривой, соответствуют литературным данным. Для калия найдено значение 6.8 мг-экв/л (литературное значение 5 мг-экв/л), для натрия - 147 мг-экв/л (литературное значение 150 мг-экв/л), для кальция - 3.4 мг-экв/л (литературное значение 2 мг-экв/л) и для магния - 5.4 мг-экв/л (литературное значение 3 мг-экв/л). Белки в растворе все же нарушают воспроизводимость разделения. На рис. 54 показаны времена миграции и площади пиков кальция для первых восьми вводов пробы. В результате адсорбции белков, которые при каждом вводе пробы достигают капилляра, силанольные группы на стенках капилляра, ответственные за ЭОП, все более и более блокируются. По этой причине ЭОП замедляется, и ионы движутся к детектору медленнее. Уменьшение скорости движения напрямую отражается на площади пиков. С увеличением времени миграции ионы медленнее проходят через де- тектор, из-за чего площадь пиков растет. Этим объясняется ход кривых зависимости площади пика от времени миграции, приведенных на рис.54. Рис. 53. Разделение разжиженной пробы крови. Условия: прибор КЭ - Milllpore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 50/57 см; поле: 446 В/см, буфер: 5 мМ имидазол/сериая кислота; ввод пробы гидростатический, 30с, непрямое детектирование 214 им; проба: суспензия 50 мкл крови в 5 мл воды; I - калии, 2 -натрий, 3 - кальций, 4 - магний. 64 Нормировка площади пика на время миграции является лишь вычислительным приемом с результатами анализа. Однако, причина изменения времени миграции все же остается. Несмотря на это, путем такой нормировки ОСО площади пика уменьшается с 6.2% до 2.8%. Приемлемым решением этой проблемы является подготовка капилляра перед каждым пуском. В анализах, описанных до настоящего времени, для кондиционирования капилляра применяли только промывание разделяющим буфером в течение 3 мин. Для удаления белков из капилляра после каждого разделения во второй серии измерений капилляр сначала промывали в течение 5 минут 0.1 М NaOH и затем 5 минут разделяющим бусрером. Этим способом кондиционирования можно было удалять со стенок капилляра мешающие вещества, внесенные пробой, и в конце концов восстановить свойства капилляра новым буфером. Характеристическая кривая зависимости площади пика от времени миграции в этих случаях не имеет наклона, времена, как и площади пиков, колеблются произвольно. Воспроизводимость площади пика для кальция составляет после 8 вводов пробы 2.0%. Если площадь нормировать дополнительно на время, это значение составляет 1.5%. Рис. 54. Разделение разжиженной пробы крови, характеристические кривые времени миграции/площади пика для проверки вос- производимости с и без кондиционирования капилляра. Ус- ловия аналогичны приведенным на рис. 53. Амины также могут легко протонироваться, и, так же как ионы металлов или аммония, их можно легко разделять. Типичные значения pKs для алифатических аминов лежат в области от 9.5 до 10.8. На рис. 56 в качестве примера представлено разделение ионов металлов, аминов и аминоспиртов. И в данном случае непрямое УФ- детектировамие достигается имидазольной буферной системой. Благодаря высокому разрешению пиков, все вещества, как видно из рисунка, отделены друг от друга на уровне базисной линии. 8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования Сопоставление нижней границы детектирования (НГД) и верхней границы линейной области удается провести при анализе некоторых аминов, плохо поглощающих в УФ- области. Аналогичные измерения со щелочными или щелочно-земельными ионами провести невозможно из – за их слишком малого УФ-поглощения. Из данных, приведенных в таблице 21, видно, что эта ионы при 200 нм можно детектировать прямым способом. В боратном буфере анализ длится до 5 мин. Непрямым УФ- детектированием при 254 нм с эфедрином в качестве буфера нижняя граница детектирование уменьшается в 50 раз (примерно до 1 мг/л). Линейная область в методе прямого УФ-детектирование распространяется от 1.4 до 1.6 десятичных порядков, а при непрямом УФ-детектировании -от 1.7 до 2.0 десятичных порядков. 65 Рис. 55. Разделение разжиженной пробы крови, воспроизводимость времен миграции, площади пика и нормированные площади пика. Условия аналогичны приведенным на рис. 53. Из этого видно, что и при непрямом детектировании можно работать в линейной области. Рис. 56. Разделение низших аминов и ионов металлов. Условия: прибор КЭ Mill/pore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 50/58 см; поде: 436 В/см, буфер: 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4,7; ввод пробы гидростатический, 30 с, непрямое детектирование 214 нм, проба: 1.0- 2.5 ppm; I - кадий, 2 - натрий, 3 - диметиламин, 4 - триметиламин, 5 - кальций, 6 -магний, 7 - литий, 8 - диэтиламин, 9 - триэтиламин, 10 - диэтаноламин, 11 - триэтаноламии. Таблица 21. Нижняя и верхняя границы линейной области (в ppm) в методиках прямого и непрямого детектирования. Детектирование Прямое УФ 200 нм Непрямое УФ 254 нм Вещество НГД Область линейности НГД Область линейности Этиламин 50 2000 1 50 Диэтиламин 50 2000 1 70 Триэтиламин 20 500 1 100 Условия разделения: прибор КЭ - Beckman P/FCE 2000; капилляр 75 мкм, 50/57 см; 66 поле 439 В/см; ввод пробы давлением 8 с, буфер при прямом УФ-детектировании - 50 мМ борат, рН 9.5, при непрямом УФ-детектировании - 5 мМ эфедрин/серная кислота, рН 7.5; прямое УФ-детектирование - 200 нм, непрямое - 254 нм; пробы - амины в воде. 9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков В КЗЭ белков между молекулами пробы и стенками капилляра могут возникнуть сильные, в основном электростатические, взаимодействия. Они происходят между отрицательно заряженными сила-нольными группами поверхности и положительно заряженными функциональными группами пробы. Некоторую дополнительную роль мо- гут играть также неспецифические взаимодействия с образованием водородных мостиков или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Адсорбция молекул белков на стенках капилляра может отрицательно сказываться на разделении при КЭ и поэтому нежелательна. Она приводит к ухудшению воспроизводимости времен миграции, уширению и асимметрии пиков, и даже к необратимой адсорбции компонентов пробы. Поэтому при работе с немодифицированным капилляром рекомендуется после каждого проведенного разделения при вводе пробы из биологических матриц основательно промыть капилляр (например, NaOH). При этой операции молекулы, адсорбированные на стенках капилляра, удаляются, и воспроизводимость системы улучшается. Существует несколько возможностей подавления нежелательных взаимодействий между белками и стенками капилляра. 9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах 9.1.1. Значения рН При значениях рН выше изоэлектрической точки (р!) белки существуют в анионной форме, то есть имеют те же заряды, что и стенки капилляра и во время разделения отталкиваются от них. Поскольку очень многие белки имеют значения pi, лежащие в области от нейтральных до слегка кислых, буфер для КЭ должен иметь явно щелочные значения рН (рН 9 - 11). Однако, в случае сильно основных белков ( рН > 10) эта возможность достигает своих естественных границ. Кроме этого, в данном случае дают себя знать высокая электропроводность применяемого буфера и отрицательно сказывающееся явление денатурирования, которое может возникнуть в этих характер- ных условиях. На рис. 57 показано разделение белков в немодифицированном капилляре при рН 11.5. |