Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 17. Уширение полос из-за, адсорбции на стенках.. Условия: капилляр - 50 мкм; 42/50 см; поле - 300 В/см; буфер - 50 мМ фосфат, 20 мМ сульфат лития, 10-50 мМ ДАП; рН 3.5; ввод пробы давлением, I с.; детектирование - 214 нм; проба -0,5 мг/мл лизоцим. Наряду с объемной 23 перегрузкой в случае слишком больших времен ввода при высокой концентрации пробы наблюдается также перегрузка по массе. Перегрузка по массе отчетливо видна при рассмотрении зависимости значения Н от коцентрации пробы. При равном времени ввода проб увеличивается только количество введенной пробы, а не ее объем. Доля σ VU как вклада в уширение полос остается при этом постоянной. В качестве примера на рис. 18 показан эффект перегрузки из-за большого объема и высокой концентрации пробы. Время ввода пробы повышается с 1 до 5 с, так что, хотя порог обнаружения и понижается примерно до 0.2 мМ, одновременно возрастает значение Н, поэтому вклад перегрузки по объему увеличивается. Отсюда видно, что вкладом перегрузки по объему в уширение полос пренебречь нельзя Даже при маленькой концентрации в области, в которой можно пренебречь перегрузкой по массе, значение Н остается при вводе пробы за 5 с больше, чем при вводе за 1 с. Низкий порог обнаружения при вводе больших объемов пробы нивелируется сильным уширением полос (таблица 4) и связанными с этим трудностями разделения соседних пиков. Рис. 18. Эффект перегрузки из-за большого объема и концентрации пробы. Условия: прибор для КЭ - Beckman P/ACE; капилляр - 75 мкм, 65/72 см; поле - 347 В/см; буфер А - 70 мМ борат, рН 8.5; буфер В - 40 мМ борат, рН 8.5; ввод пробы давлением, I или 5 с; проба - фенилтриметидаммонийхлорид. Таблица 4 Рассчитанное влияние длины вводимой зоны пробы на уширение полос Длина вводимой зоны [мм] N для D=10 -5 см 2 /с N для D=10 -6 см 2 /с 1 2 10 238000 164000 81000 1400000 385000 112000 5.6. Наложение профилей потока При разделении в КЭ всегда надо обращать внимание на то, чтобы не было разницы в уровнях между обоими сосудами с электролитом. Даже при незначительной разнице уровней в капилляре возникает течение, которое приводит к параболическому профилю потока. Этот эффект вызывает дополнительный вклад в уширение полос и сильно зависит от радиуса капилляра. В то время как в случае капилляра с внутренним диаметром 25 мкм этим эффектом можно практически пренебречь, в капилляре диаметром 100 мкм этот эффект сильно ухудшает эффективность разделения и оказывает влияние на разрешение пиков. 5.7. Резюме Важнейшие причины уширения полос в КЭ представлены в таблице 5. 24 Таблица 5 Основные причины уширения полос Причина уширения полос Примечание Продольная диффузия Соответствует теоретическому пределу; увеличивается с уменьшением ММ и с увеличением времени анализа Термические эффекты Приводят к конвекции и к локальным изменениям вязкости буфера Длительность вво- да пробы Должна быть меньше, чем зона, возникающая в результате диффузии; может увеличиваться для того, чтобы снизить порог обнаружения. Адсорбция пробы на стенках Причина появления пиков с "хвостами" и плохой воспроизводимости времени миграции Электродисперсия (различие в подвижностях) Причина треугольной формы пиков Различие в уровнях жидкости Гидродинамический поток с соответствующим профилем потока 6. Аппаратура Аппаратура для КЭ появилась в продаже с 1988 года, количество предложений постоянно растет. Отдельные приборы принципиальных различий не имеют, так как сами системы разделения очень просты. Различия связаны с вводом пробы, а также числом и видом предлагаемых детекторов. Здесь не дается обзор рынка, а приводятся только типичные требования, предъявляемые к различным элементам аппаратуры. Обзор рынка дается в журнале Nachr. Tech. Lab. (март 1993). 6.1. Источники напряжения Напряжение должно регулироваться в области от -30 кВ до +30 кВ и при заданном значении по возможности оставаться постоянным. Максимально допустимый ток составляет 250 мкА, применение существенно больших значений на практике нецелесообразно. Кроме того, оказалось выгодным, если или напряжение, или ток могли бы поддерживаться постоянными независимо друг от друга. Автоматическая переполюсовка источника напряжения необходима только тогда, когда последовательность проб нужно обработать с помощью различных методов анализа и с применением по-разному ориентированного электрического поля. Запись кривых напряжения и тока может указать на случайные нарушения во время анализа и быть полезной при поиске ошибок. В коммерческих приборах источник высокого напряжения автоматически отключается при открывании емкости, в которой происходит анализ, так что несчастные случаи исключаются. В приборах собственной конструкции, а также в коммерческих модульных приборах КЭ также обязательны меры предосторожности. 6.2. Капилляры В КЭ обычно применяются кварцевые капилляры диаметром от 50 мкм до 100 мкм. В принципе возможно также применение стеклянных и пластиковых капилляров, которые, однако, не обладают достаточной проницаемостью в коротковолновой УФ-области, 25 Полиамидный слой кварцевого капилляра перед применением должен быть удален на месте детектирования механически или с помощью выжигания. С недавних пор в продаже появились также капилляры с покрытиями, проницаемыми для УФ-лучей. В большинстве случаев используются необработанные и немодифицированные капилляры. Кварцевые капилляры разных фирм различаются по точности непо- стоянству внутреннего диаметра, а также обработке внутренней поверхности и оптической проницаемости в области коротких волн. По этой причине для полного гидроксилирования поверхности новые капилляры перед их первым употреблением должны обрабатываться в течение 10 минут 1 М раствором NaOH и затем выдерживаться примерно 20 минут в разделительном буфере. Наиболее дешевыми являются капилляры, которые предлагаются различными фирмами-производителями на метры. Цена их в настоящее время около 10 марок ФРГ за метр. Существенно дороже капилляры, которые продаются поштучно готовыми к употреблению. Цена здесь колеблется в зависимости от типа капилляра (с покрытием или без, с ячейкой детектора или без и т.д.) и находится в пределах от 100 до 400 марок ФРГ за капилляр. При подготовительной работе, связанной с установкой капилляров, отрезанных самостоятельно, необходимо контролировать место среза. Только ровное место среза гарантирует безупречный ввод пробы. Для изготовления окна для детектирования имеются две возможности: во-первых, полиимид может выжигаться, во-вторых он может удаляться с помощью концентрированной кислоты (время обработки около 1 часа). Выжигание можно осуществить просто нагретой до красного каления проволокой . Этот метод однако не следует применять для капилляров, модифицированных покрытием внутри. Соскабливание (лезвием бритвы) полиимида довольно трудно, и при этом можно разбить капилляр. Модификация поверхности капилляра может достигаться теми же методами, которые описаны для модификации силикагеля с целью получения стационарной фазы для ВЭЖХ или для покрытия капиллярных колонок в ГХ. Как уже отмечалось ранее, для характеристики модифицированной поверхности капилляра применяется в основном изменение ЭОП. Иногда применяется также газохроматографический метод. Преимущества и недостатки модифицированных капилляров обсуждаются в конкретных методиках разделения, в которых используются эти капилляры. То же самое относится к капиллярам, заполненным гелем. В КЭ типичный вводимый объем находится в пределах между 2 и 20 нл, так что при объеме пробы 1 мкл возможно многократное впрыскивание. Раствор пробы после анализа с помощью КЭ может использоваться для дальнейших исследований. В таблице 6 представлены вводимые объемы вместе с другими важными характеристиками системы разделения. Объем рассчитывался для введенной зоны про- бы длиной 1 мм в капилляре с внутренним диаметром от 250 до 25 мкм. Вводимый объем в используемых капиллярах с внутренним диаметром 75 мкм составляет около 5 нл, что соответсвует от 0.5 до 2 ppm от объема пробы 1 мкл. 26 Таблица 6. Характеристики капилляра Внутренний диаметр [мкм] Вводимый объем при длине 1 мм [нл] Объем капилляра при длине 1 м [мкл] Относительное сопротивление [%] Поверхность на метр [MM 2 ] Отношение поверхность/объем [1/мкм] 250 49,4 49,4 625 785 11 160 20,1 20,1 256 502 25 100 7,9 7,9 100 314 40 75 4,4 4,4 56 236 54 50 2,0 2,0 25 157 79 25 0,5 0,5 6 79 158 Помимо вводимого объема, важным параметром разделительной системы является также сопротивление капилляра. Эта характеристика была занесена в табл. 6 как отношение сопротивления данного капилляра к сопротивлению капилляра с внутренним диаметром 100 мкм. Из таблицы также видно, что сопротивление при уменьшении внутреннего диаметра от 100 мкм до 50 мкм падает до 25% от первоначального значения. Это означает, что при идентичных экспериментальных условиях джоулево тепло уменьшается на четверть. Поскольку удваивается также отношение поверхности к объему, возникающее тепло будет легче отводиться. Вот почему для разделения выгодно использовать узкие капилляры. Однако имеются также и два осложняющих обстоятельства: во-первых, при этом уменьшается толщина слоя при УФ- детектировании в режиме реального времени и поэтому снижается чувствительность детектирования, во-вторых, возрастает время, необходимое для обновления разделительного буфера. Таблица 7 Теоретическая оценка времени, необходимого для замены буфера в капилляре, в зависимости от внутреннего диаметра капилляра. Внутренний диаметр капилляра [мкм] Время для промывки определенным объемом (около 100 мкл) Время для промывки 5- кратным объемом капилляра 160 1 мин 1 мин 100 6 мин 33 с 2 мин 34 с 75 20 мин 43 с 4 мин 33 с 50 1 час 44 мин 51 с 10 мин 14 с 25 1 день 3 часа 57 мин 43 с 40 мин 10 45 дней 12 часов 16 мин 4 часа 16 мин 5 2 года 4 часа 16 мин 17 часов 4 мин Времена относятся к буферной системе с вязкостью воды, капилляру длиной 1 м и разнице давлений около 0.5 бар. Причина сильного увеличения времени промывки заключается в зависимости потока от внутреннего диаметра капилляра, которая формулируется законом Хагена-Пуазейля: L t r p dt dV ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ∆ ⋅ = η π 8 4 27 В таблице 7 приведены времена, которые необходимы для промывки капилляра определенным объемом (колонка 2) или объемом, в несколько раз превышающим объем капилляра (колонка 3). Времена, рассчитанные в этой таблице, дают также представление о зависимости времени ввода при вводе зон пробы одинаковой длины и, соответственно, одинаковых объемов в капиллярах с различным внутренним диаметром. Если, например, мы будем вводить в капилляр диаметром 50 мкм такой же объем пробы, как в капилляр диаметром 100 мкм, то время ввода будет в 16 раз больше. Если же будем вводить зоны пробы одинаковой длины, необходимо по крайней мере еще 4-х кратное время ввода. 6.3. Ввод пробы Таблица 8. Сопоставление способов ввода пробы для КЭ. Электро- кинетический ввод Гидростатический ввод Гидродина- мический ввод Ввод дроблением пробы Движущая сила ввода пробы Электрическое поле Сифон-эффект Давление или вакуум Электрическое "дробление" пробы и система "расщепления" Автомати- зация да да Да нет Минимальное количество пробы <2,0 мкл многократный ввод <2,0 мкл многократный ввод 2,0 мкл многократный ввод >10 мкл с помощью дозировочного капилляра или ВЭЖХ-шприца многократный ввод пробы невозможен Побочные эффекты при вводе пробы да нет нет да (для электрического "дробления") нет (для системы "расщепления" потока) Относи- тельное средне- квадратичное отклонение 4,1% <2,9% 2-3% (опытная величина) <3% (идеальный случай для электрического "дроб- ления", 2% (для системы "расщепления" потока) Воспроизводимый ввод пробы представляет в КЭ наиболее сложную проблему. Для того, чтобы не вызвать уширения полос, зона пробы должна быть мала. Поэтому необходимо вводить очень маленький объем пробы - от 5 до 50 нл. Слишком большой объем пробыочень быстро приводит к искажению пика и ухудшению разделения. Чтобы отвечать этим высоким требованиям, а также для облегчения работы со столь малыми объемами, необходима миниатюризация и автоматизация ввода пробы. Воспроизводимый ввод маленьких объемов пробы является важной предпосылкой для количественного анализа и стандартизации отклонений. Важнейшие способы ввода пробы, которые находят применение в различных автоматизированных коммерческих приборах, представлены в табл. 8. 6.3.1. Ввод пробы давлением 28 Ввод пробы обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуда для пробы, либо снижается на конце капилляра. Обе эти возможности допускают также простую промывку капилляра свежим буферным раствором. Количество вводимой пробы рассчитывается по соотношению: L c t r p Q i ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ∆ = η π 8 4 и зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы. При временах ввода порядка нескольких секунд разность давлений лежит в области нескольких миллибар. В коммерческих приборах это наиболее распространенный способ ввода проб. Проблему при этом методе ввода пробы составляет сжимаемость газа. Схема на рис. 19 поясняет эту проблему. Во-первых, выбранное для ввода давление должно быстро достигаться, во-вторых, падение давления после ввода пробы не должно быть резким. Поэтому полезно использовать в работе интеграл давление-время. Относительное стандартное отклонение, по нашим оценкам, лежит в интервале между 2% и 3%; применяя внутренний стандарт можно уменьшить эту величину до 1% и ниже. Для определения вводимого объема существуют две принципиальные возможности. Во-первых, это удается сделать с помощью расчета, во-вторых, его легко можно контролировать посредством измерения. Расчет вводимого объема базируется на законе Хагена-Пуазейля и сильно зависит от параметров, которые обычно известны. В качестве примера можно назвать вязкость, а также радиус капилляра. Колебание радиуса капилляра только на 1% вызывает очень большую ошибку в расчетах, по- скольку в законе Хагена-Пуаэейля радиус входит в четвертой степени. Рис. 19. Кривая давление-время при вводе проб: а) неконтролируемое повышение давления (например, в результате простого открывайся вентиля давления); b) контролируемое повышение и понижение давления. Затемненная площадь - нормальный интеграл давление-время, заштрихованная площадь - коррекция посредством дополнительного импульса давления. Практическое определение осуществляется очень просто измерением проскока: время ввода выбирается так, чтобы зона пробы УФ-активного раствора доходила до детектора. Полученный ступенчатый сигнал анализируется таким образом, что отыскивается точка сигнала на половине высоты, и перпендикуляр на ось времени дает время проскока растворителя. Поскольку в данном случае можно работать с таким же растворителем, который вводится в систему, ошибка, связанная с вязкостью или радиусом капилляра, может быть незначительной. Расчет вводимого объема проводится теперь просто через время. Например, известно, что поток перемещается на 17.7 мм в минуту . При времени ввода 30 секунд (типично для анализа ионов в КЭ) и длине вводимой зоны пробы 8.9 мм это соответствует количеству почти 40 нл (при 29 внутреннем диаметре 75 мкм). 6.3.3. Электрокинетический ввод пробы При этом способе ввода сосуд с пробой, в который погружен капилляр, соединяется с источником напряжения, и под действием короткого импульса напряжения компоненты пробы перемещаются в разделительный капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения (Uj), времени (tj), в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы: L c t U r Q i i p ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ + = ∞ 2 ) ( π µ µ где с - концентрация пробы в растворе. Из этой зависимости видна проблема данного способа ввода пробы: компоненты пробы с различной подвижностью будут детектироваться по-разному. Если сравнить площади пиков проб с различными подвижностями при электрокинетическом и гидростатическом способах ввода пробы, то отчетливо видно, что ион, перемещающийся быстрее, при электрокинетическом вводе всегда даст больший пик и будет вводиться в капилляр с некоторой селективностью. Таблица 10 показывает отношение площадей для растворов пробы равной концентрации быстро перемещающегося рубидия и более медленных тестовых ионов. Если разделить отношение площадей пиков из колонок 2 и 3, то получим "фактор различия" обоих ионов. Он показывает, во сколько раз больше концентрируется более быстрый ион при электрокинетическом вводе пробы. Колонка 4 дает дополнительно отношение подвижностей ионов. Корреляция с колонкой 3 убедительно показывает, что "фактор различия" совпадает с отношением подвижностей. Различная скорость миграции при электрокинетическом вводе проб определяет разную скорость отбора разных ионов. Электрическое сопротивление раствора пробы (ионная сила) по сравнению с раствором электролита также влияет на воспризводимость метода. Это явление проще всего может быть показано при непосредственном сравнении обоих способов ввода пробы и представлено на рис. 20. Если вводится раствор ионов калия и лития в чистой воде (сопротивление 18 кОм), то разница между гидростатическим и электрокинетическим вводами пробы наибольшая. Разница будет меньше при увеличении электропроводности раствора пробы. В результате повышенной электропроводности при электрокинетическом вводе будет происходить перенос зарядов и других ионов и будет вводиться меньше ионов пробы. Таблица. 10 Сравнение отношения площадей пиков при электрокинетическом и гидростатическом способах ввода пробы. Пара пиков Отношение площадей при электронети- ческом вводе Отношение площадей при гидростатическом вводе пробы Фактор различия ("дискриминационное отношение") Отношение под- вижностей Rb + / K + 1.0 0.94 1.06 1.04 Rb + /TMA 2.08 1.33 1.57 1.57 Rb + / Li + 1.17 0.69 1.70 1.73 Rb + /ДЭА 6.91 3.93 1.76 1.81 Rb + /apr 4.34 1.92 2.26 2.31 30 ТМА - триметиламин, ДЭА - диэтиламин, арг - аргинин. Если существует электроосмотический поток, то при небольшом сопротивлении раствора пробы ионы вводятся в капилляр в основном в результате переноса раствора пробы за счет ЭОП, и электрофооретическое перемещение ионов играет только второстепенную роль. Из рисунка также ясно видно, что этот эффект появляется только у ионов с очень высокой подвижностью. Наклон прямой для электрокинетического ввода калия больше, чем для лития. Причина заключается вбольшей подвижности калия. В случае гидродинамического ввода наклоном обеих прямых можно пренебречь, поскольку в данном случае вводимое количество пробы не зависит от сопротивления раствора пробы. Несмотря на эти недостатки, с недавнего времени широко используется электрокинетический ввод пробы. С помощью так называемого "электростэкинга" удается сконцентрировать пробу от 10 до 500 раз, так что порог обнаружения метода вследствие этого в целом может быть снижен. Рис. 21 показывает процесс "электростэкинга" на примере ввода раствора с ионами, которые мигрируют с ЭОП. Подробности оптимизации этой техники даются а разделе "Эффекты обогащения при вводе проб (стэкинг)". Для автоматизированного электрокинетического ввода пробы было установлено относительное стандартное отклонение (ОСО) 4.1%. В общем, как и во всех методах с проблемами при вводе пробы, например, при капиллярной ГХ, за счет применения внутреннего стандарта можно существенно улучшить воспроизводимость количественного анализа. Рис. 20. Зависимость площади пика от электрического сопротивления раствора пробы при гидростатическом и электрокинетическом способах ввода пробы. 6.3.4. Делитель пробы По аналогии с капиллярной ГХ, при КЭ также описана система деления при вводе пробы. Электрические и гидродинамические системы деления пробы различаются между собой. У электрического делителя пробы (см. рис. 22) в середине дозировочного капилляра находится ответвление в разделительный капилляр. К обоим капиллярам (дозировочному и разделительному) приложено поле различной напряженности. Таким образом, проба движется в двух различных токовых цепях, причем отношение деления можно давать как отношение обоих токов в капиллярах. Сообщалось, что погрешность этого метода не более 3%. 31 При системе деления потока с помощью шприца, обычно применяемого в ВЭЖХ (ВЭЖХ-шприца), объем пробы вводится в Т-образную часть. Отношение деления дается через отношение диаметров и длин разделительного и сливного капилляров. Для этого метода ОСО, как описано в литературе, составляет около 2%, однако необхо- дим относительно большой объем пробы. Другие системы деления, в частности, основанные на использовании ВЭЖХ-насосов, обладают худшей воспроизводимостью. Рис. 21. Ввод раствора пробы с низкой электропроводностью. А:большой объем пробы впрыскивается гидродинамически; В:молекулы пробы перемещаются к пограничному слою между зоной ввода пробы и разделительным буфером; С: скон- центрированные молекулы пробы перемещаются в разделительный буфер. |