Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 94. Разделение поли(уридин- 5'фосфата). УСЛОВИЯ разделения: L=45, E=300 В/см, буфер: O.I M Тряс, 0.25 М борная кислота, 7М мочевина, 6% Т, 5"/о С, полиакриламид, детектирование при 260 нм. 12.1.2. Линейные полиакриамидные цепи. Вышеописанные проблемы в основном преодолеваются при применении в капиллярах несшитых гелей. Свойства этих гелей при их использовании в капиллярах сильно зависят от концентрации мономера. В таблице 29 приведены свойства и 99 основные области применения несшитых полиакриламидных гелей. Таблица 29. Области применения и свойства линейных полиакриламидных гелей различной концентрации. Чистые акриламидные гели (Линейные, не поперечносшитые полиакриламидные гели) Концентрация мономера (об. % Т) Свойства Область применения 0-6 Жидкий. Замена после каждого анализа Остаточные фрагменты ДНК Высоковязкий (еще летучий) Остаточные фрагменты ДНК 6 -9 Замена под высоким давлением после каждого анализа Анализ последовательности нук- леотидов в ДНК Олигонуклеотиды ДДСН-белковые комплексы 9- 12 Желати мообразный жесткий гель, уже нетекучий Анализ последовательности ДНК Олигонуклеотиды ДДСН-белковые комплексы При низких концентрациях мономера акриламида уже нельзя говорить о геле в обычном смысле этого слова, поскольку до концентрации примерно 4% Т имеет место только жидкий, хорошо текучий высокомолекулярный раствор полимера. Эти полимерные растворы можно назвать также "жидкими гелями", "полимерными матрицами" или "буфером с ситовыми свойствами". Такие растворы можно вводить в капилляр под давлением, под которым они находятся в сосуде с буфером. Это делает возможной легкую замену "жидких гелей" в капилляре после каждого анализа. Тем самым, перед каждым разделением будет иметься в распоряжении свежая, ненапряженная разделительная матрица, что отражается положительно на стабильности метода и результатах анализа. Таким образом, в данном случае обра- зование пузырей и высыхание капилляра исключаются. Это показано на рис. 95, где приведены данные после 400 анализов, показывающие, что капилляр все еще работоспособен. Для достижения высокой эффективности и селективности и в этом случае следует останавливать ЭОП. Любой поток внутри капилляра уменьшает эффективность разделения. Следует также упомянуть, что в случае применения этих гелей возможна также работа с капиллярами без покрытия. В общем случае разрешение будет хуже, причем разделение начинается при достаточно высоких ММ. В покрытых капиллярах разделяются вещества с достаточно длинными цепочками. Рис. 95. Тест на стабильность капилляра, покрытого линейным по- лиакриламидом (ЛПА). Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см, температура 30 0 С, 3% Т, 100 0% С, ЛПА, 0.1 М ТВЕ, рН 8.3. Проба: Phi Х 174 RFДНК Нае III; А - 1-ый, В - 144-ый, С - 344-ый, D - 420-ый опыты. На рис. 96 показано разделение остаточных фрагментов в капилляре, покрытом линейным гелем (3% Т, 0% С). Поскольку все фрагменты присутствуют в эквимолярных соотношениях, но большие фрагменты обладают большим числом адсорбционных центров, с ростом длины цепочек растет и площадь пиков. По этой причине маленькие фрагменты дают маленькие пики и, вследствие малого сопротивления миграции в геле, на фореграммах проявляются в первую очередь. Нумерация фрагментов ДНК в данном случае проводилась в предположении роста молекулярных размеров. Число ступеней разделения здесь равно примерно 600 тысячам теоретических тарелок на метр. При таких высоких числах ступеней разделения капилляры желательно располагать в горизонтальном положении, поскольку поворот капилляра может привести к потере эффективности. Эти потери эффективности, зависящие от расположения капилляра, наблюдаются в КЭ при очень высоких эффективностях ( > 1 млн. теоретических тарелок). Рис. 96. Разделение остаточных фрагментов ДНК в капилляре, покрытом ЛПА. Условия разделения: L=40/47см, Е= 150 В/см, 1=50 0 С. Буфер: 0.1 М ТВЕ, рН 8.3, 3% Т, 0% С ЛПА, пробы: pBR 322 MSP I, pBR 322 Hae III, детектирование: 254 нм. Большое влияние на селективность и эффективность оказывает также температура. Вообще эффективность падает с ростом температуры, однако для фрагментов некоторых размеров может достигаться лучшее разрешение, что обусловлено улучшающейся селективностью. Влияние температуры, напряженности поля, пористой структуры геля и буферных добавок на селективность и последовательность миграции анализируемых веществ будет рассматриваться в дальнейшем при обсуждении моделей миграции. В случае более высоких концентраций мономера растворы полимера становятся высоковязкими, поэтому начиная с концентрации 8% их следует полимеризовать в капилляре. Селективность этих высокомолекулярных линейных гелей (например 12% Т) схожа с селективностью поперечносшитых гелей, которые всегда следует полимеризовать в капиллярах. Поскольку, однако, в таких гелях не образуются ковалентные связи цепочек между собой, а также со стенками капилляров, сильное напряжение геля не приводит к разрушению его структуры. Эта незафиксированность цепочек в геле придает полимеру большую гибкость и, вследствие этого, повышает его продолжительность жизни. На рис. 97 представлено разделение олигонуклеотидного стандарта в покрытом капилляре, 101 заполненном 12% Т ЛПА. Рис. 97. Разделение смеси полидеоксиаденозииа (pd (A) 40-60) с олигонуклеотидами в капилляре, заполненном гелем 12 % Т, 0% С . Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/ см; буфер: 0.1 М ТВЕ, 7 М мочевина, рН 8.3. Эти гели находят применение также в определении последовательности нуклеотидов в ДНК, причем для детектирования в данном случае применяют лазерно- индуцируемую флуоресценцию. Гели непроницаемы для УФ-лучей с длиной волны меньше 250 нм. Кроме того, поскольку в распоряжении имеются очень малые пробы, в данном случае требуется очень высокая чувствительность детектора. Граница определения в данном случае составляет примерно 10 -11 М. 12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН КГЭ применялся почти исключительно для разделения молекул ДНК, поскольку чувствительное определение белков в гельзаполненных капиллярах невозможно из-за поглощения самого полиакриламида в области относительно коротких УФ-лучей (<250 нм). Взаимодействия белков с гелями также могут играть определенную роль, так что до настоящего времени в гельзаполненных капиллярах описано только успешное разделение белков, денатурированных ДДСН. Обычно белки соответственно своим значениям р1 обладают различным зарядом молекул, на этом основано их разделение при применении нормальных буферных систем в условиях, исключающих денатурацию. Для достижения разделения по ММ белки должны обладать одинаковым отношением заряда к поверхности. В этом случае возможно разделение в геле по молекулярным размерам или ММ. Белки полностью денатурируются в избытке ДДСН и 2-меркаптоэтанола (разрушение бисульфидных мостиков). Возникающие цепочки полипептидов связывают независимо от своих размеров и структуры постоянное количество ДДСН (1,4 г ДДСН/1 г белка). Поскольку ДДСН гасит заряды белково-детергентных комплексов, все белки, обработанные таким способом, будут иметь одинаковые соотношения зарядов на единицу массы. Из этого следует, что подвижность в буферной среде без "ситовых свойств" будет однородна. Если использовать теперь гель, то измеряемая подвижность анализируемых веществ будет пропорциональна эффективным ионным радиусам и, следовательно, ММ этих веществ (цепочек полипептидов). Из линейной зависимости между логарифмом ММ и временем миграции можно определить ММ белка. На рис. 98 показано разделение ДДСН белкового стандарта с высокой ММ. Таким образом, полиакриламидный гелевый электрофорез с ДДСН представляет собой метод, альтернативный методу ИЭФ и применяется также в классическом 20- электрофорезе (ИЭФ, совмещенный с ДДСН-ПААГ-электрофорезом) в качестве высокоразрешающего способа разделения. 102 Рис. 98. Разделение белков большой ММ в поперечносшитом полиакриламидным геле. Условия разделения: L=20 см (эффективная), Е=180 В/см, буфер: 0.12 М Трис, 0.12 М гистидин, рН 8.8, 0.1 МДДСН, 1% 2-пропанол, 5% Т, 1% С, полиакриламид. Проба: 1 - овальбумин, 2 - альбумин крупного рогатого скота, 3 - бета-галактозидаза, 4 - миозин. 12.2. Гепи на основе пописахаридов и других полимеров В КГЭ в качестве разделяющей среды наряду с полиакриламидными гелями применяют ряд других водорастворимых полимеров. В таблице 30 приведены используемые до настоящего времени полимеры и основные области их применения. Таблица 30. Полимеры, применяемые наряду с акриламидами для разделения в КГЭ. Типы гелей Используемые материалы Применение Агарозные гели Агароза (в широких пределах) Остаточные фрагменты ДНК (до 1300 основных пар), ДДСН- белковые комплексы Гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ) (SeaPlaque, SeaPrep) (различные концентрации) Остаточные фрагменты ДНК (до -12000 основных пар) Целлюлозные гели Метилцеллюлоза (0,5 %) Остаточные фрагменты ДНК (до -20000 основных пар) Декстраны Декстраны различной концентрации (ММ 10000- 2000000) ДДСН-белковые комплексы ПЭГ ПЭГ различной концентрации (ММ 1000000) ДДСН-белковые комплексы Основным преимуществом этих разделительных матриц является их УФ- проницаемость в области длин волн ниже 260 нм. Низкая токсичность этих полимеров по сравнению с мономером акриламидом упрощает работу с этими растворами и их хранение. К тому же эти полимеры при применяемых концентрациях менее вязки, так что может проводиться их замена после каждого анализа. Однако, для некоторых длин ДНК они дают меньшую разрешающую способность, чем акриламидные гели. Эти гели 103 очень выгодно применять для разделения ДДСН-белковых комплексов, т.к. в данном случае их можно детектировать с большой чувствительностью при относительно коротких длинах волн (214 нм). В этом случае следует дополнительно оптимизировать выбор некоторых буферных сред, не поглощающих в УФ-области На рис. 99 представлено разделение стандартного ДДСН-белкового комплекса в растворе декстрана, прозрачном по отношению к УФ-лучам. Три разделения показывают воспроизводимость при замене полимерных растворов в капилляре. Различия между этими полимерными матрицами заключаются в основном в пористой структуре. Размеры пор и упругость встроенных в гель полимерных цепочек оказывают значительное влияние на работоспособность при разделении по молекулярным размерам. На рис. 100 представлена структура агарозного геля и ее формирование из мономерных волокон (слева). Гидроксиэтилагароза (рис. 100, справа) обладает сильно измененной структурой. Образование сдвоенной структуры приводит к сужению пор, и такой гель лучше применять для биополимеров с меньшими размерами. РИС . 99. Разделение ДДСН- бедковых комплексов и стабильность капилляра при замене декстранового полимерного раствора. Условия разделения: L=30 см (эффективная), Е=300 В/см, буфер: 0.06 М 2-амино- 2метил=1-3- пропандиод/какодидовая кислота, рН 8.8, 0.1% ДДСН, об. 10% декстраи (ММ 2000000), детектирование: 214 им. Рис. 100. Формирование агарозного геля и образование сдвоенной структуры. Слева - регулярная агароза, справа - гидрокси-этилагароза. 12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах Поскольку подвижности молекул ДНК различных размеров в свободных растворах из-за одинаковых соотношений поверхность/заряд не различаются, разделение по молекулярным размерам может не достигаться. Это делает необходимым применять среду с ситовыми свойствами. Ситовые свойства в простейшем смысле описываются взаимодействиями молекул анализируемых веществ с волокнами разделяющего полимера (геля). В зависимости от размеров пор и длин биополимеров между полимерными волокнами имеют место различные конформации анализируемых веществ. Эти конформации отвечают за различные подвижности и возникающие нерегулярности. 104 Ясно, что молекулы в компактной или разреженной конформациях обладают подвижностью, отличной, например, от подвижности молекул вытянутой формы. Конформации можно наблюдать с помощью лазерной флуоресцентной микроскопии. Для различных взаимодействий молекул ДНК обсуждаются различные механизмы разделения. Сила взаимодействия с полимерной матрицей больше для больших молекул ДНК, на этом и основано разделение по молекулярным размерам. В зависимости от конформации и размеров молекул анализируемых веществ (биополимеров), а также от пористой структуры полимерного раствора (геля) можно придти к различным механизмам разделения. Как правило, для подвижности анализируемых веществ в разделяющем полимере находят зависимость от размеров молекул анализируемых веществ. Такая зависимость показана на рис. 101. Рис. 101. Зависимость логарифма подвижности анализируемых ве- ществ от логарифма длины сегментов этих вешеств при по- стоянном размере пор разделяющей матрицы. Здесь можно выделить 4 области: A) В начальной области кривой подвижность изменяется слабо с ростом длины анализируемых веществ, т.е. для маленьких фрагментов селективность невысока. В этой области, называемой областью Огстона, размеры пор геля больше, чем размеры самих молекул, которые без заметного сопротивления проходят через гель. При этом молекулы могут сохранять свою глобулярную структуру. Это является причиной низкой селективности в данной области размеров молекул анализируемых веществ. B) В так называемой области рептации имеет место большое изменение подвижности анализируемых веществ с ростом длины их цепочек и, тем самым, высокая селективность. В этой области молекулы анализируемых веществ больше, чем поры геля, так что молекула может проникнуть в поры только в вытянутом состоянии, огибая в "змеевидном" движении волокна гелевой матрицы (рептация). Таким образом, могут возникнуть сильные взаимодействия анализируемых веществ с матрицей геля, что приводит к появлению максимума селективности. C) При средних длинах цепочек анализируемых веществ достигается минимум подвижности. Это объясняется тем, что оба конца молекулы движутся в одном направлении и сильно переплетаются с волокнами разделяющего полимера (ловушка). Это приводит впоследствии к уже независящей от размеров молекул подвижности (аномальная миграция и даже инверсия) . Однако это переплетение для маленьких молекул не играет существенной роли, т.к. они могут быстро освободиться от такой конформации. Для больших молекул вероятность выхода из такого состояния очень мала. D) В последней области при очень больших длинах молекул различия анализируемых веществ относительно их размеров становятся все меньше, что приводит в дальнейшем к отсутствию различий в подвижностях. Как видно из рис. 102, экспериментально полученные зависимости согласуются с теорией. Однако, было обнаружено, что сильное влияние на правильную последовательность миграции (маленькие молекулы перед большими) и подвижность анализируемых веществ оказывают также температура, сила поля и концентрация геля. В экстремальных случаях может наблюдаться инверсия последовательности миграции, т.е. более длинные фрагменты ДНК движутся сквозь разделяющий гель быстрее, чем меньшие фрагменты ДНК. Это нежелательное явление можно в общем случае 105 устранить следующими способами: - уменьшением напряжения налагаемого поля, -повышением температуры в системе, -уменьшением концентрации геля, -буферными добавками. Качественно нелинейность подвижности можно описать также моделью рептации: ( ) [ ] ( ) ( ) 3 / / 1 3 / 2 + + = T k qE N f Q b a µ Здесь µ - подвижность биополимера, Q - общий заряд молекулы, f - коэффициент трения между волокнами геля и полимером, N- число сегментов биополимера (число основных пар), q - заряд на величину N, Е - сила поля, а - длина поры геля, Т - температура и Кь - константа Больцмана. Из этого уравнения видно, что подвижность обратно пропорциональна длине цепочки только в том случае, когда второй член пренебрежимо мал. Это бывает только при работе с относительно слабыми полями (<200 В/см). Согласно этому соотношению следует работать при повышенных температурах, что также подтверждается на практике. Рис. 102. Зависимость между подвижностями смеси остаточных фрагментов ДНК и числом основных пар в логарифмическом масштабе. Условия разделения: L=40/47 см, буфер: 0.1 М ТВЕ, рН 8.3, 3% Т, 0% С, ЛПА, различные температуры и силы поля (указаны на рисунке). В зависимости от размеров пор геля и длины биополимера наблюдается различная конформация анализируемых веществ между волокнами полимера. Эти конформации в конце концов ответственны за различную подвижность и наблюдаемые нерегулярности. Ясно, что компактная или напряженная конформация вызовет подвижность, от- личающуюся, например, от подвижности для вытянутой формы. Конформации, показанные на рис. 103, можно наблюдать методом лазерной флуоресцентной микроскопии. Вышеупомянутые модели миграции описывают и объясняют все наблюдаемые картины и аномалии. С помощью этих моделей можно также объяснить причины нелинейности между последовательностью миграции и размерами молекул и устранить их. |