Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Научный совет Российской академии наук по хроматографии Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1 Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу - новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее высокоэффективных аналитических методов. Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как количественного метода анализа сложных биологических смесей, описание аппаратурного оформления метода и некоторые конкретные методики анализа. В приложении к книге дано краткое описание приборов для капиллярного электрофореза, выпускаемых некоторыми зарубежными и отечественными фирмами. Книга рассчитана на ученых и специалистов, работающих в области определения состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных препаратов, в клиническом и токсилогическом анализе. Перевод: д.х.н. Р.Ш. Вартапетян Под редакцией д.х.н. А.М.Волощука Ил.107.Табл. 30. Рецензент: к.х.н. И.В. Назимов 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ .....................................................................................................................................................................2 Предисловие .......................................................................................................................................................................4 1. Введение .........................................................................................................................................................................5 2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ) ..................................................................................................................7 3. Эпектрофоретическое перемещение............................................................................................................................9 4. Электроосмотический поток (ЭОП) .............................................................................................................................10 5. Уширение полос............................................................................................................................................................15 5.1. Потеря эффективности вследствие диффузии ...................................................................................................15 5.2. Потеря эффективности в результате температурных эффектов.......................................................................17 5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии ........................................................................19 5.4. Адсорбция на стенках ............................................................................................................................................21 5.5. Перегрузка системы разделения ..........................................................................................................................22 5.6. Наложение профилей потока ................................................................................................................................23 5.7. Резюме....................................................................................................................................................................23 6. Аппаратура....................................................................................................................................................................24 6.1. Источники напряжения...........................................................................................................................................24 6.2. Капилляры ..............................................................................................................................................................24 Характеристики капилляра...........................................................................................................................................26 Таблица 7 ...................................................................................................................................................................26 6.3. Ввод пробы .............................................................................................................................................................27 6.3.1. Ввод пробы давлением.......................................................................................................................................27 6.3.3. Электрокинетический ввод пробы..................................................................................................................29 Таблица. 10 ................................................................................................................................................................29 6.3.4. Делитель пробы...............................................................................................................................................30 6.3.5. Эффекты обогащения при вводе пробы (стэкинг) ........................................................................................32 6.4. Термостатирование................................................................................................................................................34 6.5. Детектирование......................................................................................................................................................35 6.5.1. Уф-детектирование .........................................................................................................................................35 Методы концентрирования («стэкинг»-мвтоды) в КЭ..........................................................................................36 6.5.2. Фпуоресцентное детектирование...................................................................................................................39 6.5.3. Прочие методы детектирования.....................................................................................................................40 6.6. Количественный анализ ........................................................................................................................................42 Методы детектирования в КЭ ......................................................................................................................................42 Таблица 13 .................................................................................................................................................................45 Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от ............................................................................45 Таблица 14 .................................................................................................................................................................45 Таблица 16 .................................................................................................................................................................47 7. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) .................................................................................................................48 7.1. Влияние рН .............................................................................................................................................................49 7.2. Влияние концентрации буфера.............................................................................................................................51 7.3. Выбор буфера ........................................................................................................................................................51 7.4. Области применения .............................................................................................................................................51 8. Непрямое Уф-детектирование в КЭ ............................................................................................................................53 8.1. Непрямое Уф-детектирование анионов ...............................................................................................................53 8.2. Непрямое Уф-детектирование катионов ..............................................................................................................58 8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования ..................................................................64 9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков ....................................................................................................66 9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах ........................................................................66 9.1.1. Значения рН .....................................................................................................................................................66 9.1.2. Добавление солей к буферу ...........................................................................................................................67 9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу ..........................................................................................67 9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков.............................................................................67 (динамическое наполнение капилляров).................................................................................................................67 9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью .....................................................................69 9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ...................................................................................................................70 9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров..........................................................................71 9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров ............................................................................71 9.2.2.2. Методы покрытия ......................................................................................................................................71 9.2.3. Характеристики заполненных капилляров в КЭ ............................................................................................72 9.3. Обзор важнейших химических покрытий..............................................................................................................72 9.3.1. Общепринятые покрытия ................................................................................................................................72 9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия......................................................................................................................72 9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия ..............................................................................................................73 9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия ...........................................................................74 9.3.1.4. Покрытия на основе белков .....................................................................................................................75 3 9.3.2. Полимерные покрытия ....................................................................................................................................75 9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов..................................................................................75 9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона).......................................................................................76 9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) ...........................................................................................77 (нанесение ионных слоев).....................................................................................................................................77 9.3.2.4. Покрытие капилляров поли(метилглутаматом) ......................................................................................78 9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ.........................................78 9.4. Выводы ...................................................................................................................................................................79 10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография ...............................................................................................80 11. Разделение энантиомеров.........................................................................................................................................88 11.2. Смешанные химические разделяющие системы...............................................................................................90 11.3. Капилляры с ЭОП и без него...............................................................................................................................91 11.4. Выбор подходящего LLQ .....................................................................................................................................91 11.5. Оптимизация концентрации ЦД ..........................................................................................................................91 11.6. Оптимизация значений рН...................................................................................................................................93 11.7. Оптимизация фоновых электролитов.................................................................................................................94 11.8. Буферные добавки...............................................................................................................................................95 12. Капиллярный гепь-эпектрофорез ..............................................................................................................................96 12.1. Гели на основе акриламида ................................................................................................................................96 12.1.1. Поперечносшитые полиакрипамидные гепи................................................................................................97 12.1.2. Линейные полиакриамидные цепи. ..............................................................................................................98 12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН ...................................................................101 12.2. Гепи на основе пописахаридов и других полимеров .......................................................................................102 12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах ...........................................................................103 13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах ............................................................................................105 14. Изотахофорез (ИТФ).................................................................................................................................................108 15. Эпектрохроматография (ЭХ)....................................................................................................................................109 16. Перспективы..............................................................................................................................................................110 Рекомендуемые книги:.........................................................................................................................................110 Обзорные статьи..................................................................................................................................................110 Список сокращений, часто встречающихся в тексте:........................................................................................111 4 Предисловие В основу книги положены лекции профессора Саарбрюкенского университета (Германия) Х.Энгельгардта, предназначенные для специалистов, желающих овладеть капиллярным электрофорезом - новым современным методом анализа сложных смесей. Книга выпущена в качестве учебного пособия для школы по капиллярному электрофорезу, проводимой для российских ученых и специалистов сотрудниками Саарбрюкенского университета под руководством проф. X. Энгельгардта в Москве в апреле 1996 года. Программа школы включает практические занятия на приборах некоторых зарубежных фирм. В приложении к "Руководству по капиллярному электрофорезу" приведена информация о фирмах, специализирующихся в выпуске аппаратуры для капиллярного электрофореза: Beckman, BioRad, Cheminst (Dionex, Gilson), Hewlett Packard, Perkin-Elmer, Termo Separation Products, Waters, Экотехника. Издание данной книги стало возможным благодаря финансовой поддержке фонда "Фольксваген" ( Германия). Научный совет РАН по хроматографии выражает искреннюю благодарность проф. Х.Энгельгардту и его сотрудникам за предоставленные материалы, фонду "Фольксваген" за финансовую поддержку, а также д.х.н. Р.Ш. Вартапетяну, д.х.н. A.M. Волощука, к.х.н. Л.Н. Коломиец, к.х.н. И.В. Назимову и Р.И.Хамидуллину за подготовку книги "Ру- ководство по капиллярному электрофорезу" к изданию. 5 1. Введение Такие аналитические методы, как хроматография и электрофорез, находят широкое применение в определении состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды и промышленной продукции. Методы газовой хроматографии (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяют за короткое время проводить разделение, идентификацию и количественное определение состава сложных смесей. Благодаря сочетанию высокоэффективных разделительных систем с чувствительными, селективными и специфическими детекторами, такими, например, как диодно- матричный детектор (ДМД) в видимой и УФ-областях спектра, масс-спектрометрия и ИК- фурье-спектроскопия (ИКФС) удается надежно идентифицировать отдельные вещества. Приборное оформление этих методов настолько хорошо развито, что почти всегда удается автоматизировать проведение хроматографических анализов. Области применения методов ГХ и ВЭЖХ ограничиваются требованиями, предъявляемыми к пробам в каждом из этих аналитических методов. Поэтому ВЭЖХ в настоящее время является наиболее широко распространенным методом разделения с хорошими перспективами на дальнейшее расширение области его применения. (Темпы прироста рынка приборов для ВЭЖХ стабильно превышают 10% в год). Проблемы при применении ВЭЖХ возникают тогда, когда необходимо быстро и с большой эффективностью проанализировать полярные и ионогенные пробы, особенно пробы, обладающие высокой основностью, а также биополимеры. Это - одна из наиболее сложных проблем хроматографии, связанная с использованием стационарных фаз на основе силикагеля. Хотя в последние годы появились фазы, при использовании которых удается решить эти проблемы, для дальнейшего развития аналитических методов разделения ионогеннных веществ необходимо высокое мастерство и глубокое понимание протекающих при этом многообразных сорбционных ионообменных процессов. Фазы на основе чистых органических веществ из-за своей способности к набуханию обладают меньшей эффективностью и ограниченной устойчивостью к давлению по сравнению со стационарными фазами на основе силикагеля. Поэтому неудивительно, что эти фазы до настоящего времени не получили широкого распространения. Хотя в распоряжении исследователей имеются ионообменные фазы как на основе силикагеля, так и на основе полимеров, ионнообменная хроматография также не получила широкого распространения, так как для разделения компонентов неоходима градиентная техника (градиенты рН или ионной силы). Для ионогенных соединений предлагается элекрофоретическая техника разделения. Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами: (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут уско- ряться в различной степени; (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их мо- лекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). Классический электрофорез (гель-электрофорез или электрофорез на бумаге) имеет две характерные особенности. Во первых, количественный анализ возможен только с 6 помощью измерений в отраженном свете, а в случае белков только по степени их окрашивания, и поэтому часто бывает ошибочным. Во-вторых, падение напряжения при прохождении через гель не может быть выбрано слишком высоким. Степень нагрева возрастает пропорционально напряжению, так что необходимо эффективное охлаждение, чтобы избежать высыхания геля. Время анализа на отрезке геля длиной в 10 см может достигать нескольких часов. В любом случае при гель-электрофорезе воз- можно проводить одновременно большое число разделений на одном геле, при этом производительность сильно увеличивается. В плоскостном варианте метода, кроме того, можно без затруднений проводить двумерные 2D-процессы с использованием различных механизмов разделения. Отметим также высокую разрешающую способность 2D-гель-электрофореза при анализе белков. 7 2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ) Развитие КЭ началось с пионерских работ Миккерса и Эвериртса (конец 70-х годов) и Йортенсона и Лукаса (начало 80-х годов). Быстрое развитие метода было обусловлено двумя решающими усовершенствованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутренний диаметр разделительного капилляра; во-вторых, детектирование по электропроводности, пришедшее первоначально из изотахофореза, было заменено на прямое УФ-двтектирование в потоке жидкости. Предпосылкой для дальнейшего развития метода была возможность использования кварцевого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-области и с равномерным внутренним диаметром от 50 до 100 мкм. При этом улучшились как разделение, так и возможности детектирования. С помощью кварцевого капилляра с внутренним диаметром 50-100 мкм удалось достигнуть высокоэффективного разделения белков и дансил-аминокислот, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему было сильно уменьшено влияние мешающей разделению термически индуцированной конвекции. Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре. Простота аппаратуры и возросшая потребность в разделении биомолекул привели во второй половине 80-х годов к повышенному интересу к данному методу. Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только |