Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 64. Схема синтеза ПЭГ-покрытия. Электроосмос и стабильность. При покрытии диолом и полиэтиленгликолем (ПЭГ), как и ожидалось, электроосмос резко уменьшается. (В случае диола m ЭОП =0.1 см 2 /кВс для 50 мМ фосфата и рН 6). Рабочая область для таких капилляров ограничивается значениями рН от 3 до 5. Долговременная стабильность в этих условиях достигает не- скольких месяцев. При покрытии мальтозой возможна работа в области рН от 3 до 7. Вследствие того, что при нанесении аминосиланов с мальтозой реакции обмена подвергаются не все функциональные аминогруппы, при низких значениях рН поверхность заряжается положительно. Это приводит к обращению направления ЭОП в кислотах. Кроме того, хранение капилляров в этом случае возможно только при добавлении консервантов, защищающих покрытие от повреждения микроорганизмами. Применимость: Покрытия на основе диола, ПЭГ и мальтозы в основном используются для разделения белков в КЭ. Разделение стандартных белков показано на рис. 65. В заключение можно отметить, что и в случае гидрофильных покрытий капилляров или на первой стадии синтеза введенной ''подложки" поверхность покрывается недостаточно плотным слоем, так что зачастую взаимодействия поверхности с пробой подавляются не полностью. Рис. 65. Разделение белков в капилляре, 75 покрытом ПЭГ. Буфер: 30 мМ фосфат, рН 3.8; пробы: 1 - цитохром С, 2 - лизоцим, 3 - миоглобин, 4 - трипсин, 5 - РНК, 6 - трипсиноген, 7 - химотрипсиноген. 9.3.1.4. Покрытия на основе белков Изготовление. Внутренние стенки капилляров можно покрыть не только углеводородами, но и белками, например, альфа-лактальбумином. Для того, чтобы свободные альдегидные группы служили центрами связи с белками, в капилляре, модифицированном аминогруппами, сначала проводится реакция обмена с глутардиальдегидом. Впоследствии эти группы реагируют с введенным в капилляр белком. Электроосмос. Покрытия на основе белков показывают интересную зависимость ЭОП от рН. Вследствие того, что белки имеют амфотерные свойства, выше своих значений рI они существут в анионной, а ниже - в катионной формах. Если значения рН буфера соответствуют значениям pi, то белки незаряжены. Следовательно, в этой точке электроосмос должен падать до нуля, или, соответственно, менять направление на противоположное при переходе через эту точку. Таким образом, в принципе существует возможность подбором определенного белка или амфотерных молекул регулировать силу и направление ЭОП. 9.3.2. Полимерные покрытия 9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК- электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом. Изготовление. В двухстадийной реакции стенка капилляра сначала обрабатывается гаммаметакрилоксипропилтриметоксисиланом в разбавленной уксусной кислоте. Нанесенные таким способом виниловые группы на второй стадии реакции сополимеризуются в водном растворе с акриламидом В качестве радикального инициатора реакции служит персульфат аммония, а катализатором является N,N,N’,N’- тетраметиленэтилендиамин (ТМЭД) (рис. 66). Рис.66. Схема, образования полиакридамидного покрытия. Электроосмос и стабильность. ЭОП полностью подавляется при покрытии поверхности капилляра линейным полиакриламидом. Стабильность таких капилляров при низких рН (до 3) очень высокая, однако в щелочной среде при рН>8 они нестабильны. Эта нестабильность проявляется в постепенном появлении ЭОП, а также колебаниях времени миграции проб. Применимость. С учетом простоты производства, а также доступности приобретения покрытия на основе линейных полиакриламидов нашли широкое применение. В первую очередь речь идет не только о разделении белков, но и некоторых биомолекул - таких, как фрагменты ДНК. На рис. 67 показано разделение стандартных проб при рН 2.8. Несмотря на заметно возросший ЭОП, можно работать с нормальными полями, так что разделение 76 заканчивается примерно через 5 минут. Вследствие того, что покрытия на основе линейных полиакриламидов позволяют полностью подавить ЭОП, можно перенести такой классический способ разделения, как ИЭФ, на КЭ. В области биологически важных проб наряду с белками определенную роль играют также нуклеотиды, олигонуклеотиды и фрагменты ДНК. Такого рода пробы в КЭ до настоящего времени разделяли методом МЭКХ, а также полиакриламидгелевым КЭ. Покрытия на основе линейных полиакриламидов в сочетании с макромолекулярными буферными добавками можно привлечь для разделения фрагментов радикалов ДНК в широкой области. Использование покрытых капилляров для этих целей представляется вполне выгодным, поскольку проблемы, связанные с использованием капилляров, заполненных гелем (образование пузырей, воспроизводимость и стабильность гелей) еще не решены. Наконец, капилляры, покрытые линейными полиакриламидами, можно использовать также для изготовления гельзаполненных капилляров. Рис. 67. Разделение стандартных белков при проверке стабильности капилляра, покрытого полиакриламидом. Буфер: 30 мМ цитрат, рН 2.8; пробы: А- лизоцим, В - РНК, С - химотрип-синоген. 9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона) Капилляры, покрытые поли(винилпирролидоном) (ПВП) успешно применяли для разделения белков методами гельпроникающей эксклюзионной хроматографии (ГПХ) и хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) в ВЭЖХ. Применению ПВП в качестве покрытия уделяется внимание также в КЭ. Изготовление. На первой стадии на стенку капилляра наносится виниловое покрытие. На заключительной стадии проводят сополимеризацию с 1-винил-2-пирролидоном в водном растворе с использованием ТМЭД в качестве катализатора и персульфата аммония как радикального инициатора реакции. Рис. 68. Пример разделения белков в капилляре с ПВП-покрытием. Буфер: 58.5 мМ фосфат, рН 2.0; пробы: А - бэта- 77 лактогдобулин В, В - бэта-лактоглобулин А, С - лизоцим, D - серумальбумин человека, Е - РНК крупного рогатого скота, F - цитохром С, G - трипсиноген, Н - миоглобин кита, I -трансферрин, J - кональбумин, К • миоглобин лошади, L -карбоксиангидраза В, М - карбоксиангидраза А, N - гемоглобин, О - парвальбумин. Свойства и применимость. Оптимальная рабочая область для такого типа покрытий для разделения белков приходится на область сильных кислот, в которой капилляры сохраняют стабильность в течение нескольких недель. На рис. 68 показано разделение 15 (!) стандартных белков в области р! от 4.5 до 11 (!) и ММ от 12000 до 77000. Эффективность достигает 700000 теоретических тарелок в течение 25 минут. Покрытия на основе ПВП для кварцевых капилляров являются высокопроизводительными и при использовании в области, кислотных рН вполне конкурируют с покрытиями на основе линейных полиакриламидов. 9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев) Поли(этиленимин) (ПЭИ) является положительно заряженным полимерным покрытием, которое закрепляется на стенке капилляра под действием электростатических взаимодействий. Изготовление. Способ нанесения такого покрытия похож на способ нанесения покрытия из анионообменных материалов на полимерные и силикатные подложки для ВЭЖХ: при этом сначала на поверхности носителя адсорбируются первичные ПЭИ с различными ММ и концентрацией, затем производится их поперечное сшивание. В качестве сшивающего агента служит в данном случае этиленгликольдиглицидилэфир. ПЭИ содержит сдвоенные полимерные цепи с первичными, вторичными и третичными аминогруппами в соотношении 1:2:1. Эти функциональные группы делают возможными как электростатические взаимодействия, так и поперечную сшивку. Электроосмос. Вследствие того, что концентрация основных аминогрупп в полимере высока, в широкой области рН покрытие остается заряженным положительно, что приводит к обращению направления ЭОП. При этом абсолютные значения элетроосмотических подвижностей, которые для данных покрытий достигаются при низших рН, лежат в той же области, что и скорости потоков для необработанных капилляров при основных рН (!). Подробная ЭОП/рН - характеристика, а также зависимость от количества нанесенного ПЭИ показана на рис. 69. Как и ожидалось, с ростом значения рН буфера ЭОП увеличивается, т.к. при этом резко ускоряется депротонирование аминогрупп. Кроме того, в данном случае нельзя также полностью исключить влияние силанольных поверхностных групп (депротонирование в щелочи!). Применимость. Наряду с интересными свойствами по отношению к ЭОП, капилляры, покрытые ПЭИ, пригодны также для разделения белков. (Отталкивание положительно заряженных белков от стенки капилляра!). (Рис. 70). Рис. 69. Зависимость ЭОП от рН (ЭОП/рН-характеристики) капилляров с нанесенным ПЭИ при различных концентрациях ПЭИ. 78 9.3.2.4. Покрытие капилляров поли(метилглутаматом) Исходным соединением для изготовления этого полипептидного покрытия является мономер М-карбоксиангидрид гаммаметилглутамата. Сначала проводят адсорбцию этого соединения на стенку капилляра, затем с помощью нагревания с одновременным расщеплением диоксида углерода проводят полимеризацию. Электроосмос. Вследствие того, что нанесенный полимерный слой очень тонок, ЭОП уменьшается незначительно и стенка капилляра экранируется не полностью. Применимость. Капилляры с поли(метилглутаматовым) (ПМГ) покрытием пригодны для разделения белков. Кроме того, ими можно разделять комплексные смеси ферментов (рис 71). Рис.70. Разделение стандартных белков в капилляре, покрытом ПЭИ. Буфер: 20 мМ гидроксиламин/HCl, рН 7,0: пробы: 1 -мезицилоксид. 2 - миоглобин кита, 3 - БСА, 4 - хямотрипси-моген А крупного рогатого скота, 5 - цитохром С лошади, 6 - лизоцим. 9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ. Еще на начальной стадии развития в КЭ было предложено использовать капилляры с нанесенными полимерами, применяемые в ГХ. При этом преследовалась цель регулировать ЭОП в МЭКХ с помощью капилляров, покрытых полиметилсилоксаном (ПМС) или ПЭГ. Рис. 71. Разделение целлюлозного комплекса ферментов в капилляре с ПМГ- покрытием. Буфер: ЗОмМ фосфат, рН 7,0. При использовании неполярного ПМС-покрытия в МЭКХ с ДДСН в качестве мицеллообразователя ЭОП возрастает по сравнению с использованием необработанного капилляра. Это приводит к более коротким временам анализа, но одновременно с этим и к меньшим площадям пиков. Увеличение электроосмоса можно объяснить адсорбцией молекул ПАВ на гидрофобной поверхности и, как следствие, повышением ^-потенциала. В случае полиэтиленгликолевого покрытия наблюдается обратный эффект, т.е. меньшая скорость потока, большие времена анализа и большие площади пиков. Это значит, что такое покрытие экранирует поверхностные силанольные группы, однако, вследствие гидрофильного характера ПЭГ-цепочек, дополнительной адсорбции ДДСН не происходит. Областью применения таких капил- ляров является разделение фенолов и производных нитробензола, в частности, 79 производного пурина и циклических оснований. 9.4. Выводы Применение кварцевых капилляров с покрытием для КЭ описаны в последние годы многими авторами. Однако до настоящего времени коммерчески доступны капилляры только с очень ограниченным числом типов покрытий: 1. Applied Biosistems (Foster City, California) предлагают катионные реагенты, которые дают положительно заряженные покрытия и, тем самым, приводят к обращению направления ЭОП. Этими покрытиями также заметно понижаются взаимодействия белков со стенками капилляров при значениях рН ниже их изоэлектрической точки. 2. BioRad (Hercules, California) предлагают капилляры, модифицированные гидрофильными покрытиями. Тем самым, как ЭОП. так и адсорбция биомолекул уменьшаются. 3. Supeico, Inc. (Bellefonte, Pennsylvania) предлагает различные связанные фазы. Тем самым, кроме уменьшения адсорбции белков должно обеспечиваться постоянство ЭОП в области рН от 3 до 10. Предлагаемыми к продаже фазами являются: нейтральные гидрофильные, слабо гидрофобные фазы С1, гидрофобные фазы С8 и сильно гидрофобные фазы С18. 4. Isco, Inc. (Lincoln, Nebraska) предлагает три фазы для покрытий: ковалентно связанную фазу С18 (белки), глицериновое покрытие (белки, пептиды) и сульфокислотное покрытие (нуклеотиды). 5. Коммерчески доступны также капилляры с различными полимерными покрытиями для применения в ГХ. Тот факт, что в торговле других предложений нет, показывает, что многие покрытия не соответствуют требованиям рутинных аналитических измерений. Так, получаемые обычными способами слои на стенках капилляров являются прежде всего гидролитически нестабильными, тем более, что в КЭ многие разделения проходят в среде сильных оснований. Кроме того, экранирование активных адсорбционных центров на стенках капилляров является в большинстве случаев неполным, так что их применение для разделения белков достаточно условно. Полимерные покрытая проявляют себя в последнем случае лучше, однако, как показывают опыты по разделению белков, и здесь при рН>9 не обеспечивается гидролитическая стабильность. Что касается разделения биомолекул, то ни одно из известных покрытий не позволяет одинаково хорошо разделять сильно различающиеся пробы (белков). Поэтому цель дальнейших исследований в этой области должна заключаться в получении более стабильных и универсальных покрытий. В таблице 25 проведено сопоставление различных свойств модифицированных и немодифицированных капилляров. Таблица 25. Сравнение покрытых и непокрытых капилляров для применения в КЭ. Непокрытые капилляры Капилляры с покрытием 1. Катоднонаправленный электроосмос 1. Управление электроосмосом (направление,величина) 2. Проблемы с воспроизводимостью ЭОП 2. Лучшая воспроизводимость ЭОП (гистерезис при изменении рН) (меньший гистерезис) 3. Сильная адсорбция биомолекул (необходима работа с добавками к буферам) 3. Пассивация стенки капилляра по отношению к молекулам пробы (уменьшение адсорбции на стенках) 4. Необходимо тщательное приготовление буфера 4. Проблемы с воспроизводимостью приготовления и долговременной стабильностью покрытий 80 10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография В КЗЭ нейтральные пробы достигают детектора вместе с катионами и анионами и не могут быть разделены. Метод МЭКХ, предложенный Терабе и др. в 1984 году, позволяет разделять незаряженные компоненты пробы за счет различной вероятности нахождения их в водной подвижной и псевдостационарной фазах. С помощью добавок детергентов к буферу при превышении ККМ образуются мицеллы. Эти мицеллы носят гидрофобный характер внутри и заряжены снаружи, чем и достигается электрофоретическая подвижность в электрическом поле. В зависимости от знака заряда эта электрофоретическая подвижность направлена в сторону катода или анода. МЭКХ может быть реализована в той же аппаратуре, что КЗЭ и требует лишь добавок детергента. Наиболее часто в качестве детергента применяют ДДСН. Получаемые мицеллы имеют отрицательный заряд и, как следствие, приобретают электрофоретическую подвижность в направлении анода. По аналогии с КЗЭ эффективная скорость перемещения компонентов пробы, так же, как и мицелл, представляет собой векторную сумму электрофоретической и электроосмотической скоростей. На рис. 71 представлена схема разделения посредством МЭКХ. Речь идет о наиболее часто встречающемся случае, когда анионный детергент растворен в нейтральном или щелочном буфере. ЭОП направлен в сторону катода. Если вклад электрофоретической подвижности мицелл меньше вклада электроосмотической подвижности, то мицеллы движутся в сторону катода, т.е. в сторону детектора. Полярные молекулы, которые задерживаются только в водной фазе, движутся со скоростью электроосмотического потока и, спустя "мертвое" время, достигают детектора. Сильно гидрофобные молекулы пробы задерживаются прежде всего внутри мицелл и движутся со скоростью мицеллы. Следовательно, задержанные молекулы пробы появляются в детекторе в отрезок времени между to и tмс. Получаемое разделение нейтральных веществ основано на их различном распределении между буферным раствором и внутренней частью мицелл. Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуют с псевдостационарной фазой, точность метода МЭКХ соответствует точности обычного хроматографического метода. Значение к', по аналогии с хроматографией, можно определить как соотношение между числом молекул пробы в подвижной (n aq ) и стационарной (n mc ) фазах: k'= (n mc ) / (n aq ) С учетом того, что стационарная фаза подвижна, для значения V:' получим: k'=(t R -to)/{to(1-t R /t MC )} В отличие от ВЭЖХ, в данном случае через детектор могут проходить также молекулы пробы с бесконечными значениями k'. В этом случае молекулы пробы задерживаются исключительно внутри мицелл. Влияние распределения ионов пробы между псевдостационарной фазой и буфером на разделение смеси веществ представлено на рис.73. При постоянном Дк' расстояния между пиками с ростом значения k' уменьшаются. Для вычисления k' необходимо знать to и tмс. Однако для МЭКХ не существует идеального маркера. Маркер для to должен быть электрически нейтральным и полностью свободным от мицелл. В качестве инертных маркеров подходят, например, ацетон; формамид или метанол, взаимодействием которых с мицеллами можно пренеб- речь и которые движутся со скоростью ЭОП. В дальнейшем эти вещества можно детектировать с помощью УФ-поглощения или изменения показателя преломления как пик показателя преломления. 81 Рис. 72. Механизм разделения в МЭКХ Труднее определить скорость движения мицелл. В качестве маркера для (мс находят применение такие водорастворимые соединения, которые задерживаются только внутри мицелл, например, судан III и судан IV. Область применения метода МЭКХ не ограничивается только разделением нейтральных веществ, им можно разделять и заряженные пробы. Распределение веществ между водной и мицеллярной фазами может приводить к росту селективности и воздействовать тем самым на разделение ионов с очень схожими электрофоретическими подвижностями. В этих случаях разрешение пиков, достигаемое методом МЭКХ, перекрывает разрешение КЗЭ. Для МЭКХ необходимы ионные детергенты. Многие детергенты можно приобрести в торговле, однако только немногие из них пригодны в качестве добавок в МЭКХ. Для того, чтобы детергент подходил к МЭКХ, он должен отвечать следующим требованиям: -растворимость в соответствующем буфере должна быть достаточно высокой (> ККМ), чтобы могли образоваться мицеллы; - мицеллярный раствор должен быть гомогенным и УФ-прозрачным; - мицеллярный раствор должен обладать невысокой вязкостью. В МЭКХ могут применяться как анионные, так и катионные детергенты. Однако наиболее распространены анионные детергенты. Наиболее часто применяется, как уже отмечалось, ДДСН. Меньше подходят гомологи ДДСН. Так, например, расвор децилсульфата натрия с необходимой концентрацией (50 мМ) обладает высокой электропроводностью, что увеличивает поток и, как следствие, возникают проблемы с джоулевым теплом. Тетрадецилсульфат натрия обладает при комнатных температурах слишком малой растворимостью, что ограничивает его применение только высокими температурами. В общем случае сульфаты и сульфонаты предпочтительнее карбоксилатов, поскольку они сохраняют постоянную часть заряда в широкой области рН. В таблице 26 приведены некоторые детергенты со своими КМК и числами агрегирования. Величина ККМ представляет собой минимальную концентрацию детергента, необходимую для образования мицеллы. Под числом агрегирования понимают число молекул детергента, укладываемых по диаметру мицеллы. Данные относятся к чистой воде. В буферном растворе значения ККМ ниже, а числа агрегирования больше. В качестве катионных детергентов в основном находят применение аммонийные соли с гидрофобными алкильными цепочками. |